CN114456951B - 促进手参生长的角担菌属真菌菌株及其方法和应用 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种促进兰科药用植物手参种子萌发与生长的角担菌属真菌菌株及通过该真菌菌株促进手参生长的方法和具体应用。

Description

促进手参生长的角担菌属真菌菌株及其方法和应用

技术领域

本公开涉及一株促进兰科药用植物手参生长的角担菌属真菌菌株及其方法和应用，属于微生物领域。

背景技术

手参Gymnadenia conopsea(L.)R.Br.为兰科手参属多年生草本植物，零星分布于欧洲北部及亚洲的温带及亚热带地区，包括尼泊尔、日本、韩国和中国，多生长在北方省区海拔260-4700m的草甸、山坡、潮湿的草地、河谷和灌丛间。手参块茎入药，属于补益药类，用于补肾益精、理气止痛、补脾益肺等，为我国的传统中药，也是蒙药和藏药的常用药。现代药理研究表明，手参具有广泛的药理活性，如滋补作用、抗氧化作用、抗病毒作用、调节免疫作用、抗过敏作用、抗胃溃疡作用、镇静作用以及改善睡眠作用等。

随着人们对手参药用价值的不断认知，市场需求逐年增加，价格逐年攀升，乱采滥挖导致整体生态环境遭受严重破坏。手参现已被2021年9月发布的《国家重点保护野生植物名录》列为国家II级保护植物。在自然条件下，手参主要通过无性繁殖，其繁殖率倍数低于2；有关手参的有性繁殖，目前还少有报道，其困难点就在于种子难以萌发，这点已成为制约手参种群恢复及栽培生产的瓶颈问题。

兰科植物种子细微如尘、无胚乳，一颗蒴果内通常有近万粒种子。兰科植物都有天然的菌根共生特性，自然条件下兰科种子只有依赖真菌菌丝侵入为其提供营养才能萌发，同时能促进其生长生长。因而寻找能有效促进手参萌发生长的真菌无疑是的实现手参种群恢复及栽培生产的有效途径。

现有技术中，虽然已有促进手参种子萌发的部分报道(例如①CN109156115A(2019年01月08日；②高越,陈艳红,邢晓科.兰科药用植物手参种子的真菌共生萌发.菌物学报,2019,38(11):1948-1957；③Yue Gao,Zeyu Zhao,Jiayao Li,Na Liu,Hans Jacquemyn,Shunxing Guo,Xiaoke Xing.Do fungal associates of co-occurring orchids promoteseed germination of the widespread orchid species Gymnadenia conopsea？Mycorrhiza.2020,30:221-228)，但是该3个文献均未明确所述真菌的分类且对特定菌株进行保藏，公众无从得知相应真菌的种类也无法获得相应的特定真菌的特定共生菌株，无法获取其技术内容。

因此，基于手参种子萌发阶段依赖于真菌的特点及其稀缺性，亟待寻找一种能有效促进手参生长的真菌菌株与培养方法。

发明内容

为了突破制约手参种群恢复和栽培生产中种子难以萌发的瓶颈问题，本公开提供一种有效促进手参种子萌发与生长的角担菌属真菌菌株。

同时，本公开还提供一种利用上述菌株促进手参生长的具体方法及其具体应用。

本公开的一方面，提供一种角担菌属真菌菌株，其生物保藏号为CGMCC No.16089。该角担菌真菌能有效促进手参生长。

根据本公开的研究，上述角担菌属真菌菌株的菌丝直径为2.71-3.72μm，其具有隔膜结构，且菌株菌丝多分枝，分枝近直角，气生菌丝丰富。

进一步地，上述菌株的生长温度为18-28℃，生长pH为5.0-6.5。

在本公开的一实施方式中，所述真菌菌株的正面呈白褐色，背面呈浅褐色，老化的菌丝呈黑褐色。

在本公开的一实施方式中，上述真菌菌株能在PDA培养基(含200g/L土豆、20g/L葡萄糖、12g/L琼脂)上生长，其在PDA培养基上的生长速度为0.54-0.57mm/h。

