CN117247891B - 三七愈伤组织培养及其毛状根诱导方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种三七愈伤组织培养及其毛状根诱导方法，属于植物组培技术领域。该方法包括外植体的处理、愈伤组织诱导培养、菌液制备和共培养几大步骤。以ArA4载体的农杆菌作为毛状根诱导的菌株，以选择三七茎杆诱导产生且培养得到的绿色胚性愈伤组织为研究对象，通过遗传转化试验，经50‑60d时间的试验，诱导出的三七根状植物组织，PCR验证确定本试验诱导出的三七根状植物组织，即为以ArA4菌株通过遗传转化诱导出的三七毛状根。本发明所获得的结果为三七基因功能验证，即三七皂苷合成通路探究提供试验基础和理论依据。

Description

三七愈伤组织培养及其毛状根诱导方法

技术领域

本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种三七愈伤组织培养及其毛状根诱导方法。

背景技术

三七(Panax notoginseng)，为五加科珍稀药用植物，是我国最早发现并使用的一种古老中药材，是我国特有的名贵传统中药材，是药用植物资源宝库中的一颗明珠。三七味辛、微苦、性温，整株都可以作为药材使用，但一般入药都是用其干燥的根和根茎。三七还是中药“云南白药”和“片仔黄”的主要原料。三七由于其特殊性，越来越受到人们的关注，加上三七作为植物类药材正日益受到人们的欢迎和青睐。与此同时，与脑血管疾病相关的产品层见叠出，在多个行业中三七的需求和用量都不断地攀升，导致三七市场供应不足。并且三七主要依靠人工种植栽培，在生长发育期间不仅容易受病害、虫害、重金属等因素的影响，还容易受自然环境、生态气候、可耕作面积、选地等因素的影响，使栽培受到一定的限制，进一步制约着三七市场的供应。三七对生长条件要求较苛刻，喜温暖而阴湿的环境，怕严寒和酷暑，土壤以微酸性疏松的沙质黑壤土最佳，也畏多水，需要保证一定的倾斜度，否则在低洼地种植易发生根腐病。三七主要产地是我国云南，在广西、贵州、广东、四川等地，云南三七又以种于文山的三七为主。在三七以往的种植模式中，生长时间比较长，一般要种植三到七年才可以挖采。在三七传统种植产业中，优良种苗匮乏，抵抗不良环境的能力弱，引起严重的病虫害，不宜种植，即使能存活也存在着品质差，产量低的难题。面对这些难题，三七胚性愈伤组织诱导和毛状根诱导技术的出现就为三七产量的提高提供了新的途径，在这种新的途径下，不仅能避免了这些问题，还对三七种质资源的保护与利用、优质种苗生产和提供、次生代谢物质获取等方面有着极大的作用。

三七具有很好的药理作用，药理作用主要体现在对血液、心血管、脑血管等系统的影响，具有活血化瘀、活血定痛的功效。主治跌打损伤、淤血肿痛。花、叶亦有清热之效。三七总皂苷是三七的主要有效成分。目前，人参属中三七分离和鉴定出的皂苷主要是达玛烷型皂苷。同时含有丰富的三七素、糖类、氨基酸等成分。三七总皂苷是人参属植物中广泛存在的活性物质，许多皂苷被证实具有多种重要药理作用，也是目前研究较为系统的化学物质。

