CN108260470B - 一种提高松茸菌根化育苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食用菌栽培技术领域，具体涉及一种提高松茸菌根化育苗的方法及应用。本发明包括：通过温差法，分离筛选和鉴定得到一个与松树根际共生的松茸菌株YN1，其保藏编号为CCTCC NO：M 2017719；以直径为14.5cm的大平板为菌根化的容器，以松树种子为试材，将无菌萌发的松树苗和松茸菌株YN1接种于铺好玻璃纸的平板内，用无菌的铁丝网将松苗固定进行共培养，在光照培养箱中静置培养2—3个月后，在体视显微镜下可观察到明显的松茸菌根结构。移栽一年后，取松茸菌根结构，抽提菌根基因组DNA，做ITS分子鉴定，皆为单一条带的凝胶图像，经与NCBI比对确定皆为松茸，本发明的菌根化鉴定的正确率为100％。

Description

一种提高松茸菌根化育苗的方法

技术领域

本发明属于食用菌培育和栽培技术领域，具体涉及一种提高松茸菌根化育苗的方法及应用。

背景技术

松茸(Tricholoma matsutake)，是一种营养价值和经济价值都极其可观的共生食用菌。松茸不仅香味特殊，味道鲜美，而且还富含多糖、甾醇、蛋白质、微量元素、维生素，以及多种必需的氨基酸等营养物质，能抗氧化防衰老，防癌抗肿瘤，提高人体免疫力，防治心血管疾病；因此，长期受到人们的追捧，尤其畅销于日本市场，成为全球最为名贵的野生食用菌之一。我国的松茸主要生长在东北的部分林区以及高海拔温度较低的西南地区如四川，云南以及西藏的部分地区，宿主范围主要集中在松科和壳斗科的植物上，子实体也多见于云南松、赤松，以及栎树等木本植物的根系旁边，虽然我国其他省份也曾报道有“松茸”，但是其中大多并非真正的松茸(Tricholoma matsutake)，虽然它们在口感上和松茸有一定的差异，但是由于它们和松茸(Tricholoma matsutake)在生态位，以及形态和系统发育上十分接近，不经过专业的鉴定尤其是分子鉴定，很难区分。本领域通常将这些与松茸近似的菌类统称为“松茸类蘑菇(Matsutake mushroom)”或者称之为“松茸口蘑群(Tricholomamatsutake group)” (刘培贵等，1993；于富强，2007)。在一定的时候也会被当作松茸在市场上进行交易。到目前为止，松茸(Tricholoma matsutake)依旧不能像平菇、双孢白蘑菇和香菇等腐生真菌进行人工袋料栽培，松茸市场主要依靠野外采集。

长期以来，松茸的人工栽培都是全球科研应用真菌工作者研究的热点，但由于松茸属于外生菌根真菌，其菌丝不仅生长缓慢，而且必须与宿主植物共生，形成菌根共生体，才能完成其生活史，并形成可供人们食用的子实体部分。到目前为止，全世界许多顶级的科研单位，包括世界著名法国农业科学院，芬兰赫尔辛基大学，日本东京大学，瑞典农业科学大学，新西兰皇家植物与食品研究所，中国科学院昆明植物研究所，华中农业大学等都得到到了真正经过严格鉴定的松茸菌株，并对松茸的人工栽培技术进行了的研究和探索，尤其以日本科学家研究时间最长(持续了一个多世纪)，发表了大量真实性较强的论文，但是松茸子实体诱导的难关始终无法完全突破(Alessandra Zambonelli&Gregory M Bonito，2012)，所以现阶段松茸的生产还不可能离开活树根系所营造的生长环境，暂时人们也不能通过人工合成来模拟这种生态环境，这也是松茸产品稀少，价格昂贵，目前市场上松茸大部分为野生的，仅少部分为半人工栽培的松茸的真正原因。半人工栽培，即在松茸保护地的林地中大面积地接种松茸的菌种以及移栽小的松树苗木，希望提高森林中松茸菌根化苗木的面积，从而提高松茸的产量的方法。但是这些半人工栽培的方法，不仅仅效率较低，还限制了松茸菌根苗合成的时间(即，产松茸的季节)和/或地区(松茸的原产地)，而且更严重的是存在着较大的盲目性和不稳定性。另一方面，随着城市化和工业化的不断推进，原有的自然生态环境不断遭受破坏，例如植被的减少会让原本生境就脆弱的松茸繁殖状况更加堪忧了。在这种情况下，除了保护野生的松茸资源，松茸人工驯化和栽培方面的研究一直都是一个非常有意义的课题，无数的研究者对此问题，都做出了自己的探索，但是绝大多数的研究者分离的菌种和形成的菌根结构都未经过严格的分子鉴定，菌根化合成所采用的方法在离开松茸原产地的就很难理想地合成松茸菌根苗。

据检索，申请号为CN201010166605.X(一种松茸人工促繁技术的方法)公开了一种以松茸子实体和孢子、菌塘周围的菌根、菌丝为繁殖材料的促繁技术，进行了林地管理促茸技术和菌塘人工促茸的探索，该发明据称能在一定程度上可作为云南松茸的原生地保育促繁措施，达到保护菌塘、促进菌塘良好发育的目的，但该文献报道的人工纯培养菌丝做的接种试验种，松茸菌株纯培养的菌株生长速度，分子鉴定，形成的菌根结构的显微观察，哈氏网和菌套结构的观察的照片和数据没有明确地被展示；另外利用松茸子实体和孢子、菌塘周围的菌根、菌丝去扩繁，虽然在原产地可能有一定的效果，但是离开松茸原产地的菌塘就很难理想地合成松茸菌根苗。例如，Yoshiaki，1992等的研究表明，松茸孢子的萌发率因时间，地点，个体以及子实体成熟度的不同差异较大，正常萌发率也只有10-35％，而且单孢菌根化的苗，菌丝不经过交配，最终也无法形成子实体。