在本公开的一实施方式中，上述角担菌属真菌菌株分离自手参的根部。

在本公开的一实施方式中，上述角担属真菌菌株可通过包括以下步骤的方法从手参根部分离：

(1)选择浅黄色、不透明或表面具有丝核菌样菌丝的根段清洗干净；

(2)去除根段表面的根毛、表皮、根被等附属物，将其浸泡于含双抗(青霉素和链霉素)的无菌溶液中；

(3)取皮层细胞中的菌丝团至无菌水中。

在本公开的一实施方式中，上述双抗可以为青霉素钾和硫酸链霉素。

在本公开的一实施方式中，可以对上述分离自手参根部的角担属真菌菌株通过包括以下步骤的方法进行纯化：将单个菌丝团转移至含双抗的培养基中培养，将开始生长的菌丝团从培养基切下转移至新的培养基继续培养，切取菌丝尖端至新的培养基培养得到经纯化的菌丝，转接试管保存。

在本公开的一实施方式中，上述菌丝的保存温度可以为4℃。

在本公开的一实施方式中，上述含双抗的培养基可以为含双抗的PDA培养基或OMA培养基(含4g/L燕麦粉、8g/L琼脂)。

本公开的又一方面，提供一种促进手参生长的方法，所述方法包括将上述角担菌属真菌菌株与手参建立共生关系促进手参生长。

在本公开一优选的实施方式中，上述角担菌属真菌菌株与手参种子建立共生关系，促进手参种子萌发；和/或，

上述角担菌属真菌菌株与手参原球茎和/或幼苗建立共生关系，促进手参原球茎和/或幼苗的生长；

在本公开一优选的实施方式中，上述角担菌属真菌菌株与手参种子建立共生关系，促进手参种子萌发。

在本公开的一实施方式中，上述角担菌属真菌促进手参生长的方法包括以下步骤：

(1)接菌材料准备：将角担菌菌株在培养基上培养至菌丝至少长满70％培养皿时制成菌片备用；(2)培养基制备：制备待促进生长的手参培养基；(3)接菌：将菌片置于已播种至步骤(2)所述培养基的待促进生长的手参种子/原球茎/幼苗周边；(4)共培养：将待促进生长的手参种子/原球茎/幼苗与角担菌共培养。在本公开的一实施方式中，步骤(3)中菌片与培养基基质的体积比为：1:50。在本公开的一实施方式中，步骤(1)所述菌株的培养环境为：18-28℃，无光照。

在本公开一优选的实施方式中，步骤(1)所述菌株的培养环境为18-28℃；更优选地，为20-25℃。

在本公开的一实施方式中，步骤(4)所述种子与角担菌的共培养环境为：种子未萌发时20-26℃，无光照，种皮完全破裂后20-26℃，光照12/12h L/D黑暗交替。

在本公开的一优选的实施方式中，步骤(4)所述种子与角担菌的培养温度为：种子未萌发时22-25℃，种皮完全破裂后22-25℃。

在本公开的一实施方式中，步骤(4)所述原球茎/幼苗与角担菌的共培养环境为：20-26℃，光照12/12h L/D黑暗交替。

在本公开一优选的实施方式中，步骤(4)所述原球茎/幼苗与角担菌的培养温度为22-25℃。

在本公开一优选的实施方式中，步骤(4)中共培养温度为25℃。

在本公开的一实施方式中，在共培养前可以对步骤(2)所述培养基进行灭菌处理，所述灭菌条件可以为121℃，20min。

在本公开的一实施方式中，步骤(2)所述培养基可以为OMA培养基，其pH可以为5-6，进一步可以为5.6-5.8。

在本公开的一实施方式中，步骤(1)所述菌株在培养基上的培养时间可以为5-9天，例如可以为7天。

在本公开的一实施方式中，步骤(3)所述播种可以为将手参种子撒播于培养基表面，例如可以为用毛笔蘸取手参种子撒播于培养基表面。

本公开的再一方面，提供一种上述角担菌属真菌菌株或方法在促进手参生长中的应用。

与现有技术相比，本公开具有以下有益效果：

1、本公开以从手参根部皮层细胞获取的角担菌属真菌菌株为材料，研究了其对手参生长的促进作用，结果证实此菌株极显著地促进手参种子萌发并形成幼苗，利用本公开的菌株促进手参种子，种子完全萌发率可达13％左右，且表现出较强的专一性，能解决了手参种子难以萌发的问题。

