CN116064245A - 一种促进天麻种子萌发的真菌ylw10及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种促进天麻种子萌发的菌株YLW10及其应用，该菌株的分类命名为Mycena abramsii，保藏登记号为：CGMCC No.40281，将YLW10菌株制成天麻种子萌发菌菌包可用于天麻种植。由于YLW10菌株是从昭通野生环境下捕获的原球茎样本中分离得到，保证了野生昭通天麻的品质特性且能够确保适应昭通当地。在与昭通当地种植所用菌株黄缘小菇的对比实验验证了本发明YLW10菌株的高萌发率的优良品质，能有效增加天麻的产量，提高经济效益，可推进萌发菌菌种资源开发，并扩展昭通地区天麻种子萌发菌种资源库，实现昭通天麻的科学规范化、规模化种植。
Description
技术领域
本发明涉及一种促进天麻种子萌发的真菌YLW10及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
天麻(Gastrodia elata)是一种高度特化的兰科植物，无绿叶，不产生叶绿素，终身不进行光合作用，完全依赖真菌营养。天麻的每个蒴果虽然能产生几万粒种子，但种子如粉尘般微小，无胚乳和其他营养贮备部位，必须依靠真菌侵染胚细胞后提供营养才能萌发。目前，天麻一般认为与小菇属(Mycena sp.) 的真菌共生萌发，发育为原球茎后的营养生长需要转换到与另一个特异的真菌蜜环菌(Armillaria mellea)共生完成整个生活史。
天麻萌发菌分离较为不易，较有效的分离来源为原球茎，收集林下树叶用成熟天麻种子诱捕其上的萌发菌，待种子萌发后，用得到的原球茎分离真菌。自1980年分离得到天麻种子萌发菌并应用于天麻有性繁殖以来，萌发菌的分离鉴定一直是研究热点，但由于其为弱腐生菌，其生长慢、难培养的特点使分离鉴定困难较大，分离鉴定得到的菌株不多。用于生产的萌发菌主要是石斛小菇 (Mycena dendrobii)和紫萁小菇(Mycena osmundicola)2种，但在长期的无性繁殖过程中，菌种退化现象十分严重，萌发菌种质资源严重缺乏。并且不同地域分离得到的萌发菌对天麻种子的萌发率和萌发质量也各不相同。因此，迫切需要分离筛选出适合昭通当地的一种优质萌发菌，以保证昭通天麻的产量和质量。
发明内容
本发明提供一种促进天麻种子萌发的真菌YLW10，以及它的分离筛选方法和应用。
本发明所述的真菌为沟纹小菇(Mycena abramsii)YLW10，保藏登记号为： CGMCCNo.40281；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2022年08月15日。
本发明萌发菌是在野生环境下利用天麻种子袋人工捕获的原球茎中分离到的。
本发明所述真菌的应用为促进天麻种子萌发。即在与天麻种子拌播的萌发中，该菌株萌发率极高，有效地保证昭通天麻的产量和质量。
本发明所述真菌的获取方法包括以下步骤：
1)野外人工捕获原球茎：选择天麻种子自然成熟的7月，在昭通天麻主要产区彝良县小草坝选取有野生天麻分布，没有人工种植的原生地。就地取当地的枯枝落叶和土壤拌天麻种子并装进大小为45cm(长)×30cm(宽)的网格种子袋。3个月后收回种子袋，筛分出种子袋中的天麻组织样品，种子袋中的天麻组织皆为原球茎阶段。表面消毒后放入4℃冰箱保存。
2)天麻种子萌发菌分离培养：先用0.5％的次氯酸钠浸泡30s，再用75％的乙醇浸泡30s，后用无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸沾干。接着用无菌解剖刀切成大概0.02mm的小块，再用无菌的镊子将小块按三点法分别接种在提前设计好的不同种的分菌培养基上，置于28℃恒温培养箱。长出的白色菌落按三点法接于PDA培养基上，直到板上长出纯菌。
