CN116925923A - 一种促进天麻种子萌发的真菌ph30w及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促进天麻种子萌发的真菌及其应用，所述真菌为Mycena confinationis PH30W；保藏时间2023年3月14日；保藏编号：CGMCC No.40389；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明证明该菌种具有开始萌发天数短和萌发率高等优点，因此能有效地降低经济成本，有效增加天麻产量，提高经济效益；同时本发明发现的一株新的可促天麻种子萌发的菌株(Mycena confinationis)PH30W，可推进天麻种子萌发菌菌种资源开发，并扩展昭通地区天麻种子萌发菌种资源库，为实现昭通天麻的科学规范化、规模化种植奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其是涉及涉及一种新的促进天麻种子萌发的真菌(Mycena confinationis)PH30W及其应用技术领域。
背景技术
天麻是一种著名的传统中药材，具有重要而广泛的药用价值和食用营养价值，在传统医学中被用于治疗几种人类疾病，如眩晕、昏厥、头痛、生殖性瘫痪和癫痫。此外还发现，天麻由于具有健脑、增智等作用，对老年性痴呆具有很好的疗效。天麻的种子如粉尘般微小，无胚乳和其他营养贮备部位，必须依靠真菌侵染胚细胞后提供营养才能萌发。目前，天麻一般认为只是与小菇属(Mycena sp.)的真菌共生萌发。云南省昭通市是我国享有盛名的天麻产区，但是据调查发现目前昭通地区用于种植天麻的萌发菌株均是其他省市引进，存在种源混乱，生长周期长，促萌发效率低，生物技术研究不够深入等问题。研究表明，天麻的有性繁殖中，萌发菌的优劣对种子的萌发率和萌发后原球茎的健康状况影响较大，所以菌种稀缺、促萌发效率低等原因将导致天麻栽培的产量和质量不理想。
发明内容
为了克服上述技术缺陷，本发明提供一株新的促进天麻种子萌发的真菌(Mycenaconfinationis)PH30W。所述真菌为Mycena confinationis PH30W；保藏时间2023年3月14日；保藏编号：CGMCC No.40389；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的天麻种子萌发菌PH30W是在昭通盘河镇山林的野生环境下利用天麻种子袋人工捕获的伸长原球茎中分离到的。
本发明上述真菌的应用为促进天麻种子萌发。
本发明上述真菌的应用为缩短天麻种子萌发天数。
本发明将上述天麻种子萌发菌株PH30W应用在与天麻种子拌播的萌发中，该菌株的萌发率极高，能有效地保证昭通天麻的产量。
为实现上述目的，本发明采取以下技术措施：
1.野外环境捕获原球茎：选择天麻种子自然成熟的7月初，在昭通天麻产区盘河镇的山林选取有野生天麻分布，没有人工种植的原生地。就地取当地的枯枝落叶和土壤与天麻种子拌匀并装进大小为45cm(长)×30cm(宽)，孔径为1mm的网格袋中，将网格袋埋入距离地表5厘米处。5个月后收回种子袋，筛分出网格袋中的天麻样品。用自来水清洗表面泥土后进行表面消毒，消毒后放入4℃冰箱保存作为分离菌株实验备用。
2.天麻种子萌发菌分离培养：先用0.5％的次氯酸钠浸泡30s，再用75％的乙醇浸泡30s，后用无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸沾干。接着用无菌解剖刀切成大概0.02mm的小块，再用无菌的竹签将小块按三点法接种在麦麸培养基(去皮马铃薯100g加水煮沸获得的马铃薯汁液1000ml，麦麸150g，玉米粉100g，葡萄糖100g，琼脂16g)上，培养板置于25℃恒温培养箱。长出的菌落按三点法接于PDA培养基(去皮马铃薯100g加水煮沸获得的马铃薯汁液1000ml，葡萄糖100g，琼脂16g)上，直到培养板上长出纯菌。
3.分子鉴定：将长出纯菌落的真菌进行ITS序列的分子鉴定。采用CTAB方法提取真菌菌丝的全基因组DNA，然后对其ITS区域进行PCR扩增。PCR扩增产物送至上海生工生物技术有限公司测序，测序结果在NCBI上进行BLAST比对分析，该菌株为Mycenaconfinationis。
本发明的有益效果在于：本发明的菌株PH30W是在昭通地区野生环境下人工捕获的天麻伸长原球茎中分离获得的，保证了昭通野生天麻的品质特性且能够确保适应昭通当地；以一株昭通当地种植天麻所用商品萌发菌包中分离出的菌株作为对照的共萌发实验中，证明该菌种具有萌发速度快和萌发率高等优点，因此能有效地降低经济成本，有效增加天麻产量，提高经济效益；同时本发明发现的一株新的可促天麻种子萌发的菌株(Mycenaconfinationis)PH30W，可推进天麻种子萌发菌菌种资源开发，并扩展昭通地区天麻种子萌发菌种资源库，为实现昭通天麻的科学规范化、规模化种植奠定基础。