三七总皂苷主要由三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1构成。其作用如下：

(1)对高脂血症的影响。能降低胆固醇、甘油三酯等的浓度，使患者的血脂尽量控制在正常范围。

(2)对高粘滞度的影响。能显著降低血液粘滞因子，抑制血液中红细胞聚集，增大细胞间的间隙和距离，使循环阻力减小。

(3)对高血压的影响。能控制血压，降低心脑血管的发生率。

(4)抗心肌缺血作用。可显著改善心肌供血，提高供氧量。

(5)抗动脉粥样硬化作用。可以缓解心悸、气促、呼吸困难等症状，对动脉粥样硬化的发生发展具有一定的预防和治疗作用。

(6)抗血栓作用。能减少白细胞的积聚，降低血管中的异常凝块的数量，避免堵塞血管。

(7)抗心脑缺血的作用。能改善心脑供血，减少血小板聚集，避免引起脑梗死、痴呆、心肌梗死等疾病。

(8)维持造血细胞数量的作用。促进分化成各种粒细胞，维持造血干细胞数量的稳定。

(9)抗肿瘤的作用。可直接攻击肿瘤细胞，遏制肿瘤细胞生长或转移等方式起到抗肿瘤作用。

(10)抗纤维化的作用。减少器官组织中纤维结缔组织的数量和胶原蛋白的分泌，维持人体的健康。

植物体受到伤害后，在伤口上重新长出的组织，即为愈伤组织。具有再生植株的能力。张铁等人以三七苗的叶、叶柄、带部分也的叶柄等为外植体，在0.5mg/L6-BA及不同浓度的2,4-D下均能诱导出愈伤组织。单昌蓉等人用不同的升汞溶液对三七成熟种子进行不同时长的灭菌处理，诱导培养无菌实生苗，在此基础上，进一步诱导三七愈伤组织，初步建立三七优良品种的无菌实生苗体系。许伽欢发现有秋水仙素可以对三七愈伤组织的倍性诱导有影响。石燕碧等人发现用三七愈伤组织能缩短重楼种子萌发的时间。三七组培技术已有一些运用，但也存在一定的局限性。有两个方面的原因：第一，三七的基因文库比较大，约3.5-3.6G左右，遗传稳定性较低；第二，三七个体间差异性比较大。不同品种间，相同品种间都有着很大差异等。这些原因导致三七组培试验成功率受影响，因此三七组织培养技术还需进一步的探索和发展。

硅元素对植物的生命历程起着巨大作用。具体作用如下：

(1)提高植物光能利用率

许多植物都需要进行光和作用为自己提供所需的能量。而硅元素最大的作用就是能够增强植物的光合能力，提高光能利用率。在光合效率提高的基础上，从而使营养物质得以积累。

(2)增强根茎活力

有些植物处于厌氧环境下会产生有害物质，使植物的生长受到影响。硅元素能增强植物根茎的活力，加速植物系统的循环吸收，使植物尽可能地进行有氧呼吸，避免有害物质的产生。

(3)增强植物抗性

硅元素还能增强植物的茎秆强度，减少风害、雪害等自然灾害的影响，提高植物抵抗外界不良环境的能力。减少病虫害的发生，提高抗病力，以达到增强植物抗性的目的。

(4)提高作物产量

有些植物对硅肥的需求量非常大，合理施用硅肥不仅对提高植物产量有着巨大帮助，还可以提高植物的品质。

毛状根可以利用发根农杆菌侵染植物得到。发根农杆菌是根瘤科农杆菌属的一类革兰氏阴性土壤农杆菌。农杆菌能通过Ri质粒把rol基因转移到宿主体内诱导毛状根，并可以将T外源基因整合到基因组中，实现转化。在植物工程中，可以利用农杆菌介导的DNA传递系统和各种作物物种中的直接DNA转移方法，转基因植物的开发和生产以及在市场上的释放取得了巨大进展。有了这项技术，构建具有新基因的生物成为可能。

发根农杆菌介导的毛状根培养物被认为是在实验室条件下产生植物次生代谢产物的替代来源。毛状根最大优点是具有生长快、易于大量培养、不需要外源激素、有效成分含量高、生理生化和遗传稳定性等特点。因此，这些根具有很大的工业化潜力。此外，很多植物的毛状根再生为具有正常育性的完整植株，并在传代培养和植株再生过程中保持其遗传稳定性。尽管发根农杆菌介导的转化有一些应用，但仍存在一定局限性。

现有技术中，人参属植物组培体系不成熟，且三七愈伤组织培养困难，培养时间长；目前，三七农杆菌遗传转化体系尚未见报道，这也是目前我们迫切需要解决的问题。毛状根作为一种转基因器官，三七中重要单体化合物生物合成与酶基因功能验证可以通过毛状根诱导获得。因此如何克服现有技术的不足是目前植物组培技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种三七愈伤组织培养及其毛状根诱导方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

三七愈伤组织培养及其毛状根诱导方法，包括如下步骤：

步骤(1)，外植体的处理：

选择生长状态好，无病虫害的新鲜一年生三七茎杆作为外植体，然后将外植体清洗干净并消毒灭菌，然后切成小段；

步骤(2)，愈伤组织诱导培养：

将步骤(1)得到的外植体小段接种至愈伤组织诱导培养基中，于25℃条件下进行暗培养至愈伤长出，然后再光照培养至愈伤长至0.5cm-1cm大小，得到愈伤组织；

所述的愈伤组织诱导培养基为FY4：1/2MS基础培养基+1mg/L BA+0.1mg/L IBA+15g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+2ml/L浓缩硅；

步骤(3)，菌液制备：

取ArA4发根农杆菌甘油菌在含有100mg/L卡那霉素的TY固体培养基表面划线并封口，在28℃条件下进行培养，将培养获得的单菌落接种至100mg/L卡那霉素的TY液体培养基，封口后在28℃下摇床培养，培养至OD值为0.4-0.8；然后菌液在4℃离心后取出，无菌环境下倒掉上清液，加入重悬液，重悬至OD值为0.6-0.8，最后加入乙酰丁香酮至终浓度为100μmol/L，混匀，得到重悬菌液；