同样，申请号为CN201610532499X(一种外生菌根真菌与松属植物的共生关系建立方法) 根据国外早期的探索经验，公布了干巴菌、松茸两种外生菌根真菌对几种松属植物幼苗侵染形成菌根的方法，虽然也是利用消毒过的松属无菌种子和液体松茸菌种在灭过菌的栽培基质中进行菌根苗的侵染，建立了在可控条件下，干巴菌、松茸与几种松属植物的共生关系，遗憾的是它也没有对形成的菌根结构的分子鉴定，显微观察，哈氏网和菌套结构的观察的照片和数据没有明确地被展示，故其合成松茸菌根苗真正的成功性值得商榷，因为自然环境中存在大量真菌(包括一些广谱型的共生真菌)的孢子，它们可以在菌根合成的任何时间段对菌根化的过程进行干扰，形成其他形式的菌根结构)，而不一定能形成理想中的松茸菌根，故由此得出的接种试验结果会因接种和培养的环境条件的变化而不稳定。

申请号为CN2015109060394(野生松茸驯化母种制备方法)，公开了一种野生松茸驯化母种制备方法，采集自然野外生长的松茸制备孢子液，直接用液体培养基揺瓶，让单孢自由交配，将所得的松茸混合菌丝液在洁净室接种于栽培瓶的培养料上，待菌丝长满栽培瓶后，感染处理松茸的优势伴生树种，一来松茸的单孢在纯培养条件下的萌发就是一个比较有难度和缓慢的过程，而萌发的菌丝是否正确，也未经过严格的分子鉴定，就去侵染所谓的优势树种，进行所谓的菌根化栽培，形成的菌根结构的分子鉴定，显微观察，哈氏网和菌套结构的观察的照片和数据没有明确地被展示，故其真实性也很值得怀疑；至于申请号为CN201610 6226335(一种松茸的栽培种植方法)，申请号为CN201710243158.5(一种松茸的栽培种植方法)，申请号为CN2016100496190(一种松茸的液体菌种繁育方法和大田仿生栽培方法)，申请号为CN2017104491504(赤松茸的有机环保种植方法)，申请号为CN2015109060375(野生松茸人工驯化方法)，申请号为CN201510906038X(野生松茸人工栽培过程中诱导出菇方法)；申请号CN201611124728.0(一种松茸的栽培基质及其制备方法)；CN2012102426601 (人工培育松茸高产化栽培方法)；申请号为CN2006100858145(一种人工培育松茸子实体的方法)等报道成功栽培出松茸的专利文献，不仅大多数没有将菌种进行严格的分子鉴定，基本上都是参考了平菇、香菇和大球盖菇等腐生真菌的栽培方法，即，利用木屑、玉米杆、有机肥和土等物质做成培养料或者菌袋，去实现所谓的“松茸”人工栽培，其所得结果远超全世界所有知名的科研单位，解决全球无数精英一个多世纪悬而未决的问题；但是这么好的专利结果和商业化机遇，却迟迟没有被全世界的科研人员和松茸采购商(尤其是松茸文化盛行一千多年的日本)利用起来，其真实性和可靠性不言而喻。

为了缓解野生松茸生存的自然环境被逐年破坏的生态问题，提高目前半人工栽培松茸根化的正确率和效率的问题，为后期实现工厂化批量生产高品质的松茸菌根苗，并推广松茸菌根化栽培的种植方式，申请人在尊重前人科研成果和客观事实的基础上，探索出了一条可以实施或借鉴的方式。本发明经过多次、长时间的试验，准确地分离了松茸菌种，并进行了ITS 分子鉴定，成功地将菌根菌与传统植物组织培养相结合，构建了一套不拘于时不限于地区，稳定且有质量保证的松茸菌根化接种移栽和检验体系，对保护和开发我国宝贵的松茸资源具有极其重要的意义和价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种统一性较高的松茸菌根化育苗及其鉴定的方法，本发明采用一次性透明平板作为菌根化的培养环境，在平板内铺好玻璃纸，放上松树苗后，再用铁丝网对松树苗进行固定，最后将事先通过分子鉴定的松茸菌种和无菌化的松树苗进行共培养，在光照培养箱中静置培养2—3个月后，在体视显微镜下，可以观察到非常明显的松茸菌根结构，最后将松茸菌根化合成苗移栽到装有灭过菌的基质土的花盆中。经检验，从平板中形成的松茸菌根组织以及移栽一年后的松茸菌根组织中抽提基因组DNA进行 ITS分子鉴定，均得到单一的条带，通过NCBI数据库检索和比对确定为为松茸(Tricholoma matsutake)，鉴定结果表明本发明的菌根化的正确率为100％。

本发明的技术路线图，见图1。

实现本发明的技术方案如下所述：

一种提高松茸菌根化的育苗方法，包括以下步骤：

(1)专用松茸菌株的分离：取松茸菌盖和菌柄交界处的组织，接种于菌根菌专用Pach 培养基上，采用冷热刺激的培养方法，即，先在23℃培养箱中静置培养7d，再将组织置于4℃冰箱15d，然后从冰箱取出组织在23℃中静置培养3个月至菌丝长满整个平板；