下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。
附图说明
图1野外种子袋捕获的天麻组织-伸长原球茎阶段；
图2菌株PH30W基于ITS基因贝叶斯法的系统发育树；
图3每个培养皿5片平展菌叶便于观察和统计萌发情况；
图4种皮是否破裂作为判断萌发标准。a为种皮不破裂未萌发，b为种皮破裂萌发；
图5对照和播撒后第4周PH30W菌株的萌发情况；a为水琼脂板不加菌叶空白对照的无萌发情况，b为PDA培养基不加菌叶空白对照的无萌发情况，c为水琼脂板加无菌树叶阴性对照的无萌发情况，d为播撒后第4周PH30W菌株在20倍镜下的萌发情况；
图6PH30W菌株和对照商品菌株黄缘小菇在播撒种子后第4周的萌发情况；
图7PH30W菌株和对照商品菌株黄缘小菇在播撒种子后第4周的萌发率比较；
图8野外放大实验；a为对照商品菌株萌发颗数情况，b为网格袋中萌发实况，c为PH30W菌株萌发颗数情况。
具体实施方式
本发明保护范围不仅限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明，按常规操作进行，如无特殊说明使用试剂均为常规购试剂或按常规方法配制的试剂。
本发明所需试剂：琼脂、葡萄糖、麦麸、玉米粉、CTAB、三氯甲烷、Tris-饱和酚、异丙醇、乙醇、TingKe Master Mix、次氯酸钠。
麦麸培养基：去皮马铃薯100g加水煮沸获得的马铃薯汁液1000ml，麦麸150g，玉米粉100g，葡萄糖100g，琼脂16g。pH：自然。
PDA培养基：去皮马铃薯100g加水煮沸获得的马铃薯汁液1000ml，葡萄糖100g，琼脂16g。pH：自然。
水琼脂培养基：琼脂14g，加水定容到1000ml。
实施例1：萌发菌株的分离筛选和鉴定
1.1野外环境捕获原球茎：选择天麻种子自然成熟的7月初，在昭通天麻产区盘河镇的山林选取有野生天麻分布，没有人工种植的原生地，挑选当地常见的两种天麻品种乌天麻和绿天麻。就地取当地的枯枝落叶和土壤与天麻种子拌匀后装进大小为45cm(长)×30cm(宽)，孔径为1mm的网格袋，设置乌天麻和绿天麻分别5个重复，一共10个网格种子袋埋入距离地表5厘米处，每个种子袋间隔至少1米。5个月后收回网格种子袋，样品放在泡沫箱中，并用冰袋保持低温带回实验室。在实验室筛分出种子袋中的天麻样品，袋中天麻组织为伸长的原球茎阶段(图1)。用自来水清洗天麻组织表面泥土后对天麻组织进行表面消毒：先用0.5％的次氯酸钠浸泡2分钟，再用75％的乙醇浸泡2分钟，后用无菌水冲洗三次，最后用无菌滤纸沾干。表面消毒后放入4℃冰箱保存作为分菌备用。
1.2天麻种子萌发菌分离培养：1)天麻组织分菌：对天麻组织进行表面消毒：先用0.5％的次氯酸钠浸泡30s，再用75％的乙醇浸泡30s，后用无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸沾干。接着用无菌解剖刀切成大概0.02mm的小块，再用无菌的竹签将小块按三点法接种在麦麸培养基上，置于25℃恒温培养箱。纯化长出的菌落接于PDA培养基上，直到培养板上长出纯菌。2)萌发菌包分菌：用无菌镊子挑取昭通天麻种植户所用的商品萌发菌包中的长有白色菌丝基料部分到PDA培养基上，置于25℃恒温培养箱。纯化菌落直到培养板上长出纯菌。
3.分子鉴定：将长出纯菌落的真菌进行ITS序列的分子鉴定。采用CTAB方法提取真菌菌丝的全基因组DNA，然后使用通用引物ITS4(5’-TCC TCC GCC TTA TTG ATA TGC-3’)和引物ITS5(5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’)对DNA的ITS区域进行PCR扩增。利用梯度PCR仪进行PCR扩增反应，每个50μLPCR体系包括25μL的2×TingKe Master Mix，1μL的ITS4引物，1μL的ITS5引物，1μL的DNA模板，22μL的无菌去离子水。扩增条件为：94℃条件4分钟，然后进行94℃条件1分钟、54℃条件1分钟、72℃条件1分钟的35个循环，最后72℃条件10分钟。PCR扩增产物送至上海生工生物技术有限公司测序，测序结果在NCBI上进行BLAST比对分析，记录真菌的分类地位。结合BLAST比对分析结果，菌株PH30W为Mycenaconfinationis；昭通种植所用商品萌发菌包中的菌株为黄缘小菇(Mycenacitrinomarginata)。在BLAST结果页面下载菌株PH30W的同源序列，并构建基于ITS基因贝叶斯法的系统发育树(图2)。
4.菌株保存：将母种PH30W菌株和对照商品菌株黄缘小菇接种于PDA培养基玻璃试管斜面，待菌丝长满斜面放4℃冰箱保存；以及接于30％甘油管放-80℃超低温冰箱保存。