所述的含有100mg/L卡那霉素的TY固体培养基为：5g/L酵母浸粉+3g/L蛋白胨+5g/L NaCl+100mg/L卡那霉素+8g/L琼脂；

所述的含有100mg/L卡那霉素的TY液体培养基为：5g/L酵母浸粉+3g/L蛋白胨+5g/L NaCl+100mg/L卡那霉素；

所述的重悬液为：MS基础培养基+10g/LD-葡萄糖+20g/L蔗糖，pH值为5.2；

步骤(4)，共培养：

将步骤(2)得到的愈伤组织切成小块，切面朝上转接入共培养培养基中，并将步骤(3)制得的重悬菌液加入到切面上，于28℃黑暗条件下共培养，待毛状根长出后剪切毛状根再进行扩繁培养；

所述的共培养培养基为：MS基础培养基+1mg/L BA+0.1mg/L IBA+15g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH值为5.8。

进一步，优选的是，步骤(1)中，将外植体清洗的具体方法为：

采用洗涤剂将外植体清洗，然后用流水冲洗30-60min，接着用0.5g/L的多菌灵浸泡20min，最后用水清洗干净；

消毒灭菌的具体方法为：

用75％酒精消毒30s，再使用0.1％氯化汞消毒8-10min，消毒完成后无菌水冲洗3-4次。

进一步，优选的是，步骤(1)中，外植体切成1.0-1.5cm小段。

进一步，优选的是，步骤(2)中，暗培养时间为30天；光照培养时，光照强度为1400-1600LX，光照培养时间为50-60天。

进一步，优选的是，步骤(3)中，摇床速度为200r/min；培养时间为8-12h；离心速度为4000r/min，离心的时间为12min。

进一步，优选的是，步骤(3)中，取上清液再次离心的具体参数为：以4000r/min转速、4℃下离心12min。

进一步，优选的是，步骤(4)中，将愈伤组织切成0.5cm×0.5cm的小块；共培养的培养时间为3-4天。

本发明采用的浓缩硅的厂家优选为东立信生物工程有限公司。

本发明以一年生三七苗为供试植物材料，进行愈伤组织的诱导。添加1ml/L、2ml/L和3ml/L浓缩硅的培养基都能诱导出胚性愈伤组织，结果表明，添加2mol/L的浓缩硅诱导出的胚性愈伤组织体积大、质量好、数量多，筛选出诱导三七胚性愈伤的最佳培养基配比，配方为FY4：1/2MS+1mg/L BA+0.1mg/L IB A+15g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+2ml/L浓缩硅。以ArA4载体的农杆菌作为毛状根诱导的菌株，以选择三七茎杆诱导产生且培养60天后的绿色胚性愈伤组织为研究对象，通过遗传转化试验，经50-60d时间的试验，诱导出的三七根状植物组织，PCR验证确定本试验诱导出的三七根状植物组织，即为以ArA4菌株通过遗传转化诱导出的三七毛状根。本发明所获得的结果为三七基因功能验证，即三七皂苷合成通路探究提供试验基础和理论依据。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

(1)本发明愈伤组织培养比较稳定，未出现褐化现象

(2)愈伤组织膨大速度快；

(3)ArA4发根农杆菌诱导三七毛状根未见报道；

(4)ArA4发根农杆菌诱导三七毛状根速度快且健康

(5)现有技术中，人参属植物组培体系不成熟，且三七愈伤组织培养困难，培养时间长；目前，三七农杆菌遗传转化体系尚未见报道，这也是目前我们迫切需要解决的问题，毛状根是利用发根农杆菌侵染植物细胞后产生的特殊的植物突变组织，具有遗传稳定、激素自养、生长速度快以及次级代谢强等优点。毛状根作为一种转基因器官，三七中重要单体化合物生物合成与酶基因功能验证可以通过毛状根诱导获得。

附图说明

图1为不同用量浓缩硅诱导下的三七茎段愈伤组织；其中，A为1mol/L浓缩硅诱导下的三七茎段愈伤组织；B为2mol/L浓缩硅诱导下的三七茎段愈伤组织；C为3mol/L浓缩硅诱导下的三七茎段愈伤组织；

图2为ArA4单菌落PCR验证；其中，M为maker；1为ArA4发根农杆菌Ri质粒特异性引物验证琼脂糖凝胶电泳条带；

图3为诱导出的毛状根生长状况；其中，(a)为一个诱导出的毛状根生长状况图；(a)为另一个诱导出的毛状根生长状况图；

图4为ArA4发根农杆菌诱导的三七毛状根DNA PCR验证；其中，M为maker；1为毛状根Ri质粒特异性引物验证琼脂糖凝胶电泳条带。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1