(2)松茸专用菌株的鉴定：采用传形态学鉴定和分子鉴定的方法，将分离得到的松茸菌株YN1分别接种在Pach固体培养基和Pach液体培养基上，培养一个月后，一方面观察松茸菌落形态和菌丝形态特征，研判是否如前人描述的相似；另一方面收集菌丝，用CTAB法抽提松茸基因组DNA，并用序列表SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物ITS1和ITS14进行PCR 鉴定，根据电泳得出的条带进行测序，将测序结果与NCBI数据库进行比对，研判是否为松茸菌(Tricholoma matsutake)；

(3)松树种子的消毒和无菌苗的培养

1)松树种子的消毒：选择饱满的松树种子，依次放入装有75％体积浓度的酒精浸泡 0.5-1min，再用30％体积浓度的过氧化氢溶液(双氧水)浸泡20-25min，用30％的次氯酸钠溶液浸泡10-15min，三次消毒后，用无菌水反复洗涤种子2-3次，每次3-4min，然后将消毒好的的种子用无菌滤纸吸干水分，得到消毒种子；

2)松树无菌苗的培养：将消毒后并风干的松树种子接种到素琼脂培养基中，置于植物生长箱(例如型号：ZSX1500GS，购自武汉瑞华仪器设备有限责任公司)，光暗交替培养培养温度设定为25℃，光暗交替培养，即，光照培养12h，光照强度为3000lux；黑暗下培养12h；静止培养7-10天，待种子萌发(见图7)；

(3)松茸菌根的接种，建立根菌共生体系：

1)松树菌根苗的接种：去除少数被杂菌污染的松树种子和小苗，自种子萌发20-30天后，在超净工作台上，在无菌苗的根部接种松茸菌株YN-1，将接种后的无菌苗转移至MS固体培养基(MS固体培养基，含通用的琼脂成分，具体配方为通用的MS培养基)的大平板上，在大平板上覆盖玻璃纸，使松茸菌株与无菌苗共培养，将接种后的大平板放回植物生长箱(型号及其厂家信息同上)，在靠近接种苗的根部的区用锡纸进行遮光处理，以促进形成菌根结构(见图8)；

2)松树菌根苗的观察：2-3个月后，当大平板中的小松树苗形成明显的二叉状菌根分枝后，在体视显微镜下面进行观察，制作菌根切片，用番红固绿染色，在高倍数的荧光显微镜下观察哈氏网结构(见图9和11)；

3)松树菌根苗的鉴定：提取松树菌根苗根部的基因组DNA，作第一次分子鉴定，得到松茸菌根苗的单一条带(见图12和图16)；

(4)松茸菌根苗的移栽和管理：

将菌根苗移栽到装有灭菌后的营养基质土花盆中，于24℃、相对湿度为80％下的光照培养室内培养，在开始的3-4个月内用无菌水浇苗，一年以后，观察松茸的菌根苗的植物学形态； (由图13所示，接种松茸的菌根苗比不接种松茸菌的松树苗更高更壮一些)；

(5)松茸菌根苗的再次鉴定：

移栽一年以后，挖出花盆中的菌根苗，当观察到松茸菌根结构表面有一层明显的灰白色菌丝包裹(见图14)时，抽提菌根苗根部基因组DNA，作第三次分子鉴定，得到松茸菌根的单一条带，研判松茸菌根是否衰退(见图16和18)；

其中：

步骤(1)和步骤(2)中所述的Pach固体培养基的配制：按质量计：酒石酸铵0.5g；MgSO₄·7H₂O 0.5g；麦芽糖5g；KH₂PO₄ 1.0g；VB1 0.1g；微量元素母液1ml；葡萄糖20g；琼脂20g；补充蒸馏水至1000mL，pH5.5；

上述微量元素按100倍母液配制：按质量计，H₃BO₃ 8.45g；MnSO₄·4H₂O 5g；Na₂MoO₄·2H2O 0.3g；FeSO₄·7H₂O 6g；CuSO₄·5 H_2O 0.63g；ZnSO₄·7 H₂O 2.27g，用蒸馏水定容至1L；

步骤(3)中所述的素琼脂培养基的配制：琼脂粉20g/L，用蒸馏水定容至1L；

步骤(2)，步骤(4)和步骤(6)中的PCR扩增所用的引物的核苷酸序列如下所示：

正向引物ITSl 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’

反向引物ITS4 5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’；

PCR反应体系：10×Buffer(Mg2+free)，2.0μL；Mg2+1.5μL；dNTP 0.5μL；ITS1 0.5μL；ITS4 0.5μL；模板DNA(50ng/μL)1.0μL；反应总体积为20μL；

第一次PCR条件：

预变性：95℃，5min；

变性：95℃，1min；

复性：55℃，1min；

延伸：72℃，1min；

循环数：×32；

延伸：72℃，10min；

保温：12℃，10min；

得到如下扩增产物的核苷酸序列：

GCTTGGTTAGGTTGTCGCTGGCTCTCCGGGGCATGTGCACGCCTGACGCCAATCTT TTCACCACCTGTGCACATTTTGTAGGCTTGGATAAATATGTCTCGAGGAAGCTCGGTTT GAGGACTGCCGTGCTGCAAAAGCCAGGCTTTCCTTGTATTTTTCCAGCCTATGCATTTT ATTATACACTCGGTATGTCATGGAATGTTATTTGGTTGGCTTAATTGCCAGTAAACCTT ATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTT GCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATTCTCAACCTTT TCAGCTTTTTGTTGAATAGGCTTGGATTTTGGGAGTTGTTGCAGGCTGCTCAGAAGTCT GCTCTCCTTAAATGTATTAGCGGGGCCCTTGTTGTCTAGCATTTGGTGTGATAATTATCT ACGCCATTGTGAACAATGTAATAGGTCGGCTTCTAATCGTCTCGTAAAGAGACAATCTC TGACATTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAG CGGAGGA

