CN111226687A - 一种野外松茸菌塘的培育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种野外松茸菌塘的培育方法，属于野生菌人工栽培技术领域，包括以下步骤：1)将共生树苗栽种在野外松茸菌塘边缘，侵染8～10个月，得到侵染共生树苗；2)将所述步骤1)得到的侵染共生树苗栽种于距离步骤1)松茸菌塘10～30m处，每年对侵染共生树苗浇灌松茸孢子液。采用本发明提供的野外松茸菌塘的培育方法，5～7年，共生树的根部会形成松茸菌塘。

Description

一种野外松茸菌塘的培育方法
技术领域
本发明属于野生菌人工栽培技术领域，尤其涉及一种野外松茸菌塘的培育方法。
背景技术
松茸(又名松口蘑)Tricholoma matsutake(S.Ito&S.Imai)Singer是一种名贵的野生食用菌，因其味道鲜美、营养丰富且兼具药用功效，深受人们的喜爱。其极高的经济价值不仅促进了松茸经销产业的发展，同时也激起了科学家对松茸研究的兴趣与热情。松茸的人工栽培是长期以来的研究热点，然而，截止目前全球尚无人工栽培成功的先例。
松茸属于外生菌根真菌，它主要与松科和壳斗科植物形成共生关系。松茸的人工栽培受多方面因素的影响，主要包括共生树种、土壤类型和气候条件等。近年来，松茸菌根苗的人工合成已成功实现，但将菌根苗移栽到野外后出现菌丝退化现象，子实体的诱导并未成功。
现有的松茸菌根合成方法不仅操作复杂、成本高，而且菌根苗在野外环境菌根可持续性差，容易被别的菌根真菌所替代，难以形成新的菌塘。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种野外松茸菌塘的培育方法，采用本发明的培育方法，5～7年可形成松茸菌塘。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种野外松茸菌塘的培育方法，包括以下步骤：
1)将共生树苗栽种在野外松茸菌塘边缘，侵染8～10个月，得到侵染共生树苗；
2)将所述步骤1)得到的侵染共生树苗栽种于距离步骤1)野外松茸菌塘10～30m处，每年对侵染共生树苗浇灌松茸孢子液。
优选的，所述共生树苗包括松树苗和/或栎树苗。
优选的，所述共生树苗的培养方法包括：将共生树苗的种子播种于基质中进行萌发，出苗后培养3～5个月，得到共生树苗。
优选的，所述基质包括土壤、蛭石和松树皮，所述土壤、蛭石和松树皮的体积比为(4～6):(4～6):(0.5～1.5)。
优选的，所述土壤为步骤2)侵染共生树苗栽种于距离步骤1)野外松茸菌塘10～30m处的表层土壤。
优选的，所述步骤1)野外松茸菌塘边缘每间隔20～30cm栽种1株共生树苗。
优选的，所述步骤2)侵染共生树苗的栽种穴的深度为15～25cm，直径为5～8cm。
优选的，每年对侵染共生树苗浇灌松茸孢子液1次，所述松茸孢子液中松茸孢子量在5×107个以上。
优选的，所述基质灭菌后使用，所述灭菌的条件包括：所述灭菌的温度在121℃以上，所述灭菌的时间在2h以上，所述灭菌的次数为2次，间隔3d。
优选的，当所述共生树苗为松树苗时，所述松树苗的苗龄为4～5个月；当所述共生树苗为栎树苗时，所述栎树苗的苗龄为3～4个月。
本发明提供了一种野外松茸菌塘的培育方法，包括以下步骤：1)将共生树苗栽种在野外松茸菌塘边缘，侵染8～10个月，得到侵染共生树苗；2)将所述步骤1)得到的侵染共生树苗栽种于距离步骤1)野外松茸菌塘10～30m处，每年对侵染共生树苗浇灌松茸孢子液。本发明将共生树苗在野外松茸菌塘边缘进行侵染，获得的侵染共生树苗能够适应野外环境，在自然条件下进行菌根形成，大大增加了侵染共生树苗移栽后菌根的持续性和菌塘的形成。
具体实施方式