2、为了实现手参的人工繁育，传统的组培研究已有多年，但由于存在生根难、烂根、野外成活率低等系列问题，至今未能成功应用于栽培生产。而本公开的菌株可用于手参的苗床育苗或者野外原生境种子直播，使手参的人工栽培成为可能。

3、本公开工艺简单，操作容易，成本低，适于推广应用，可有效解决制约手参栽培生产中种子难以萌发的问题，在手参的种群恢复和原生态栽培方面具有巨大的推广价值。

附图说明

图1示出了角担菌GS2菌株的菌落及菌丝显微照片。其中，左为菌落照片；右为菌丝显微照片。

图2示出了手参种子共生萌发过程。其中，A为未萌发的手参种子和突破种皮刚刚萌发的种子(约23d)；B为种胚突破种皮形成原球茎，表皮毛长出(约25d)；C为原球茎继续分化，表皮毛增多(约1月)；D为顶端分生组织出现，开始分化成苗(约2月)；E为叶和根开始长出并不断伸长(约3月)；F为叶展开成两片，根继续生长(约5月)，标尺＝1mm。

图3为接种角担菌GS2菌株及其他真菌菌株促进手参种子萌发的差异比较。

具体实施方式

I.定义

在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子生物学、细胞和组织培养、微生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。

为了达到清楚和简洁描述的目的，本文中作为相同的或分开的一些实施方案的一部分来描述特征，然而，将要理解的是，本公开的范围可包括具有所描述的所有或一些特征的组合的一些实施方案。

本公开所述“菌丝”是指真菌单个的丝状物，被一层壁包围，壁的主要成分为几丁质。

本公开所述“菌落”是指真菌的菌丝体或孢子接种在固体培养基上，经过培养，向四周蔓延繁殖而形成菌落。

本公开所述“蒴果”是指干果的一种类型，由合生心皮组成，一室或多室，内含许多种子，成熟时干燥开裂。

本公开所述“植物生长”是指植物种子萌发、原球茎生长、幼苗生长、苗床育苗等植物在体积、重量、细胞数目等指标方面的不可逆增加过程。

II.具体实施方式详述

本公开实施例所用的角担菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No：16089，其拉丁文学名为角担菌(Ceratobasidium sp.)，保藏日期2018年7月25日。

实施例

实施例1：角担菌(Ceratobasidium sp.)GS2菌株的分离

(1)手参根段选择：选择采集于北京松山海拔1920m的亚高山草甸的手参根部样品。将新鲜采集的手参根段连土装袋，冲洗干净后选择浅黄色、不透明或表面具有丝核菌样菌丝的根段。为保护这些濒危兰科植物，仅采集2-3个根段，随即填土复原。

(2)根段处理：将上述采集的根段切成2cm左右的片段，用解剖针和镊子刮去根表面的根毛、表皮、根被和其他附属物，无菌水冲洗3次后在10ml含有150μg/ml硫酸链霉素和150μg/ml青霉素钾的无菌水中浸泡10min，再用无菌水冲洗干净。

(3)菌丝团制备：用解剖针和镊子刮上述处理过的根段，使单菌丝团从皮层细胞中游离出来，将其扩散到装有10ml无菌蒸馏水的直径90mm培养皿中。

(4)菌丝团培养：显微镜下找到菌丝团，转移单个菌丝团到1cm³的双抗PDA培养基上(含100μg/ml硫酸链霉素和100μg/ml青霉素钾)，23-25℃暗室培养。