三七愈伤组织培养及其毛状根诱导方法，包括如下步骤：

步骤(1)，外植体的处理：

选择生长状态好，无病虫害的新鲜一年生三七茎杆作为外植体，然后将外植体清洗干净并消毒灭菌，然后切成小段；

步骤(2)，愈伤组织诱导培养：

将步骤(1)得到的外植体小段接种至愈伤组织诱导培养基中，于25℃条件下进行暗培养至愈伤长出，然后再光照培养至愈伤长至0.6cm-0.8cm大小，得到愈伤组织；

所述的愈伤组织诱导培养基为FY4：1/2MS基础培养基+1mg/L BA+0.1mg/L IBA+15g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+2ml/L浓缩硅；

步骤(3)，菌液制备：

取ArA4发根农杆菌甘油菌在含有100mg/L卡那霉素的TY固体培养基表面划线并封口，在28℃条件下进行培养，将培养获得的单菌落接种至100mg/L卡那霉素的TY液体培养基，封口后在28℃下摇床培养，培养至OD值为0.6；然后菌液在4℃离心后取出，无菌环境下倒掉上清液，加入重悬液，重悬至OD值为0.7，最后加入乙酰丁香酮至终浓度为100μmol/L，混匀，得到重悬菌液；

所述的含有100mg/L卡那霉素的TY固体培养基为：5g/L酵母浸粉+3g/L蛋白胨+5g/L NaCl+100mg/L卡那霉素+8g/L琼脂；

所述的含有100mg/L卡那霉素的TY液体培养基为：5g/L酵母浸粉+3g/L蛋白胨+5g/L NaCl+100mg/L卡那霉素；

所述的重悬液为：MS基础培养基+10g/LD-葡萄糖+20g/L蔗糖，pH值为5.2；

步骤(4)，共培养：

将步骤(2)得到的愈伤组织切成小块，切面朝上转接入共培养培养基中，并将步骤(3)制得的重悬菌液加入到切面上，于28℃黑暗条件下共培养，待毛状根长出后剪切毛状根再进行扩繁培养；

所述的共培养培养基为：MS基础培养基+1mg/L BA+0.1mg/L IBA+15g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH值为5.8。

实施例2

三七愈伤组织培养及其毛状根诱导方法，包括如下步骤：

步骤(1)，外植体的处理：

选择生长状态好，无病虫害的新鲜一年生三七茎杆作为外植体，然后将外植体清洗干净并消毒灭菌，然后切成小段；

步骤(2)，愈伤组织诱导培养：

将步骤(1)得到的外植体小段接种至愈伤组织诱导培养基中，于25℃条件下进行暗培养至愈伤长出，然后再光照培养至愈伤长至0.5cm-0.6cm大小，得到愈伤组织；

所述的愈伤组织诱导培养基为FY4：1/2MS基础培养基+1mg/L BA+0.1mg/L IBA+15g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+2ml/L浓缩硅；

步骤(3)，菌液制备：

取ArA4发根农杆菌甘油菌在含有100mg/L卡那霉素的TY固体培养基表面划线并封口，在28℃条件下进行培养，将培养获得的单菌落接种至100mg/L卡那霉素的TY液体培养基，封口后在28℃下摇床培养，培养至OD值为0.4；然后菌液在4℃离心后取出，无菌环境下倒掉上清液，加入重悬液，重悬至OD值为0.6，最后加入乙酰丁香酮至终浓度为100μmol/L，混匀，得到重悬菌液；

所述的含有100mg/L卡那霉素的TY固体培养基为：5g/L酵母浸粉+3g/L蛋白胨+5g/L NaCl+100mg/L卡那霉素+8g/L琼脂；

所述的含有100mg/L卡那霉素的TY液体培养基为：5g/L酵母浸粉+3g/L蛋白胨+5g/L NaCl+100mg/L卡那霉素；

所述的重悬液为：MS基础培养基+10g/LD-葡萄糖+20g/L蔗糖，pH值为5.2；

步骤(4)，共培养：

将步骤(2)得到的愈伤组织切成小块，切面朝上转接入共培养培养基中，并将步骤(3)制得的重悬菌液加入到切面上，于28℃黑暗条件下共培养3天，待毛状根长出后剪切毛状根再进行扩繁培养；

所述的共培养培养基为：MS基础培养基+1mg/L BA+0.1mg/L IBA+15g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH值为5.8。