本发明提供了一种野外松茸菌塘的培育方法，包括以下步骤：1)将共生树苗栽种在野外松茸菌塘边缘，侵染8～10个月，得到侵染共生树苗；2)将所述步骤1)得到的侵染共生树苗栽种于距离步骤1)野外松茸菌塘10～30m处，每年对侵染共生树苗浇灌松茸孢子液。
在本发明中，所述野外松茸菌塘的确定方法优选包括：选择有松茸生长的自然林地，在出菇点确定其宿主，将出菇点周围表层落叶及腐殖质轻轻拨开，表层土中可见白色菌丝，菌丝以放射状、扇形或扫帚形，向前或四周推进，为野外松茸菌塘。
在本发明中，所述共生树苗优选包括松树苗和/或栎树苗，所述松树苗的苗龄优选为4～5个月，所述栎树苗的苗龄优选为3～4个月。在本发明中，所述共生树苗的培养方法优选包括：将共生树苗的种子播种于基质中进行萌发，出苗后培养3～5个月，得到共生树苗。在本发明中，所述种子优选经过消毒后再播种，本发明对消毒的方法没有特殊限定，采用常规消毒种子的方法即可。本发明优选将所述种子播种于装有灭菌的基质的圆柱形尼龙袋中进行萌发，所述种子的数量优选为3粒，萌发出苗后，留下1株健壮的苗。在本发明中，所述圆柱形尼龙袋的直径优选为5～8cm，长度优选为8～12cm，更优选为10cm，所述圆柱形尼龙袋的孔径优选为50μm，微生物可以通过，植物的根茎不能通过。
在本发明中，所述基质优选包括土壤、蛭石和松树皮，所述土壤、蛭石和松树皮的体积比优选为(4～6):(4～6):(0.5～1.5)，更优选为5:5:1。在本发明中，所述基质优选灭菌后使用，所述灭菌的条件优选包括：所述灭菌的温度在121℃以上，所述灭菌的时间在2h以上，所述灭菌的次数为2次，间隔3d。在本发明中，所述土壤优选为侵染共生树苗栽种于距离松茸菌塘10～30m处的表层土壤，所述表层土壤中除尽植物根系，所述表层土壤优选以侵染共生树苗的栽种穴为中心、直径50cm以内和深度为20～40cm以内的表层土壤。
本发明优选在野外松茸菌塘边缘每间隔20～30cm栽种1株共生树苗，不破坏松茸菌塘。
本发明将得到的侵染共生树苗栽种于距离野外松茸菌塘10～30m处，该距离内的土壤、微生物和自然环境与共生树苗培养的一致，能最大程度的保证松茸菌塘形成。本发明对所述侵染共生树苗的栽种数量和栽种位置没有特殊限定，根据地势、坡向和土壤条件灵活栽种即可。在本发明中，所述侵染共生树苗的栽种穴的深度优选为15～25cm，更优选为20cm；所述栽种穴的直径优选为5～8cm。本发明优选在移栽前1d对栽种穴灌水浸透，将侵染共生树苗移栽后，覆土5cm后再慢水浇透。本发明对移栽后的侵染共生树苗的管理方法没有特殊限定，采用常规管理即可，若在松茸菌塘形成过程中，发现有蜡蘑、乳牛肝菌等其它外生菌根真菌时，彻底清除外生菌的子实体、菌根和菌丝，并用石灰粉处理，减少侵染共生树苗被其它外生真菌的污染几率。
本发明优选每年对侵染共生树苗浇灌松茸孢子液1次，所述松茸孢子液中松茸孢子量优选在5×107个以上，本发明对所述松茸孢子液的制备方法没有特殊限定，采用常规即可。在本发明中，浇灌松茸孢子液进一步确保松茸菌根不退化。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种野外松茸菌塘的培育方法，包含以下八个步骤：(1)确定松茸菌塘；(2)菌根苗移栽点选取；(3)无菌苗培育；(4)无菌苗侵染；(5)菌根鉴定；(6)菌根苗移栽；(7)苗期管理；(8)菌塘培育。
步骤(1)的内容为，松茸菌塘的确定：选择有松茸生长的松树林，在出菇点确定其宿主，将出菇点周围表层落叶及腐殖质轻轻拨开，表层土中可见白色菌丝，菌丝以放射状、扇形或扫帚形，向前或四周推进，此为菌塘，取菌塘内菌丝和菌根进行形态与分子鉴定。采用CTAB法提取白色菌丝DNA，利用松茸特异性引物扩增IGS1片段，得到片段序列后在NCBI库里比对，从而得出鉴定结果。