(5)菌株纯化：将菌丝开始生长的菌丝团从小块培养基上切下转移至新的PDA培养基继续培养至菌丝长度为0.5cm，切取菌丝尖端转移至新的PDA培养基，将纯化后到的菌株转接试管，4℃保存。

将该分离到的菌株命名为GS2。

实施例2：角担菌(Ceratobasidium sp.)GS2菌株的鉴定

(1)菌落外观与显微形态特征：选择不同生长时期的菌丝，将其使用盖玻片培养法在23-25℃下培养7-14天，进行观察测量，制片方法为本领域常规方法。

角担菌GS2菌株的菌落在PDA培养基上迅速生长，产生大量絮状气生菌丝，该真菌的菌落正面呈白褐色，背面呈浅褐色，老化的菌丝呈黑褐色，菌落边缘较整齐，厚度不均匀，边缘较薄。菌丝的生长速度为0.54-0.57mm/h，菌丝较粗，直径2.71-3.72μm，显微镜下可清楚观察到其隔膜结构，分枝近直角，未见有性生殖孢子或无性厚垣孢子产生(图1)。

(2)DNA提取：采用CTAB法提取真菌总DNA。

(3)PCR扩增及测序：采用通用引物ITS1-OF和ITS4-OF(引物序列见下表1)扩增序列。PCR反应体系和条件参照相应的产品说明书进行。PCR扩增产物经中美泰和生物技术(北京)有限公司测序。获得其nrDNA ITS序列如SEQ ID NO：1所示。

表1扩增引物说明

注：ITS1-OF不是简单的简并引物，而是合成两条单一引物链(ITS1-OF(C)和ITS1-OF(T))再混匀使用，引用文献见Taylor DL,McCormick MK.Internal transcribed spacerprimers and sequences for improved characterization of basidiomycetous orchidmycorrhizas.New Phytologist,2008,177:1020–1033.

(4)GS2遗传信息确认：已将其GS2 nrDNA ITS序列提交美国国立生物技术信息中心数据库(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)保存，其GenBank号为：OK655751.1，其ITS序列见SEQ ID NO：1。对该菌株进行BLAST比对分析，该菌株与角担菌属真菌(Ceratobasidium sp.DQ102444)序列相似性为99％。根据菌落外观、显微形态特征及分子生物学手段鉴定该菌株属于角担菌属真菌。

其序列如下：

角担菌GS2的ITS序列(SEQ ID NO：1)：

AACTCGGCCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGAATGAACATGGAGTTTGGTTGTTGCTGGCCTCTTTATTGGGGCATGTGCACACCTTCCTCTATTCATCCACACACACCTGTGAACTTGTGAGACGGATAGTAGTCCTCTAGGGGGCGAGGTCCGTCTGCTAATACATAAACTCCAGTATATAAATTCGAATGTCATTTGATGTAACACATCTATAAACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTCGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAATCCTCAAAATAAATCTTTTGTTCATTCGATCGATTTTATTTTGGACTTGGAGGTCTGCAGATTCACGTCTGCTCCTCTTAAATTCATTAGCTGGATCTGTATGAACTCGGTTCCACTCGGCGTGATAAGTATCACTCGCTGAGGACACTGTAAAAGGTGGCCGGGATTATTATGAACCGCTTCTAATAGTCCATTGACTTGGACAAACTACTTATGATCTGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATTCCCCTAGTAAC

实施例3：角担菌GS2菌株促进手参生长的有效性

利用种子与真菌在培养基内的共生实验来检测分离到的角担菌GS2菌株是否对种子萌发和原球茎以及幼苗生长有促进效果，对该菌株促进手参生长的有效性进行检测。

3.1实验步骤：

(1)接菌材料准备：在9cm PDA培养皿上进行角担菌GS2菌株，待菌丝长满约70％培养皿时，无菌状态下将长有菌丝的培养基用孔径0.5cm的打孔器制成若干菌片备用；同时取空白PDA培养基制成0.5cm直径的菌片备用。