步骤(1)中，将外植体清洗的具体方法为：

采用洗涤剂将外植体清洗，然后用流水冲洗30min，接着用0.5g/L的多菌灵浸泡20min，最后用水清洗干净；

消毒灭菌的具体方法为：

用75％酒精消毒30s，再使用0.1％氯化汞消毒8min，消毒完成后无菌水冲洗3次。

步骤(1)中，外植体切成1.0-1.2cm小段。

步骤(2)中，暗培养时间为30天；光照培养时，光照强度为1400-1500LX，光照培养时间为50天。

步骤(3)中，摇床速度为200r/min；培养时间为8h；离心速度为4000r/min，离心的时间为12min。

步骤(3)中，取上清液再次离心的具体参数为：以4000r/min转速、4℃下离心12min。

步骤(4)中，将愈伤组织切成0.5cm×0.5cm的小块；共培养的培养时间为3天。

实施例3

三七愈伤组织培养及其毛状根诱导方法，包括如下步骤：

步骤(1)，外植体的处理：

选择生长状态好，无病虫害的新鲜一年生三七茎杆作为外植体，然后将外植体清洗干净并消毒灭菌，然后切成小段；

步骤(2)，愈伤组织诱导培养：

将步骤(1)得到的外植体小段接种至愈伤组织诱导培养基中，于25℃条件下进行暗培养至愈伤长出，然后再光照培养至愈伤长至1cm大小，得到愈伤组织；

所述的愈伤组织诱导培养基为FY4：1/2MS基础培养基+1mg/L BA+0.1mg/L IBA+15g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+2ml/L浓缩硅；

步骤(3)，菌液制备：

取ArA4发根农杆菌甘油菌在含有100mg/L卡那霉素的TY固体培养基表面划线并封口，在28℃条件下进行培养，将培养获得的单菌落接种至100mg/L卡那霉素的TY液体培养基，封口后在28℃下摇床培养，培养至OD值为0.8；然后菌液在4℃离心后取出，无菌环境下倒掉上清液，加入重悬液，重悬至OD值为0.8，最后加入乙酰丁香酮至终浓度为100μmol/L，混匀，得到重悬菌液；

所述的含有100mg/L卡那霉素的TY固体培养基为：5g/L酵母浸粉+3g/L蛋白胨+5g/L NaCl+100mg/L卡那霉素+8g/L琼脂；

所述的含有100mg/L卡那霉素的TY液体培养基为：5g/L酵母浸粉+3g/L蛋白胨+5g/L NaCl+100mg/L卡那霉素；

所述的重悬液为：MS基础培养基+10g/LD-葡萄糖+20g/L蔗糖，pH值为5.2；

步骤(4)，共培养：

将步骤(2)得到的愈伤组织切成小块，切面朝上转接入共培养培养基中，并将步骤(3)制得的重悬菌液加入到切面上，于28℃黑暗条件下共培养，待毛状根长出后剪切毛状根再进行扩繁培养；

所述的共培养培养基为：MS基础培养基+1mg/L BA+0.1mg/L IBA+15g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH值为5.8。

步骤(1)中，将外植体清洗的具体方法为：

采用洗涤剂将外植体清洗，然后用流水冲洗60min，接着用0.5g/L的多菌灵浸泡20min，最后用水清洗干净；

消毒灭菌的具体方法为：

用75％酒精消毒30s，再使用0.1％氯化汞消毒10min，消毒完成后无菌水冲4次。

步骤(1)中，外植体切成1.4-1.5cm小段。

步骤(2)中，暗培养时间为30天；光照培养时，光照强度为1500-1600LX，光照培养时间为60天。

步骤(3)中，摇床速度为200r/min；培养时间为12h；离心速度为4000r/min，离心的时间为12min。

步骤(3)中，取上清液再次离心的具体参数为：以4000r/min转速、4℃下离心12min。

步骤(4)中，将愈伤组织切成0.5cm×0.5cm的小块；共培养的培养时间为4天。

实施例4

三七愈伤组织培养及其毛状根诱导方法，包括如下步骤：

步骤(1)，外植体的处理：

选择生长状态好，无病虫害的新鲜一年生三七茎杆作为外植体，然后将外植体清洗干净并消毒灭菌，然后切成小段；

步骤(2)，愈伤组织诱导培养：

将步骤(1)得到的外植体小段接种至愈伤组织诱导培养基中，于25℃条件下进行暗培养至愈伤长出，然后再光照培养至愈伤长至0.5cm-0.8cm大小，得到愈伤组织；

所述的愈伤组织诱导培养基为FY4：1/2MS基础培养基+1mg/L BA+0.1mg/L IBA+15g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+2ml/L浓缩硅；