3)分子鉴定：将长出纯菌落的真菌进行ITS序列的分子鉴定。采用CTAB 方法提取真菌菌丝的全基因组DNA，然后对DNA的ITS区域进行PCR扩增。 PCR扩增产物送至上海生工生物技术有限公司测序，测序结果在NCBI上进行 BLAST比对分析，记录真菌的分类地位。结合BLAST比对分析结果，该菌株为沟纹小菇(Mycena abramsii)。
本发明的有益效果在于：本发明的菌株YLW10是在野生环境下取用昭通当地枯枝落叶和土壤与天麻种子拌播后获得的原球茎中分离获得的，保证了野生昭通天麻的品质特性且能够确保适应昭通当地；以一株昭通当地种植天麻所用的萌发菌作为对照的的共萌发实验中，证明该菌种具有萌发速度快和萌发数量多等优点；使用该菌种萌发天麻种子能够降低经济成本，有效增加天麻产量，提高经济效益；可推进萌发菌菌种资源开发，并扩展昭通地区天麻种子萌发菌种资源库，实现昭通天麻的科学规范化、规模化种植。
附图说明
图1为本发明空白对照和播撒后第6周YLW10菌株的萌发情况图。
图2为本发明播撒后第7周YLW10菌株和对照菌株黄缘小菇的萌发率图。
图3 YLW10菌株播撒后第8周和第12周原球茎生长情况图。
图4对照菌株黄缘小菇播撒后第12周的原球茎生长情况图。
具体实施方式
以下通过实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不仅限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明，按常规操作进行，如无特殊说明使用试剂均为常规购试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1：萌发菌的分离筛选和鉴定
1)野外人工捕获原球茎：选择天麻种子自然成熟的7月，在昭通天麻主要产区彝良县小草坝选取有野生天麻分布，没有人工种植的原生地，以及当地常见的两种天麻品种乌天麻和绿天麻。就地取当地的枯枝落叶和土壤拌天麻种子并装进大小为45cm(长)×30cm(宽)的网格种子袋，设置乌天麻和绿天麻分别5 个重复，一共10个种子袋埋在距离地表3厘米处，每个种子袋间隔至少1米。 3个月后收回10个种子袋，样品放在泡沫箱中，并用冰袋保持低温带回实验室。在实验室筛分出种子袋中的天麻样品，种子袋中天麻组织皆为原球茎阶段。对天麻组织进行表面消毒，先用0.5％的次氯酸钠浸泡2分钟，再用75％的乙醇浸泡2分钟，后用无菌水冲洗三次。表面消毒后放入4℃冰箱保存。
2)天麻种子萌发菌分离培养：先对天麻组织进行表面消毒，先用0.5％的次氯酸钠浸泡30s，再用75％的乙醇浸泡30s，后用无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸沾干。接着用无菌解剖刀切成大概0.02mm的小块，再用无菌的镊子将小块按三点法分别接种在提前设计好的不同种的分菌培养基上，置于28℃恒温培养箱。长出的白色菌落按三点法接于PDA培养基上，直到板上长出纯菌。
用无菌镊子挑取昭通当地天麻种植户所用的天麻种子萌发菌包中的白色菌丝部分到PDA培养基上，置于28℃恒温培养箱。长出的菌落纯化接于PDA培养基上，直到板上长出纯菌。
3)分子鉴定：将长出纯菌落的真菌进行ITS序列的分子鉴定。采用CTAB 方法提取真菌菌丝的全基因组DNA，然后使用通用引物ITS4(5’-TCC TCC GCC TTA TTG ATA TGC-3’)和引物ITS5(5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’) 对DNA的ITS区域进行PCR扩增。每个50μLPCR体系包括25μL的2×TingKe Master Mix，1μL的ITS4引物，1μL的ITS5引物，1μL的DNA模板，22μL的无菌去离子水。扩增条件为：94℃条件4分钟，然后进行94℃条件1分钟、54℃条件1分钟、72℃条件1分钟的35个循环，最后72℃条件10分钟。PCR扩增产物送至上海生工生物技术有限公司测序，测序结果在NCBI上进行BLAST比对分析，记录真菌的分类地位。