(2)共生培养基的准备：制备20皿OMA培养基灭菌备用。

(3)蒴果表面消毒处理：去除手参蒴果的果柄和枯萎花瓣，清水冲洗干净，在超净工作台上依次置于75％酒精中消毒60s和3％次氯酸钠(NaClO)中消毒5min，然后无菌水冲洗6次去除表面消毒剂，最后用滤纸吸干表面水分转移至1.5ml离心管中，4℃下干燥保存。

(4)播种及接菌：超净工作台上，选取饱满的蒴果，用镊子和解剖刀将蒴果切开，将种子撒到干燥滤纸上，然后毛笔蘸取种子均匀撒于共生培养基上，将含GS2真菌的菌片切取小块置于种子周边，以PDA无菌琼脂片为对照组，将培养皿封口，置于25℃人工气候箱中培养。

(5)设置光照培养条件：起始培养置于全黑暗人工气候箱，待培养至25d时，即种子萌发至2级阶段时，设置光照黑暗交替(12/12h L/D，光照强度2000-3000Lx)，稳定设定恒温25℃条件下进行培养。

(6)手参生长检测：接种后每天观察手参种子的萌发和原球茎生长情况。将种子萌发和原球茎发育情况进行分为5级，见表2；

表2兰科植物种子萌发和原球茎生长过程的不同级别及标准

3.2实验结果：

实验室条件下，在播种手参种子的OMA培养基上接种GS2菌株后约23d，观察到手参种子的种胚明显膨大，突破种皮，形成原球茎，萌发至2级，表面形成表皮毛或假根，并且未萌发的手参种子体积与已萌发的手参种子体积形成鲜明对比(图2A)；原球茎整体呈白色透明水滴状，最初呈圆球状，在后期生长约1-2个月时间里，其两头慢慢变尖，大致呈梭形(图2B，C)；随后约2个月时原球茎体积不断增大并开始逐渐在尖端分化出原生分生组织(图2D)，萌发至3级；约3个月时，叶不断伸长，并分化出根，逐渐形成幼苗(2E)。之后，约5-6个月时，幼苗继续生长，伸展出两片叶(图2F)。从始至终，不接菌的对照组种子始终没有萌发迹象，因此，GS2菌株可以有效促进手参种子的萌发并促进原球茎和幼苗的生长。

实施例4：角担菌GS2菌株促进手参生长的专一性

对比分离自手参的其他菌根真菌菌株和其他3种兰科植物的菌根真菌菌株对手参生长促进效果的差异，对该菌株促进手参生长的专一性进行检测。

4.1实验步骤：

(1)接菌材料准备：将角担菌GS2菌株、同样分离自手参的胶膜菌(Tullasnellasp.)GB32菌株和GB1菌株以及分离自与手参共存的其他3种兰科植物(角盘兰(Herminiummonorchis)、二叶舌唇兰(Platanthera chlorantha)和凹舌兰(Dactylorhizaviridis))的HS4、HB1、PS19、DW5和HH1菌株(菌株信息见表3)，分别在若干9cm PDA培养皿上进行活化。待菌丝长满约70％培养皿时，在无菌状态下将长有菌丝的培养基用0.5cm孔径的打孔器制成若干菌片备用；同时取空白PDA培养基也制成0.5cm直径的若干菌片备用。

表3供试菌株信息表

(2)共生培养基的准备：制备135皿OMA培养基灭菌备用，8种真菌和无菌对照每个实验各15皿；分别在培养23d，45d，60d和120d时观察实验结果。

(3)蒴果表面消毒处理：去除手参蒴果的果柄和枯萎花瓣，清水冲洗干净，在超净工作台上依次置于75％酒精中消毒60s和3％次氯酸钠(NaClO)中消毒5min，然后无菌水冲洗6次去除表面消毒剂，最后用滤纸吸干表面水分转移至1.5ml离心管中，4℃下干燥保存。