步骤(3)，菌液制备：

取ArA4发根农杆菌甘油菌在含有100mg/L卡那霉素的TY固体培养基表面划线并封口，在28℃条件下进行培养，将培养获得的单菌落接种至100mg/L卡那霉素的TY液体培养基，封口后在28℃下摇床培养，培养至OD值为0.7；然后菌液在4℃离心后取出，无菌环境下倒掉上清液，加入重悬液，重悬至OD值为0.5，最后加入乙酰丁香酮至终浓度为100μmol/L，混匀，得到重悬菌液；

所述的含有100mg/L卡那霉素的TY固体培养基为：5g/L酵母浸粉+3g/L蛋白胨+5g/L NaCl+100mg/L卡那霉素+8g/L琼脂；

所述的含有100mg/L卡那霉素的TY液体培养基为：5g/L酵母浸粉+3g/L蛋白胨+5g/L NaCl+100mg/L卡那霉素；

所述的重悬液为：MS基础培养基+10g/LD-葡萄糖+20g/L蔗糖，pH值为5.2；

步骤(4)，共培养：

将步骤(2)得到的愈伤组织切成小块，切面朝上转接入共培养培养基中，并将步骤(3)制得的重悬菌液加入到切面上，于28℃黑暗条件下共培养，待毛状根长出后剪切毛状根再进行扩繁培养；

所述的共培养培养基为：MS基础培养基+1mg/L BA+0.1mg/L IBA+15g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH值为5.8。

步骤(1)中，将外植体清洗的具体方法为：

采用洗涤剂将外植体清洗，然后用流水冲洗40min，接着用0.5g/L的多菌灵浸泡20min，最后用水清洗干净；

消毒灭菌的具体方法为：

用75％酒精消毒30s，再使用0.1％氯化汞消毒9min，消毒完成后无菌水冲洗3次。

步骤(1)中，外植体切成1.2-1.4cm小段。

步骤(2)中，暗培养时间为30天；光照培养时，光照强度为1450-1550LX，光照培养时间为55天。

步骤(3)中，摇床速度为200r/min；培养时间为10h；离心速度为4000r/min，离心的时间为12min。

步骤(3)中，取上清液再次离心的具体参数为：以4000r/min转速、4℃下离心12min。

步骤(4)中，将愈伤组织切成0.5cm×0.5cm的小块；共培养的培养时间为3.5天。

应用实例

1 方法

1.1 外植体的处理

选择生长状态好，无病虫害的新鲜一年生三七茎杆作为外植体，用剪刀将其茎剪下。先去除茎杆表面的尘土，再用洗涤剂将剪下的茎杆清洗干净(优选，洗涤剂采用洗洁精)，然后用流水冲洗30-60min，接着用0.5g/L的多菌灵浸泡20min，最后用水清洗干净。

1.2培养基的选择及配制

选用FY4培养基作为基本培养基(FY4：1/2MS基础培养基+1mg/L BA+0.1mg/L IBA+15g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+2ml/L浓缩硅)。在配制培养基时按照培养基说明书称取适量培养基粉末，加入7.5g/L的琼脂，混合均匀后100mmol/L的HCl溶液调节pH至5.8，倒入1L的锥形瓶中，放入灭菌锅中120℃灭菌20min。滤纸和培养皿都经过灭菌处理。

把灭菌后的滤纸放进烘箱中烘干水汽待用，手能握住培养基时，将其装到灭过菌的培养皿中凝固至无水汽时，盖上盖子备用。

1.3外植体的接种

在超净工作台中，把处理的三七茎秆消毒灭菌，具体操作：用75％酒精消毒30s，再使用0.1％氯化汞消毒8-10min，消毒完成后无菌水冲洗3-4次，并在愈伤上用解剖刀划4-6个2-3mm长2-3mm深的伤口以便愈伤组织的生长。最后把切出来的茎段接种到MS培养基上，盖上盖子，用封口条封好后在皿面上写上品种名称、培养基名称和日期等标记。

1.4培养条件

培养皿封口后放置在黑暗培养箱，温度为25℃，用于诱导愈伤的外植体为：接种及培养条件均相同，加入不同用量浓缩硅培养的茎段，50-60d后观察结果和统计数据，以筛选出最佳浓缩硅用量。

1.5农杆菌的活化及PCR检验

本研究用的是TY液体培养基(不加琼脂)和TY固体培养基(更适宜本实验农杆菌的培养)，称取我们所需的培养基干粉，各用一升的蒸馏水溶解，倒入瓶中121℃高压灭菌20min。完成后，取出液体培养基，放凉，无菌环境下100mg/L的卡那霉素，摇匀待用。取出固体培养基，手可以握住时，在无菌环境下加入无菌环境下100mg/L的卡那霉素，摇匀，倒入一次性培养皿中，静置至凝固无水汽时收起待用。