结合BLAST比对分析结果，该菌株为沟纹小菇(Mycena abramsii)；昭通种植所用菌包中的菌株为黄缘小菇(Mycena citrinomarginata)。
4)菌株保存：将母种YLW10菌株进行PDA培养基玻璃试管斜面放4℃冰箱和30％甘油管放-80℃保存。
实施例2：实验室共生萌发实验
以从昭通种植户种植所用菌包中分离到的萌发菌株黄缘小菇作对照，在实验室对两种天麻品种乌天麻、绿天麻的萌发效果进行评价。首先进行菌叶的制备：将壳斗科树叶清洗干净，晾干，剪成2cm×2cm大小的叶片，按土壤灭菌标准灭菌，烘干后平铺于PDA培养基上。将适量的YLW10真菌菌丝接种于壳斗科树叶的周围，待叶片上长满菌丝(10d)后备用。然后将长满菌丝的叶片平铺于水琼脂板上，每个培养皿5片菌叶，在菌叶上稀疏且均匀地播撒天麻种子，并以无菌壳斗科树叶、PDA培养基、水琼脂培养基上撒的天麻种子作为空白对照，置于25℃暗培养。定期在解剖镜下观察种子萌发情况，图1a-c为空白对照的无萌发情况，图1d为播撒后第6周YLW10菌株在20倍镜下的萌发情况，可观察到萌发率极高，呈现基本全部萌发的情况。
统计播撒后第7周YLW10菌株和对照菌株黄缘小菇的萌发率，计数时在解剖镜下随机选择5个视野分别记录萌发种子数和种子总数，并计算萌发率。萌发率(％)＝(萌发种子数/种子总数)×100％。图2为YLW10菌株和对照小菇黄缘小菇在播撒后第7周的萌发率情况。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
Claims (4)
1.一种真菌，其特征在于，所述的真菌为沟纹小菇(Mycena abramsii)YLW10，保藏登记号为：CGMCC No.40281；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的真菌，其特征在于，该真菌的应用为促进天麻种子萌发。
3.根据权利要求1所述的真菌，其特征在于，所述真菌的获取方法包括以下步骤：
步骤1)野外人工捕获原球茎：
选择天麻种子自然成熟的7月，选取有野生天麻分布，没有人工种植的原生地，以及两种天麻品种乌天麻和绿天麻；就地取当地的枯枝落叶和土壤拌天麻种子并装进网格种子袋，分别设置乌天麻和绿天麻重复，种子袋埋在距离地表3厘米处，每个种子袋间隔至少1米；3个月后收回种子袋，样品放在泡沫箱中，并用冰袋保持低温带回实验室；在实验室筛分出种子袋中的天麻样品，对天麻组织进行表面消毒，先用0.5％的次氯酸钠浸泡2分钟，再用75％的乙醇浸泡2分钟，后用无菌水冲洗三次；表面消毒后放入4℃冰箱保存；
步骤2)天麻种子萌发菌分离培养：
先对天麻组织进行表面消毒，先用0.5％的次氯酸钠浸泡30s，再用75％的乙醇浸泡30s，后用无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸沾干；接着用无菌解剖刀切成小块，再用无菌的镊子将小块按三点法接种在分菌培养基上，置于28℃恒温培养箱；长出的白色菌落按三点法接于PDA培养基上，直到板上长出纯菌。
4.根据权利要求1所述的真菌，其特征在于，对该真菌进行分子鉴定的引物组：ITS4：5’-TCC TCC GCC TTA TTG ATA TGC-3’和引物ITS5：5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’。
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2022
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| CN116286449B (zh) * | 2022-10-28 | 2024-04-16 | 云南大学 | 一株能够促进蜜环菌生长的绿芽孢杆菌ysl-1-5及其应用 |
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