(4)播种及接菌：超净工作台上，选取饱满的蒴果，用镊子和解剖刀将蒴果切开，将种子撒到干燥滤纸上，然后毛笔蘸取种子均匀撒于共生培养基上。将8种不同菌株菌片及PDA无菌琼脂片(空白对照)分别接入15皿已播种的OMA培养基中。

(5)设置光照培养条件：起始培养置于全黑暗人工气候箱，待培养至25d时，即种子萌发至2级阶段，设置光照黑暗交替(12/12h L/D，光照强度2000～3000Lx)，稳定设定恒温24±1℃条件下进行培养。

(6)检测和数据统计分析：分别在培养23d、45d、60d和120d时在解剖镜下检测各处理组播种种子总数。种子萌发和原球茎生长级别标准参照表2。观察并记录萌发情况及各阶段种子数目，并计算各阶段(1级、2级、3级和4级)中出现该阶段级别特征的种子所占比例(图3)。计算方式为种子萌发至1、2、3、4阶段级别的种子的比率＝出现该阶段级别特征的种子数/总播种数。分析所获真菌菌株对促进手参种子共生萌发的有效性。

4.2实验结果：

如图3所示，在接种8株分离自手参以及与手参共存的其他兰科植物的真菌菌株20-25d后，所有处理组的手参种胚均开始膨大，且种皮开始破裂，其中接种GS2菌株的萌发率最高，可达到80.70±3.52％；而接种DW5菌株的萌发率为最低15.62±1.25％，其余6处理组的萌发率也不相同，存在显著性差异(Kruskal-Wallis test P<0.001)。接种约45d后，除DW5组之外其余接种真菌组都萌发生长至2级状态，其余7组的原球茎萌发率存在显著性差异(P<0.001)并且以GS2组最高。在接种60d后，仅在接种GS2和HH1真菌的处理组中可以观察到原球茎的进一步分化，并且GS2组的原球茎分化率显著高于HH1(P<0.001)。最终，在接种真菌约4月后仅GS2菌株促进了手参种子萌发至第一片叶片出现的幼苗阶段，即完全萌发，此阶段的萌发率约为13.65±1.53％(图3)。上述所有处理组的共生萌发实验均同时设置了对照组即仅播种而不接种任何真菌菌株，对照组的种子始终无萌发迹象。由此可见，GS2菌株能有效促进手参种子的萌发和早期幼苗的生长。

4.3结论：

角担菌GS2菌株在共生培养初期能显著提高手参种子萌发率，虽然供试的其他菌株也在初期促进种子萌发，然而种子萌发率仅指种胚吸水膨胀尚未突破种皮，不具有实际应用价值，更重要的指标是萌发至第四阶段(Stage 4)，即形成幼苗的比率。共生培养后期即幼苗形成时期。在该实验中，供试的其他菌株都不能支持种子萌发至幼苗的形成，只有角担菌GS2菌株可以支持种子萌发形成幼苗，说明手参种子萌发与手参生长对本公开的GS2菌株具有较强的专一性。

兰科植物的种子萌发通常可以通过非共生和共生两种方式。有些兰科植物的种子可以实现非共生萌发，而有些兰科植物的种子则必需通过真菌共生萌发。不能获得有促进种子萌发的共生菌株往往限制了一些极具开发利用价值的兰科物种的种植，以及一些濒危兰科植物的种群恢复。本公开成功实现了手参种子的共生萌发与手参原球茎/幼苗的共生生长，可以进行室内的苗床育种，也可在野外原生境进行种子直播，操作工艺简单，成本低，适于推广应用，为手参的种群恢复和原生态栽培开辟了一条新的途径。

前述对本公开的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本公开限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本公开的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本公开的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本公开的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 中国医学科学院药用植物研究所

<120> 促进手参生长的角担菌属真菌菌株及其方法和应用

<130> MTI21434

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 727

<212> DNA

<213> 角担菌(Ceratobasidium sp.)