上述扩增片段的长度为651bp。

专用松茸菌株的分离、鉴定和保藏：

申请人于2014年8月从云南省楚雄彝族自治州南华县松茸保护林下采集得到一些新鲜野生松茸菌子实体，按常规食用菌组织分离法得到一些候选菌株(或简称分离物)，根据菌落形态、菌丝形态及ITS特异性PCR扩增条带，确定上述编号为YN-1，YN-2，YN-3，YN-4的分离物鉴定为松茸(Tricholoma matsutake)菌株，基于其中的菌株如YN-1的活力相对较好，在 23℃，黑暗条件下和Pach培养基上的日平均生长速率为0.6mm/d，申请人选择YN-1菌株进行后续实验，证明可以作为与松树根共生的松茸菌株加以利用，申请人将筛选得到的松茸菌株命名为松茸YN-1，Tricholoma matsutake YN-1，于2017年11月22日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保存中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2017719。

运用真菌ITS序列的特异引物(见序列表SEQ ID NO：2-3所示)进行PCR扩增，得到的一条特异性条带(胶图上约为700bp，见图6)，根据电泳得出的条带后进行测序，将测序结果发表在NCBI数据库上，与世界上其他实验室或标本馆的松茸和松茸类蘑菇(有序列号或菌株号)的ITS序列，进行了比对和聚类分析，研判本发明的菌株是否为松茸菌(Tricholomamatsutake)，鉴定结果见图16和17。

本发明的优点如下：

(1)本发明建立了一种高效稳定的松茸菌根化育苗体系，涵盖松茸的组织分离，无菌种子萌发，菌根化合成，菌根苗鉴定流程的关键步骤和结果都有清晰的图片和结构展示以及详细地说明，解决了松茸菌根化合成技术长期无严格的执行标准和菌根根化效率不高，稳定性差的技术问题。

(2)本发明技术方案严谨性高，从松茸原产地-云南南华采集分离松茸的菌株，进行了严格的分子鉴定，NCBI数据库序列比对和聚类分析，确保了松茸菌种分类鉴定的真实性和可靠性。此外，利用了组织培养的方法对松树种子进行严格地无菌萌发，保证了松树苗在和松茸共生的全过程，无其他微生物(尤其是其他菌根真菌)的影响，确保了菌根化的严谨性。

(3)本发明菌根化容器为一次性大平板，菌根苗合成好后，取苗移栽方便，整个过程可以工厂化操作，为后面菌根苗的集约化生产奠定了基础。

表1本发明与最接近的对比文献CN201610532499X的比较

附图说明

图1：本发明的技术路线图。

图2：松茸在Pach固体平板(9cm)上培养95天的图。

图3：松茸菌种MS液体培养基上培养2个月的图片。附图标记说明：图3中的a图为静置培养结果，图3中的b图为摇床培养的结果。

图4：松茸菌丝石碳酸品红染色结果。附图标记说明：图4中的a图为单根菌丝，图4中的b图为一团松茸菌丝。

图5：4种疑似松茸的菌株基因组DNA的胶图。图5中泳道依次为YN1，YN2，YN3，YN4菌株。

图6：4种疑似松茸的菌株ITS电泳图。附图标记说明：图6中泳道依次为YN1，YN2，YN3，Y N4菌株。

图7：松树(品种为湿地松)种子无菌萌发结果。

图8：：松树(品种为湿地松)无菌苗与松茸共培养结果。附图标记说明：图8中的a图为接种 1棵松茸菌根苗，图8中的b图为接种2棵松茸菌根苗。

图9：源于湿地松的松茸菌根结构的展示图。附图标记说明：图9中的a图和图9中的b图为在不同湿地松上接种松茸菌丝块后，松茸菌丝块和松树根系共培养结果的一个整体图，有松茸菌丝块，松树菌根结构等；图9中的c图和图9中的d图，菌丝沿着松树根系向前生长形成菌根结构(二叉状)和包裹的菌根的菌套结构图；图9中的e图和图9中的f图为松茸菌根结构的逐步放大图，在图9中的e图可以看到许多二叉状的菌根结构；图9中的f图为选取其中的单个菌根结构的进一步放大图，从中可以看到二叉状的菌根结构的尖端是膨大的，菌根周围被浓密的松茸菌丝所包裹，而根毛几乎都消失了。

图10：不接种松茸的湿地松根系(即对照，简称CK)图。附图标记说明：不接种的湿地松组培苗的根系上，无菌根结构(二叉状)和松茸菌丝，根表皮有许多的根毛组织。

图11：菌根结构横切面番红固绿染色切片的观察。附图标记说明：用番红固绿对其菌根横切面进行染色，在高倍数显微镜下面可以清楚地观察到哈氏网结构以及菌套各层菌丝的排列及其类型，其中湿地松木质化的松树根细胞被染成了红色，含松茸菌丝的菌套和哈氏网组织被染成了蓝色。