步骤(2)的内容为，菌根苗移栽点的选取：在距离松茸菌塘25m处空地或林窗下，根据地势、坡向和土壤条件，选取适宜的菌根苗移栽点，挖取表层土壤，用于无菌苗的培育。翻刨以移栽点为中心、直径50cm内的土壤，深度30cm，彻底清除其中的植物根系。
步骤(3)的内容为，无菌苗的培育：选择饱满、无病虫害的松树种子，松树种子浸泡于蒸馏水中48h后，用30％H2O2杀菌7min，再用无菌水清洗种子直至无气味。将消毒处理过的种子放置于装有无菌基质的直径5cm的圆柱形尼龙网袋(孔径50μm)中萌发生长，每袋放置3粒，待出苗后留健壮的1株继续培养。基质由步骤2的土壤:蛭石:松树皮(v/v/v＝5:5:1)组成，混合均匀后在灭菌锅中(121℃,1.5kg/cm2)灭菌2h，间隔3d再灭菌一次。无菌苗的培育全程放置于精控温室中，培育期间用无菌水浇灌，4个月后可用于侵染。
步骤(4)和(5)的内容为，(4)无菌苗的侵染：无菌苗侵染时间从春季开始，在选好的松茸菌塘外围边缘挖多个5cm的孔穴，每个孔穴间隔25cm以上，将袋装无菌苗置于孔穴内，表层覆土5cm，松茸菌塘会以每年6-12cm的速度向外扩张，8个月侵染完成。(5)菌根苗鉴定：待侵染完成后，取尼龙网袋内根样进行观察和鉴定。在解剖镜下观察根的形态，选取部分菌根进行DNA提取，用特异性引物扩增，快速鉴定是否为松茸菌根。
步骤(6)(7)的内容为，菌根苗移栽：确定为松茸菌根苗后，在事先选好的移栽点挖好深20cm，直径5cm的圆柱形孔穴，在移栽前1d灌水浸透。将菌根苗从容其中取出，移栽至挖好的孔穴内，表面覆土5cm，慢水浇透。(7)苗期管理：菌根苗移栽好后，用栅栏圈围好，防止其他生物的破坏，每1-2个月对移栽苗附近的杂草进行清理。防止病虫害的发生，表层落叶可适度保留，视降雨情况对苗进行浇灌或排涝。
步骤(8)的内容为，菌塘培育：每年春季在菌根苗周围浇灌松茸孢子液(孢子量为5×107个)，并定期检查松茸菌丝、菌根生长与发育情况，如出现蜡蘑Laccaria spp.、乳牛肝菌Suillus spp.等其他外生菌根真菌时，需彻底清除子实体、菌根和菌丝，并用石灰粉处理，减少树苗被其他外生菌根真菌污染的几率。待苗生长至5-7年，15-25％的苗根际会逐渐形成新的松茸菌塘。
实施例2
一种野外松茸菌根合成与菌塘培育的方法，包含以下下八个步骤：(1)确定松茸菌塘；(2)菌根苗移栽点选取；(3)无菌苗培育；(4)无菌苗侵染；(5)菌根鉴定；(6)菌根苗移栽；(7)苗期管理；(8)菌塘培育。
步骤(1)的内容为，松茸菌塘的：选择有松茸生长的栎树林，在出菇点确定其宿主，将出菇点周围表层落叶及腐殖质轻轻拨开，表层土中可见白色菌丝，菌丝以放射状、扇形或扫帚形，向前或四周推进，此为菌塘，取菌塘内菌丝和菌根进行形态与分子鉴定。采用CTAB法提取白色菌丝DNA，利用松茸特异性引物扩增IGS1片段，得到片段序列后在NCBI库里比对，从而得出鉴定结果。
步骤(2)的内容为，菌根苗移栽点的选取：在距离松茸菌塘25m处空地或林窗下，根据地势、坡向和土壤条件，选取适宜的菌根苗移栽点，挖取表层土壤用于无菌苗的培育。翻刨以移栽点为中心、直径50cm内的土壤，深度30cm，彻底清除其中的植物根系。
步骤(3)的内容为，无菌苗的培育：选择饱满、无病虫害的栎树种子，栎树种子浸泡于50℃的温水中60min后，用3％NaClO杀菌30min，再用无菌水清洗种子直至无气味。将消毒处理过的种子放置于装有无菌基质的直径为8cm的圆柱形尼龙网袋(孔径50μm)中萌发生长，每袋放置3粒，待出苗后留健壮的1株继续培养。基质由步骤2的表层土壤:蛭石:松树皮(v/v/v＝5:5:1)组成，混合均匀后在灭菌锅中(121℃,1.5kg/cm2)灭菌2h，间隔3d再灭菌1次。无菌苗的培育全程放置于精控温室中，培育期间用无菌水浇灌，4个月后可用于侵染。