<400> 1

aactcggcca tttagaggaa gtaaaagtcg taacaaggtt tccgtaggtg aacctgcgga 60

aggatcatta ttgaatgaac atggagtttg gttgttgctg gcctctttat tggggcatgt 120

gcacaccttc ctctattcat ccacacacac ctgtgaactt gtgagacgga tagtagtcct 180

ctagggggcg aggtccgtct gctaatacat aaactccagt atataaattc gaatgtcatt 240

tgatgtaaca catctataaa ctaagtttca acaacggatc tcttggctct cgcatcgatg 300

aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc 360

tttgaacgca ccttgcgctc cttggtattc ctcggagcat gcctgtttga gtatcatgaa 420

atcctcaaaa taaatctttt gttcattcga tcgattttat tttggacttg gaggtctgca 480

gattcacgtc tgctcctctt aaattcatta gctggatctg tatgaactcg gttccactcg 540

gcgtgataag tatcactcgc tgaggacact gtaaaaggtg gccgggatta ttatgaaccg 600

cttctaatag tccattgact tggacaaact acttatgatc tgatctcaaa tcaggtagga 660

ctacccgctg aacttaagca tatcaataag cggaggaaaa gaaactaaca aggattcccc 720

tagtaac 727

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成核酸

<400> 2

aactcggcca tttagaggaa gt 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成核酸

<400> 3

aacttggtca tttagaggaa gt 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成核酸

<400> 4

gttactaggg gaatccttgt t 21

Claims (11)

1.一种角担菌属真菌菌株GS2(Ceratobasidium sp.)，其保藏号为CGMCC No.16089。

2.根据权利要求1所述的角担菌属真菌菌株，其特征在于，所述角担菌属真菌菌株分离自兰科植物手参。

3.根据权利要求1或2所述的角担菌属真菌菌株，其特征在于，其分离自兰科植物手参的根部。

4.一种促进手参生长的方法，其特征在于，将权利要求1-3任一项所述的角担菌属真菌菌株与手参建立共生关系促进手参生长。

5.根据权利要求4所述的促进手参生长的方法，其特征在于，所述角担菌属真菌菌株与手参种子建立共生关系，促进手参种子萌发；和/或，

所述角担菌属真菌菌株与手参原球茎和/或幼苗建立共生关系，促进手参原球茎和/或幼苗的生长。

6.根据权利要求5所述的促进手参生长的方法，所述角担菌属真菌菌株与手参种子建立共生关系，促进手参种子萌发。

7.根据权利要求5或6所述的促进手参生长的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）接菌材料准备：将角担菌菌株在培养基上培养至菌丝至少长满70%培养皿时制成菌片备用；（2）培养基制备：制备待促进生长的手参培养基；（3）接菌：将菌片置于已播种至步骤（2）所述培养基的待促进生长的手参种子、原球茎或幼苗周边；（4）共培养：将待促进生长的手参种子、原球茎或幼苗与角担菌共培养。

8.根据权利要求7所述的促进手参生长的方法，其特征在于，步骤（3）所述菌片与培养基基质的体积比为：1:50。

9.根据权利要求7所述的促进手参生长的方法，其特征在于，步骤（1）所述菌株的培养环境为：18-28℃，无光照；

步骤（4）所述种子与角担菌的培养环境为：种子未萌发时20-26℃，无光照，种皮完全破裂后20-26℃，12/12h L/D光照黑暗交替；

步骤（4）所述原球茎或幼苗与角担菌的培养环境为：20-26℃，12/12h L/D光照黑暗交替。

10.根据权利要求9所述的促进手参生长的方法，其特征在于，步骤（1）所述菌株的培养环境为20-25℃；

步骤（4）所述种子与角担菌的培养温度为：种子未萌发时22-25℃，种皮完全破裂后22-25℃；

步骤（4）所述原球茎或幼苗与角担菌的培养温度为22-25℃。

11.权利要求1-3任一项所述角担菌属真菌菌株或权利要求4-10任一项所述方法在促进手参生长中的应用。

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