图12：湿地松菌根结构分子鉴定的胶图。附图标记说明：在图12中各泳道依次为YN1，YN2， YN3，YN4....YN 12号菌根苗的电泳后的胶图。

图13：移栽一年后的湿地松菌根化苗。附图标记说明：图13中的a图为对照(CK，即未接种松茸菌的湿地松苗)；图13中的b图为接种松茸菌的菌根化苗。

将经过松茸菌根化的湿地松苗和未接种的湿地松苗一起移栽到上述灭过菌的无菌基质中，栽培管理一年，发现菌根化的湿地松苗要比未接种的湿地松苗生长的更好，植株更高，近地面的茎秆更粗壮，松树的针叶更多。

图14：移栽一年后的湿地松菌根化苗。附图标记说明：(图14中的a图为松茸菌根化苗，图14 中的b图为图14中的a图的放大图。

移栽一年后，挖开菌根化苗，可以看到松茸菌根结构表面有灰白色菌丝包裹，菌根结构并未衰退。

图15：移栽一年的湿地松菌根结构分子鉴定的胶图。附图标记说明：图15中的的泳道编号依次为YN1，YN2，YN3，YN4....YN 12号菌根苗胶图。

图16：松茸菌种及第一次菌根结构ITS的NCBI数据库的比对图。

图17：松茸菌株基于ITS的聚类分析图。附图标记说明：方框内的信息为申请人分离的松茸菌株YN1。

本发明选用了ITS全序列共17条，其中MF521898.1_T._matsutake_YN1,即为申请人上传到NCBI上的YN1菌株的核苷酸序列。附图标记说明：登陆号为486686.1_Catathelasma _ventricosum_voucher_PBM_2403是申请人聚类分析选择的外群菌株，其余15条均是是从 GeneBank中下载的，包含了口蘑属松口蘑群的部分种类以及文献中提及的有关类群；序列矩阵经Clustal X排序并手工调整后，对序列用极大似然法进行运算后得到聚类分析树图17。图18：松茸菌根结构二次鉴定的ITS的NCBI比对图。附图标记说明：对应申请人上传的NCBI 登陆号为MF521898.1的核苷酸序列序列相吻合。再次抽提移栽后的12个湿地松菌根基因组 DNA，进行分子鉴定，结果表明本发明的鉴定的核苷酸序列与上传至NCBI数据库的MF5218 98.1的序列相吻合，属于松茸菌，证明本发明建立的整个松茸菌根化的实验体系比较稳定和高效。

具体实施方式

对序列表的说明：

序列表SEQ ID NO:1是松树菌根苗根部的基因组DNA的扩增产物的核苷酸序列，即，松茸 YN1菌株的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:2是扩增SEQ ID NO:1所示序列的正向引物序列。

序列表SEQ ID NO:3是扩增SEQ ID NO:1所示序列的反向引物序列。

实施例1

松茸菌株的分离

待分离材料的采集和分离：松茸菌株是申请人2014年8月从云南省楚雄彝族自治州南华县的松茸保护林下采集得到的，菌株的分离方法按常食用菌常规组织分离法(吕作舟，食用菌栽培学，第2版，高等教育出版社，北京；2006年版；边银丙，食用菌栽培学，第3版，高等教育出版社，北京，2017年版)。具体步骤：将未开伞的松茸置于超净工作台中，经75％酒精棉球檫拭后，切取菌盖和菌柄交界处的内层组织，置于四种不同的常见的分离培养基上(例如PDA，CYM，MMN以及国际上菌根菌专用Pach培养基)平板(含50ug/ml的链霉素作为抗生素，防治杂菌污染)上，采用冷热刺激的培养方法，待长出菌落后挑取边缘的菌丝移至新鲜的 Pach平板中培养，将所得的分离物分别命名为YN-1，YN-2，YN-3......YN 12等。

2、松茸菌株分类学鉴定

采用传统微生物学的鉴定方法和分子鉴定相结合等方法对候选的分离物进行了鉴定，具体步骤如下所述：

(1)菌落形态鉴定：取6mm松茸菌丝块，置于Pach平板上，23℃黑暗条件下培养95天，观察其菌落形态(如图2)。其菌落白色，中央略隆起，呈菌丝圈结构，菌丝质密似板结，边缘菌丝平展，平滑，略稀疏，在培养基上培养三个月后松茸菌外观仍呈白色，这一结果与于富强2007年报道的结果相吻合。松茸液体菌种在液体培养基中静置培养2个月后松茸菌呈浓厚的棉花团状菌丝，在23℃转速90r/min的摇床培养2个月后，松茸菌丝呈质密的圆球状，呈典型的松茸菌株培养物的形态特征，结果见图3所示。

(2)菌丝形态鉴定：将分离物培养基上培养30天后，直接取一块直径为6mm菌丝块，置于200ml的Pach培养基中，于23℃的暗培养箱中静置培养30-90天，得到菌丝培养物(图4)。将以上获得的菌丝培养物液经四层纱布过滤，取细小的菌丝，用石碳酸品红染色，在显微镜 (10×40倍视野)下观察菌丝形态，可观察到菌丝薄壁，最开始为直线型，直径为2.0-4.0μm，少二分叉，分隔少，末端棒状。培养60天后分隔与分支增加，出现少量不规则菌丝，极少量在菌丝分叉、末端或中部膨大(但不是锁状联合)，厚壁，无明显的内含物，松茸菌丝经石碳酸品红染色结果如图3所示，呈松茸菌丝的一般性特征。