步骤(4)和(5)的内容为，(4)无菌苗的侵染：无菌苗侵染时间从春季开始，在选好的松茸菌塘外围边缘挖多个直径为8cm的孔穴，每个孔穴间隔25cm以上，将袋装无菌苗置于孔穴内，表层覆土5cm，松茸菌塘会以每年6-12cm的速度向外扩张，8个月可检查侵染结果。(5)菌根苗鉴定：待侵染完成后，取尼龙网袋内根样进行观察和鉴定。在解剖镜下观察根的形态，选取部分菌根进行DNA提取，用特异性引物扩增，快速鉴定是否为松茸菌根。
步骤(6)(7)的内容为，菌根苗移栽：确定为松茸菌根苗后，在事先选好的移栽点挖好深20cm，直径8cm的圆柱形孔穴，在移栽前1d灌水浸透。将菌根苗从容其中取出，移栽至挖好的孔穴内，表面覆土5cm，慢水浇透。(7)苗期管理：菌根苗移栽好后，用栅栏圈围好，防止其他生物的破坏，每1-2个月对移栽苗附近的杂草进行清理。防止病虫害的发生，表层落叶可适度保留，视降雨情况对苗进行浇灌或排涝。
步骤(8)的内容为，菌塘培育：每年春季在菌根苗周围注射松茸孢子液(孢子量为5×107个)，并定期检查松茸菌丝、菌根生长与发育情况，如出现蜡蘑Laccaria spp.、乳牛肝菌Suillus spp.等其他外生菌根真菌时，需彻底清除子实体、菌根和菌丝，并用石灰粉处理，减少树苗被其他外生菌根真菌污染的几率。待苗生长至5-7年，15-25％的苗根际会逐渐形成松茸菌塘。
由以上实施例可以得出，采用本发明提供的野外松茸菌塘的培育方法，5～7年，共生树的根部会形成松茸菌塘。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种野外松茸菌塘的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将共生树苗栽种在野外松茸菌塘边缘，侵染8～10个月，得到侵染共生树苗；
2)将所述步骤1)得到的侵染共生树苗栽种于距离步骤1)野外松茸菌塘10～30m处，每年对侵染共生树苗浇灌松茸孢子液。
2.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述共生树苗包括松树苗和/或栎树苗。
3.根据权利要求1或2所述的培育方法，其特征在于，所述共生树苗的培养方法包括：将共生树苗的种子播种于基质中进行萌发，出苗后培养3～5个月，得到共生树苗。
4.根据权利要求3所述的培育方法，其特征在于，所述基质包括土壤、蛭石和松树皮，所述土壤、蛭石和松树皮的体积比为(4～6):(4～6):(0.5～1.5)。
5.根据权利要求4所述的培育方法，其特征在于，所述土壤为步骤2)侵染共生树苗栽种于距离步骤1)松茸菌塘10～30m处的表层土壤。
6.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述步骤1)野外松茸菌塘边缘每间隔20～30cm栽种1株共生树苗。
7.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述步骤2)侵染共生树苗的栽种穴的深度为15～25cm，直径为5～8cm。
8.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，每年对侵染共生树苗浇灌松茸孢子液1次，所述松茸孢子液中松茸孢子量在5×107个以上。
9.根据权利要求4所述的培育方法，其特征在于，所述基质灭菌后使用，所述灭菌的条件包括：所述灭菌的温度在121℃以上，所述灭菌的时间在2h以上，所述灭菌的次数为2次，间隔3d。
10.根据权利要求2所述的培育方法，其特征在于，当所述共生树苗为松树苗时，所述松树苗的苗龄为4～5个月；当所述共生树苗为栎树苗时，所述栎树苗的苗龄为3～4个月。
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