所述的含有100mg/L卡那霉素的TY固体培养基为：酵母浸粉5g/L+蛋白胨3g/L+5g/L NaCl+100mg/L卡那霉素+8g/L琼脂；

所述的含有100mg/L卡那霉素的TY液体培养基为：酵母浸粉5g/L+蛋白胨3g/L+5g/L NaCl+100mg/L卡那霉素；

重悬液为MS基础培养基+10g/LD-葡萄糖+20g/L蔗糖。定容调pH值为5.2后，倒入1L的瓶子中115℃高温灭菌20min。

摇菌，在超净工作台中，配制TY固体培养基(含有100mg/L卡那霉素)，取ArA4发根农杆菌甘油菌在其表面划线并封口，在28℃条件下培养出近圆形的游离单菌落。在已灭菌的组培瓶中倒入50ml的含有100mg/L卡那霉素的TY液体培养基，取单菌落用无菌水稀释至10ul，取2ul PCR验证，验证后剩余8ul菌液加入含有100mg/L卡那霉素的TY液体培养基中，用封口膜把平板封上避免污染，封口后在28℃摇床200r/min培养8-12h，培养至OD值为0.4-0.8；

将菌液在4000r/min，4℃离心12min后取出，无菌环境下倒掉上清液，加入重悬液，重悬至OD值为0.6-0.8，最后加入乙酰丁香酮至终浓度为100μmol/L，混匀，得到重悬菌液；

1.6愈伤组织的侵染及共培养

用事前准备好的共培养培养基。共培养培养基配方为：MS基础培养基+1mg/L BA+0.1mg/L IBA+15g/L蔗糖+7.5g/L琼脂。配制所需量的培养基，定容，pH调节至5.8，倒入锥形瓶中，121℃高压灭菌20min，完成后，冷却至手可以握住时，在无菌环境下把其分倒入组培瓶中。完成后晾干备用。

将生长状况最好的一年生三七茎绿色愈伤组织(胚状体)作为侵染的外植体，将绿色愈伤组织(胚状体)放于已灭菌的滤纸上用解剖刀切成0.5cm×0.5cm的方块，使解剖面朝上转接入共培养培养基中，用移液枪吸取10ul重悬菌液进行侵染。

将侵染后的三七愈伤放到黑暗条件下28℃培养箱培养。待毛状根长出后剪切毛状根进行扩繁培养。

1.8毛状根的扩繁

将新长出5-6cm的毛状根剪掉转移到MS固体培养基上继续培养。

MS固体培养基：MS+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L，pH6.0。

2.0毛状根PCR验证

PCR扩增检验，根据ArA4的Ri质粒设计检车引物(800-850bp)正向引物为5’-TACTGCAGCAGGCTTCATGAC-3’，反向引物为5’-GCTTTCCCGACCAGAGACTG-3’，20ul扩增体系见表1，PCR反应程序见表1。PCR扩增产物电泳，采用两个未经处理的三七愈伤组织的DNA作为阴性对照，观察结果。

表1

试剂	体积
		2×Fast Taq Premix酶	10.0μL
正向引物	0.5μL
		反向引物	0.5μL
菌液	2μL
		ddH2O	7μL
总计	20.0μL

表2

2.1三七诱导愈伤组织最适宜浓缩硅用量筛选

从表3中可以得知，2ml/L和3ml/L浓缩硅的FY4培养基中的愈伤组织体积大、松散、长势好。但3ml/L的浓缩硅的愈伤组织，绿化情况较少，即以2ml/L为最适的浓缩硅浓度。说明加入不同用量浓缩硅的FY4培养基对愈伤组织的诱导有着极大的影响。

表3不同用量的浓缩硅对三七茎段愈伤组织诱导的影响

外植体	数量(块)	浓缩硅(ml/L)	出愈数(块)	出愈率(％)	生长状况
						茎	100	1.0	70	70％	愈伤体积大，玻璃化
茎	100	2.0	90	90％	愈伤体积大，松散，长势好
						茎	100	3.0	89	89％	愈伤体积大，绿色情况较少

2.2三七茎愈伤组织的毛状根诱导

前期三七绿色愈伤组织(胚状体)的诱导实验可得到：加入2ml/L浓缩硅后三七茎杆的愈伤诱导率最高，长势最好，待茎杆的绿色胚状体体积变大，松散时，用来诱导三七的毛状根。用验证并活化后的菌液ArA4进行侵染，侵染完成后放于组培室中培养。