(3)分子鉴定：采用常规CTAB法(刘少华，2005)提取分离物液体培养60天后的菌丝基因组DNA(图5)，应用真菌ITS序列的特异引物(引物的核苷酸序列见序列表SEQ ID NO： 2和3SEQ ID NO：3所示)进行PCR扩增，得到的一条特异性条带(胶图上约为700bp，图6)，根据电泳得出的条带后进行测序，将测序结果与NCBI数据库进行比对，研判是否为松茸菌(Tricholoma matsutake)，其结果如图16所示。

3、菌株的保藏

申请人将鉴定为松茸(Tricholoma matsutake)菌株YN-1(在23℃，黑暗条件下和Pach培养基上的日平均生长速率为0.6mm/d)申请人选择YN-1菌株进行后续实验，证明可以作为与松树根共生的松茸菌株加以利用，申请人将筛选得到的松茸菌株命名为松茸YN-1，Tricholoma matsutake YN-1，于2017年11月22日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2017719。

4、接种剂的制备：

将松茸菌株YN-1在Pach培养基上培养90d后，再取边缘直径为6mm菌丝块1块放入Pach固体培养基中进行扩繁，置23℃培养箱中静置培养30-60d，得到生长速度较快的松茸菌丝接种块,即可作为松茸固体接种剂。

二、松树种子的消毒和无菌苗的培养

1、松树种子的消毒：选择饱满的松树种子，依次放入装有75％的酒精(0.5-1min)，30％的过氧化氢溶液(20-25min)，30％的次氯酸钠溶液(10-15min)，经三次消毒后最后用无菌水反复洗涤种子2-3次(每次3-4min)，然后将消毒好的的种子用无菌滤纸吸干水分，即得到消毒种子；

2、无菌苗的培养：将消毒后并风干的松树种子接种到素琼脂培养基中，置于植物生长箱(型号：ZSX1500GS，武汉瑞华仪器设备有限责任公司生产)，培养参数设置为25℃，光暗交替培养(光照培养12h/黑暗培养12h，光照强度为3000lux，培养结果见图6。

三、菌根接种：

去除少数被杂菌污染的松树种子和小苗，大约萌发20—30天后，在超净工作台中将无菌萌发的在小苗的根部接种松茸YN-1菌株，并将接种后的小苗转移到含有MS固体培养基的铺有玻璃纸的大平板上，使松茸菌与无菌小苗共培养，接种后的大平板再置于植物生长箱内，靠近根部的区域可以用锡箔纸进行遮光处理，以促进形成菌根结构(图8)。

四、菌根结构的鉴定：

2-3个月后，当小苗出现明显的二叉状菌根分枝后，转移到体视显微镜下面进行观察，并制作菌根切片，用番红固绿染色，在高倍荧光显微镜下观察哈氏网结构(见图9和11)，而不接种松茸菌株的松树根系，则无二叉状结构和产生松茸菌丝，根表皮有许多根毛(图10)；提取菌根基因组DNA，再次进行分子鉴定和与NCBI数据库库信息进行比对，得到松茸菌根的单一条带(图12和16)。

五、标准化应用体系

一种高效松茸菌根化的育苗方法的应用，包括以下步骤：

(1)专用松茸菌株的分离：取松茸菌盖和菌柄交界处的组织，接种于菌根菌专用Pach培养基上，采用冷热刺激的培养方法，即先在23℃培养箱中静置培养7d，再将组织置于4℃冰箱15d，然后从冰箱取出组织在23℃中静置培养3个月至菌丝长满整个平板；

(2)松茸专用菌株的鉴定：采用传统形态学鉴定和分子鉴定的方法，将分离得到的松茸菌株YN1分别接种在Pach固体培养基和Pach液体培养基上，培养一个月后，一方面观察松茸菌落形态和菌丝形态特征，是否和前人描述相似；另一方面收集菌丝，用改良的CTAB法抽提松茸基因组DNA，并用序列表SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物ITS1和引物ITS14为引物，进行PCR鉴定，根据电泳得出的条带后进行测序，将测序结果与NCBI数据库进行比对，研判是否为松茸菌(Tricholoma matsutake)。

(3)松树种子的消毒和无菌苗的培养

1)松树种子的消毒：选择饱满的松树种子，依次放入装有75％的酒精浸泡0.5-1min，30％的过氧化氢溶液浸泡20-25min，30％的次氯酸钠溶液浸泡10-15min，三次消毒后，用无菌水反复洗涤种子2-3次，每次3-4min，然后将消毒好的的种子用无菌滤纸吸干水分，得到消毒种子；2)松树无菌苗的培养：将消毒后并风干的松树种子接种到素琼脂培养基中，置于植物生长箱(型号：ZSX1500GS；购自武汉瑞华仪器设备有限责任公司生产),光暗交替培养培养温度设定为25℃，光暗交替培养，即，光照培养12h，光照强度3000lux(照明灯管的功率为21W)，黑暗培养12h，静止培养7—10天，待种子萌发(见图7)；

(3)松茸菌根的接种建立根菌共生体系：

1)菌根苗的接种：去除少数被杂菌污染的松树种子和小苗，自萌发20-30天后，在超净工作台上，在无菌苗的根部接种松茸菌株YN-1，将接种后的无菌苗转移至MS固体培养基的铺有大平板上，大平板上覆盖玻璃纸，使松茸菌株与无菌苗共培养，将接种后的大平板放回植物生长箱(型号：ZSX1500GS，武汉瑞华仪器设备有限责任公司)，在靠近接种苗的根部的区用锡纸进行遮光处理，以促进形成菌根结构(见图8)；