实施例2：实验室共生萌发实验
以从昭通种植户种植所用商品萌发菌包中分离到的菌株黄缘小菇作为对照，在实验室对两种天麻品种乌天麻、绿天麻的萌发效果进行评价。
1)菌叶的制备：采集壳斗科树叶并清洗晾干，剪成2cm×2cm大小的叶片，按土壤灭菌标准(一次灭菌120分钟，间隔24小时灭菌3次)灭菌，烘干后平铺于PDA培养基上。将PH30W真菌菌丝接种于壳斗科树叶的周围，待叶片上长满菌丝(15d)后备用。
2)天麻种子与菌株共萌发：将长满菌丝的叶片平铺于水琼脂培养基上，每个培养皿5片菌叶，在菌叶上稀疏且均匀地播撒天麻种子，在平展树叶上而不是培养基料中更有助于观察和统计天麻种子萌发情况(图3)。并以从昭通种植所用商品萌发菌包中分离到的菌株黄缘小菇作为对照，以水琼脂板上加无菌壳斗科树叶作为阴性对照，以水琼脂培养基上不加菌叶、PDA培养基不加菌叶播撒天麻种子作为空白对照，置于25℃暗培养。定期在解剖镜下观察种子萌发情况，以种皮是否破裂作为萌发标准(图4)，图4中a为100倍镜下种皮膨胀不破裂未萌发，图4中b为100倍镜下种皮膨胀破裂萌发。PH30W菌株开始萌发天数为12天，对照商品菌株黄缘小菇开始萌发天数为19天。图5为阴性和空白对照和播撒种子后第4周PH30W菌株的萌发情况。图5中a-c为阴性和空白对照的无萌发情况，图5中d为播撒后第4周PH30W菌株在20倍镜下的萌发情况，可观察到萌发率极高，呈现基本全部萌发的情况。
统计播撒种子后第4周PH30W菌株和对照商品菌株黄缘小菇的萌发率，计数时在解剖镜下随机选择5个视野分别记录萌发种子数和种子总数，并计算萌发率。萌发率(％)＝(萌发种子数/种子总数)×100％。
图6为PH30W菌株和对照商品菌株黄缘小菇在播撒种子后第4周的萌发率情况。
图7为PH30W菌株对乌天麻、绿天麻的萌发率及对照商品菌株黄缘小菇对乌天麻、绿天麻的萌发率。
实施例3：构建菌塘的野外放大共生萌发实验
1)菌包的制备：先按照配方(阔叶树树叶57％，木屑20％，麸皮20.45％，蔗糖1％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.25％，石膏粉1％，含水量65％)做成天麻种植用的菌包形式，按土壤灭菌标准灭菌后接种PH30W菌株和对照商品菌株黄缘小菇，一个半月菌丝长满菌包后备用。
2)野外放大实验：在干净容器中将菌包基料撕碎，与天麻种子拌匀，装入大小为45cm(长)×30cm(宽)，孔径为1mm的网格袋。网格种子袋埋入距离地表5cm处，每个袋子间隔至少1m。5个月后收回，在实验室筛分出天麻组织。PH30W菌株筛分到793颗，对照小菇筛分到396颗(图8)。图8中a为对照商品菌株萌发颗数情况，图8中b为网格袋中萌发实况，图8中c为PH30W菌株萌发颗数情况。
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述(包括但不仅限于简写、缩写、本领域惯用的单位)。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (5)
1.一种促进天麻种子萌发的真菌，其特征在于，所述真菌为Mycena confinationisPH30W；保藏时间2023年3月14日；保藏编号：CGMCCNo.40389；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述真菌的应用为促进天麻种子萌发。
3.根据权利要求1所述真菌的应用为缩短天麻种子萌发天数。
4.根据权利要求2或3所述的应用方法，其特征在于，所述方法包括：步骤1)按照配方：阔叶树树叶、木屑、麸皮、蔗糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、石膏粉，做成天麻种植用的菌包；
步骤2)按土壤灭菌标准灭菌；
步骤3)接种Mycena confinationisPH30W菌株；
步骤4)在干净容器中将菌包基料撕碎，与天麻种子拌匀。
5.根据权利要求2或3所述的应用方法，其特征在于，所述配方为，以质量计，阔叶树树叶57％，木屑20％，麸皮20.45％，蔗糖1％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.25％，石膏粉1％；含水量65％。
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| CN116286449B (zh) * | 2022-10-28 | 2024-04-16 | 云南大学 | 一株能够促进蜜环菌生长的绿芽孢杆菌ysl-1-5及其应用 |
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