3结论

(1)通过使用一年生三七茎杆作为供试材料，进行绿色胚性愈伤诱导试验，得到诱导三七绿色胚性愈伤的最佳培养基配比FY4：1/2MS基础培养基+1mg/LBA+0.1mg/L IBA+15g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+2ml/L浓缩硅，pH为5.8。获得愈伤组织出愈率为90％。

(2)对活化的ArA4发根农杆菌菌株进行单菌落PCR验证，获得750-1000bp的目的条带，该单菌落即为ArA4的阳性菌株。

(3)用阳性ArA4发根农杆菌对三七绿色胚性愈伤组织进行侵染，通过遗传转化获得三七根状植物组织，提取其DNA进行PCR验证，得到750-1000bp的电泳条带。

结果表明：ArA4发根农杆菌通过遗传转化获得三七根状植物组织即为三七毛状根。

本实验中设计的检测引物为ArA4中Ri质粒的特异性引物，如果检测的的植物组织为农杆菌诱导获得的突变组织，则会被特异性引物扩增出800-850bp的目标条带，反之则无。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.三七愈伤组织培养及其毛状根诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），外植体的处理：

选择生长状态好，无病虫害的新鲜一年生三七茎杆作为外植体，然后将外植体清洗干净并消毒灭菌，然后切成小段；

步骤（2），愈伤组织诱导培养：

将步骤（1）得到的外植体小段接种至愈伤组织诱导培养基中，于25℃条件下进行暗培养至愈伤长出，然后再光照培养至愈伤长至0.5cm-1cm大小，得到愈伤组织；

所述的愈伤组织诱导培养基为FY4：1/2MS基础培养基+1mg/L BA+0.1mg/L IBA+15g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+2ml/L浓缩硅；

步骤（3），菌液制备：

取ArA4发根农杆菌甘油菌在含有100mg/L卡那霉素的TY固体培养基表面划线并封口，在28℃条件下进行培养，将培养获得的单菌落接种至100mg/L卡那霉素的TY液体培养基，封口后在28℃下摇床培养，培养至OD值为0.4-0.8；然后菌液在4℃离心后取出，无菌环境下倒掉上清液，加入重悬液，重悬至OD值为0.6-0.8，最后加入乙酰丁香酮至终浓度为100μmol/L，混匀，得到重悬菌液；

所述的含有100mg/L卡那霉素的TY固体培养基为：5g/L 酵母浸粉+3g/L蛋白胨+5g/LNaCl+100mg/L卡那霉素+8g/L 琼脂；

所述的含有100mg/L卡那霉素的TY液体培养基为：5g/L 酵母浸粉+3g/L蛋白胨+5g/LNaCl+100mg/L卡那霉素；

所述的重悬液为：MS基础培养基+10g/LD-葡萄糖+20g/L蔗糖，pH值为5.2；

步骤（4），共培养：

将步骤（2）得到的愈伤组织切成小块，切面朝上转接入共培养培养基中，并将步骤（3）制得的重悬菌液加入到切面上，于28℃黑暗条件下共培养，待毛状根长出后剪切毛状根再进行扩繁培养；

所述的共培养培养基为：MS基础培养基+1mg/L BA+0.1mg/L IBA+15g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH值为5.8。

2.根据权利要求1所述的三七愈伤组织培养及其毛状根诱导方法，其特征在于，步骤（1）中，将外植体清洗的具体方法为：

采用洗涤剂将外植体清洗，然后用流水冲洗30-60min，接着用0.5g/L的多菌灵浸泡20min，最后用水清洗干净；

消毒灭菌的具体方法为：

用75％酒精消毒30s，再使用0.1%氯化汞消毒8-10min，消毒完成后无菌水冲洗3-4次。

3.根据权利要求1所述的三七愈伤组织培养及其毛状根诱导方法，其特征在于，步骤（1）中，外植体切成1.0-1.5cm小段。

4.根据权利要求1所述的三七愈伤组织培养及其毛状根诱导方法，其特征在于，步骤（2）中，暗培养时间为30天；光照培养时，光照强度为1400-1600LX，光照培养时间为50-60天。

5.根据权利要求1所述的三七愈伤组织培养及其毛状根诱导方法，其特征在于，步骤（3）中，摇床速度为200r/min；培养时间为8-12h；离心速度为4000 r/min，离心的时间为12min。

6.根据权利要求1所述的三七愈伤组织培养及其毛状根诱导方法，其特征在于，步骤（3）中，取上清液再次离心的具体参数为：以4000 r/min转速、4℃下离心12min。

7.根据权利要求1所述的三七愈伤组织培养及其毛状根诱导方法，其特征在于，步骤（4）中，将愈伤组织切成0.5cm×0.5cm的小块；共培养的培养时间为3-4天。