2)菌根苗的观察：2-3个月后，当大平板中的小松树苗形成明显的二叉状菌根分枝后，在体视显微镜下面进行观察，制作菌根切片，用番红固绿染色，在高倍数的荧光显微镜下观察哈氏网结构(见图9和11)；

3)菌根苗的鉴定：提取菌根苗根的基因组DNA，作第二次分子鉴定，得到菌根苗的单一条带(见图12和16)；

(4)菌根苗的移栽和管理：

将菌根苗移栽到装有灭菌后的营养基质土花盆中，于24℃、相对湿度(RH)为80％下的光照培养室内培养，在开始的3-4个月内用无菌水浇水，一年以后，观察到接种松茸的菌根苗比当初不接种的松树苗更高更壮一些(见图13)；

(5)松茸菌根苗的再次鉴定：

移栽一年以后，挖出花盆中的菌根苗，可观察到松茸菌根结构表面有一层明显的灰白色菌丝包裹(见图14)；抽提菌根苗根部的基因组DNA，作第三次分子鉴定，得到菌根苗的单一条带，检验松茸菌根是否衰退(见图16和18)；

其中：

步骤(1)和步骤(2)中所述的Pach固体培养基配方如下：酒石酸铵0.5g；MgSO4.7H₂O 0.5g；麦芽糖5g；KH₂PO₄ 1.0g；VB1 0.1g；微量元素1ml；葡萄糖20g；琼脂20g；补充蒸馏水至1000mL,pH5.5；

其中：

上述1000倍微量元素的配方为：H₃BO₃ 8.45g；MnSO₄·4H₂O 5g；Na₂MoO₄·2H₂O0.3g； FeSO₄·7H₂O 6g；CuSO₄·5 H₂O 0.63g；ZnSO₄·7 H₂O 2.27g；用蒸馏水定容至1L；

步骤(3)中所述的素琼脂培养基配方为：琼脂粉20g/L，用蒸馏水定容至1L；

步骤(2)，步骤(3)和步骤(5)中的PCR扩增所用的引物的核苷酸序列如下所示：

正向引物ITSl 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’(即SEQ ID NO:2所示的序列)，

反向引物ITS4 5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’(即SEQ ID NO:3所示的序列)；

PCR反应体系：10×Buffer(Mg2+free)，2.0μL；Mg2+1.5μL；dNTP 0.5μL；ITS1 0.5μL；ITS4 0.5μL；模板DNA(50ng/μL)1.0μL；反应总体积为20μL；

第一次PCR条件：

预变性：95℃，5min；

变性：95℃，1min；

复性：55℃，1min；

延伸：72℃，1min；

循环数：×32；

延伸：72℃，10min；

保温：12℃，10min；

扩增产物的核苷酸序列如下：

GCTTGGTTAGGTTGTCGCTGGCTCTCCGGGGCATGTGCACGCCTGACGCCAATCTTTTC ACCACCTGTGCACATTTTGTAGGCTTGGATAAATATGTCTCGAGGAAGCTCGGTTTGAG GACTGCCGTGCTGCAAAAGCCAGGCTTTCCTTGTATTTTTCCAGCCTATGCATTTTATTA TACACTCGGTATGTCATGGAATGTTATTTGGTTGGCTTAATTGCCAGTAAACCTTATAC AACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGA TAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCT CCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATTCTCAACCTTTTCAGC TTTTTGTTGAATAGGCTTGGATTTTGGGAGTTGTTGCAGGCTGCTCAGAAGTCTGCTCT CCTTAAATGTATTAGCGGGGCCCTTGTTGTCTAGCATTTGGTGTGATAATTATCTACGC CATTGTGAACAATGTAATAGGTCGGCTTCTAATCGTCTCGTAAAGAGACAATCTCTGACATTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGA GGA

经过鉴定的松茸菌株YN1的ITS序列，申请人上传到NCBI网站上，名称为TrimaYN1，上传的序列编号为MF521898.1，序列总长度为651bp。

六、松茸菌根苗的移栽和管理：

将移栽到装有灭菌后的基质土花盆中，于24℃、80％相对湿度(RH)下的光照培养室内培养，在开始的3-4个月内用无菌水浇水，当无菌苗产生发达的菌根结构后，可以用自来水代替，保持温度为24℃，相对湿度保持为80％，一年以后，观察到接种松茸的菌根苗比当初不接种的松树苗要更高更壮一些(见图13)。

七、松茸菌根结构的再次鉴定：

移栽一年以后，挖取开花盆中的菌根苗，可以看到松茸菌根结构表面有一层明显的灰白色菌丝包裹(图14)；再抽提菌根苗根部基因组DNA，此为第三次分子鉴定，电泳后得到松茸菌根的单一条带，以检验松茸菌根是否衰退(见图15和18)。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种适用于松茸菌根化育苗的方法与应用

<141> 2018-01-12

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 651

<212> DNA

<213> 松茸(Tricholoma matsutake)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(651)

<400> 1

gcttggttag gttgtcgctg gctctccggg gcatgtgcac gcctgacgcc aatcttttca 60

ccacctgtgc acattttgta ggcttggata aatatgtctc gaggaagctc ggtttgagga 120

ctgccgtgct gcaaaagcca ggctttcctt gtatttttcc agcctatgca ttttattata 180

cactcggtat gtcatggaat gttatttggt tggcttaatt gccagtaaac cttatacaac 240

tttcaacaac ggatctcttg gctctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt 300

aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcaccttg cgctccttgg 360

tattccgagg agcatgcctg tttgagtgtc atgaaattct caaccttttc agctttttgt 420

tgaataggct tggattttgg gagttgttgc aggctgctca gaagtctgct ctccttaaat 480

gtattagcgg ggcccttgtt gtctagcatt tggtgtgata attatctacg ccattgtgaa 540

caatgtaata ggtcggcttc taatcgtctc gtaaagagac aatctctgac attttgacct 600

caaatcaggt aggactaccc gctgaactta agcatatcaa taagcggagg a 651

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 松茸(Tricholoma matsutake)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 松茸(Tricholoma matsutake)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (1)

1.一种提高松茸菌根化的育苗方法，其特征在于以下步骤：

(1)专用松茸菌株的分离：取松茸菌盖和菌柄交界处的组织，接种于菌根菌专用Pach培养基上，采用冷热刺激的培养方法，即，先在23℃培养箱中静置培养7d，再将组织置于4℃冰箱15d，然后从冰箱取出组织在23℃静置培养3个月至菌丝长满整个平板；

(2)松茸专用菌株的鉴定：采用形态学鉴定和分子鉴定的方法，将分离得到的松茸菌株YN1分别接种在Pach固体培养基和Pach液体培养基上，培养一个月后，观察松茸菌落形态和菌丝形态特征，收集菌丝，用常规CTAB法抽提松茸基因组DNA，用序列表SEQ ID NO:2和SEQID NO:3所示的引物，进行PCR鉴定，根据电泳得出的条带进行测序，将测序结果与数据库中松茸和松茸类蘑菇的ITS序列进行比对和聚类分析，鉴定所述的菌株是否为松茸菌(Tricholoma matsutake)；

(3)松树种子的消毒和无菌苗的培养

1)松树种子的消毒：选择饱满的松树种子，依次放入75％的酒精浸泡0.5-1min，30％的过氧化氢溶液浸泡20-25min，30％的次氯酸钠溶液浸泡10-15min，用无菌水反复洗涤种子2-3次，每次3-4min，然后将消毒好的种子用无菌滤纸吸干水分，得到消毒种子；

2)松树无菌苗的培养：将消毒后并风干的松树种子接种到素琼脂培养基中，置于植物生长箱，光暗交替培养培养温度设定为25℃，光照培养12h，光照强度为3000lux；黑暗培养12h，静止培养7-10d至种子萌发；

(4)建立松茸菌根菌共生体系

1)松树菌根苗的接种：在无菌条件下取种子萌发20-30d后的无菌苗，在其根部接种松茸菌株YN1，将接种后的无菌苗转移至MS固体培养基的大平板上，大平板上覆盖玻璃纸，使松茸菌株与无菌苗共培养，将接种后的大平板放回植物生长箱内，靠近接种苗的根部的区用锡纸作遮光处理，促进形成菌根结构；

2)菌根苗的观察：2-3个月后，当大平板中的小松树苗形成明显的二叉状菌根分枝后，在体视显微镜下进行观察，制作菌根切片，用番红固绿染色，在高倍数的荧光显微镜下观察哈氏网结构；

3)菌根苗的鉴定：提取菌根苗根基因组DNA，作第一次分子鉴定，得到松茸菌根的单一条带；

(5)松茸菌根苗的移栽和管理：

将菌根苗移栽至灭菌的营养基质花盆中，于24℃、相对湿度为80％的光照培养室内培养，在开始的3-4个月内用无菌水浇苗，观察接种松茸的菌根苗的植物学形态；

(6)松茸菌根苗的再次鉴定：

移栽一年后，将松茸菌根苗从花盆中取出，当观察到松茸菌根结构表面有一层明显的灰白色菌丝包裹；抽提菌根苗根基因组DNA，进行第三次分子鉴定，得到菌根苗的单一条带，检验松茸菌根是否衰退；

其中：

步骤(1)和步骤(2)中所述的Pach培养基的配制：按质量计：酒石酸铵0.5g；MgSO₄.7H₂O0.5g；麦芽糖5g；KH₂PO₄ 1.0g；VB₁ 0.1g；微量元素母液1ml；葡萄糖20g；琼脂20g；补充蒸馏水至1000mL，pH5.5；

将上述微量元素按1000倍制成微量元素母液，配制方法：按质量计：H₃BO₃ 8.45g；MnSO₄.4H₂O 5g；Na₂MoO₄.2H₂O 0.3g；FeSO₄.7H₂O 6g；CuSO₄.5H₂O 0.63g；ZnSO₄.7H₂O 2.27g；用蒸馏水定容至1L；

步骤(3)中素琼脂培养基的制备：琼脂粉20g/L，用蒸馏水定容至1L；

步骤(2)，步骤(4)和步骤(6)中的PCR扩增所用的引物的核苷酸序列如下所示：

正向引物ITSl 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’，即SEQ ID NO：2所示的序列，

反向引物ITS4 5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’，即SEQ ID NO：3所示的序列；

PCR反应体系：10×Buffer(Mg2+free)，2.0μL；Mg₂ ⁺ 1.5μL；dNTP 0.5μL；ITS1 0.5μL；ITS4 0.5μL；模板DNA(50ng/μL) 1.0μL；反应总体积为20μL；

第一次PCR条件：

预变性：95℃，5min；

变性：95℃，1min；

复性：55℃，1min；

延伸：72℃，1min；

循环数：×32；

延伸：72℃，10min；

保温：12℃，10min；

扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

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