CN102754596A - 滇青冈与牛肝菌纯共生体的建立方法 - Google Patents

滇青冈与牛肝菌纯共生体的建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种滇青冈与牛肝菌纯共生关系的建立方法，属于生物技术领域（植物组织与真菌培养）。在菌根真菌的研究中，尚难以建立一个稳定的植物与真菌的纯共生体。牛肝菌目前尚难以人工栽培，属于一类与植物共生的菌根真菌，在自然条件下与松科、壳斗科等植物形成共生关系。本发明以武定狮子山采集的滇青冈种子及一株广义美味牛肝菌子实体为材料，成功地分别诱导了愈伤组织、菌丝体，并对愈伤组织与菌丝体进行了创新性共培养，在无菌状态下建立了一个简单稳定的纯共生体系。这为今后进一步研究牛肝菌与滇青冈等植物的共生关系、共生机理、牛肝菌子实体发生的分子机制等奠定了重要基础，也为其它大型真菌与共生植物的研究提供了方法借鉴。

Description

滇青冈与牛肝菌纯共生体的建立方法
技术领域
本发明涉及一种滇青冈与牛肝菌纯共生关系建立的培养方法，属于生物技术领域，具体地说是属于植物组织培养及大型真菌菌丝体培养范畴。
背景技术
在菌根真菌的研究中，植物与真菌的共生关系是研究的热点及难点，很多学者曾尝试建立一个稳定的纯共生体，以在排除其他杂菌及环境干扰的前提下对真菌的侵染机制、真菌与植物的共生背景以及共生机理等进行深入的了解，但是在自然环境下符合上述条件的共生体几乎是不存在的。
牛肝菌属(Boletus)隶属于担子菌门(Basidiomycota)，伞菌纲(Agaricomycetes)，牛肝菌目(Boletales)，牛肝菌科(Boletaceae)，为世界广布大属。牛肝菌子实体体型较大、肉质肥厚、味道鲜美，是人类生活史中长期采食的一类美味食用真菌，另外，该属某些种类的子实体中还含有抗氧化、抗肿瘤等功能的特殊活性物质，因而具有很高的经济价值和研究前景。牛肝菌目前尚难以进行人工栽培，属于一类与植物共生的菌根真菌，在自然条件下与松科、壳斗科等植物形成共生关系。牛肝菌子实体的生长发育与共生植物关系密切，对牛肝菌和其共生植物进行生物学关系的研究是探讨牛肝菌子实体发生机制的可行途径。但当研究牛肝菌与植物共生时，自然环境下根系微生物种类复杂，无法排除其它微生物对植物根系的干扰作用，这局限了一批现代技术在牛肝菌与植物共生机制研究上的运用。
滇青冈(Cyclobalanopsis glaucoides )为壳斗科(Fagaceae)，青冈属(Cyclobalanopsis Oerst.)植物，其种子大、发芽率高；美味牛肝菌(B. edulis s.l.)为著名的可食用真菌，在牛肝菌属中具有典型代表性，且在云南分布广泛。因此本发明分别以武定狮子山采集的滇青冈种子及一株广义美味牛肝菌子实体为材料，诱导了愈伤组织及菌丝体，并对二者进行了共培养，在无菌状态下建立了一个愈伤组织与菌丝体的稳定纯共生体系。为今后利用基因敲除或其他技术研究牛肝菌与滇青冈植物的共生关系、共生机理、牛肝菌子实体发生的分子机制等奠定了重要基础。
发明内容
本发明的目的在于，在无菌条件下建立一种简单稳定的牛肝菌与滇青冈植物的共生体系。
实现本发明的技术方案：利用壳斗科滇青冈植物种子，成功得到了无菌苗及愈伤组织，利用美味牛肝菌子实体诱导了菌丝体，将愈伤组织与菌丝体进行共培养，室内建立了共培养体系，实现本发明的主要步骤如下：
（1）滇青冈愈伤组织的诱导及培养：于云南武定狮子山阔叶林中采集滇青冈种子；将种子放至清水中，洗净泥沙及污物，清除漂浮在水面上的烂种；将选出的种子自然干燥，把种皮剔除，挑选子叶中无明显菌斑的种子；将挑选后的种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 s，取出种子，用无菌水清洗2次；将种子放置于0.1% HgCl2溶液中，摇晃浸泡10 min，取出种子，用无菌水清洗2～3次；将消毒处理后的种子芽胚朝上接进种子萌发培养基（MS培养基，无糖，6-BA 1.00～1.50mg/L，NAA 0.08～0.10mg/L，琼脂 7.50 g/L，pH为6.80），每瓶接种1～2颗，未污染的褐化种子于21～22℃下暗培养9～12天后开始萌发，转入2000～ 2500Lux的光照下培养20～23天，长成8～10cm的高茎杆小苗（叶少茎长）；将小苗的茎截下，裁剪成1.0～1.5 cm长的小茎段，将其接种至愈伤组织诱导培养基（MS培养基，蔗糖 30.00 g/L，6-BA 0.80～1.00mg/L，IAA2.00～2.50 mg/L，琼脂 7.50g/L，pH为5.40～5.60）中，每瓶接种1～2个茎段，21～22℃下暗培养10～13天后，与培养基接触的茎段基部开始膨大，并逐渐分化出愈伤组织，30～35天愈伤组织直径达2.0～3.0 cm；将已长成的愈伤组织均匀切分成6～8小块，接种至继代培养基（MS培养基，蔗糖30.00 g/L，6-BA 0.80～1.00 mg/L，NAA 1.50～2.00mg/L，琼脂 7.50 g/L，pH为5.40～5.60）中，19～23天，形成疏松的团块状组织，48～51天愈伤组织逐渐老化，色泽加深；
（2）美味牛肝菌菌丝体的诱导及培养：于狮子山采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的美味牛肝菌子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0.30～0.50cm2的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基（马铃薯200.00g/L、葡萄糖20.00g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g /L、KH2PO40.50g/L、NH4NO3 0.40g/L、KNO3 0.40g /L、VB1 0.10mg/L、麦芽汁 150 ml/L、谷氨酸 0.16g/L、琼脂13.00g/L，pH5.40）表面，培养温度为22～23℃，暗培养7天，菌块周围开始萌发出白色菌丝，60天菌丝体基本长满培养基；将以上诱导的菌丝转入培养皿中，用扩大培养基（淀粉 5.00g/L，葡萄糖2.50g/L，蛋白胨 4.13g/L，MgSO41.00g /L，CaCl2 1.00g /L，KH2PO4 0.50g /L，VB1 0.10mg/L，谷氨酸 0.16g/L，琼脂10.00g/L，pH5.40）进行扩大培养；
（3）滇青冈愈伤组织与牛肝菌菌丝体的共培养：将上面已继代生长30～35天的滇青冈愈伤组织取出，切分成大小相近的8～10块，分别将切好的愈伤组织接种进共培养培养基（1/2MS培养基，蔗糖 10.00～13.00 g/L，淀粉 2.00～3.00g/L，葡萄糖1.00～2.00g/L，蛋白胨 2.00～3.00g/L，VB1 0.05～0.10mg/L，谷氨酸 0.08～0.12g/L，6-BA0.80～1.00 mg/L，NAA1.70～2.50 mg/L，琼脂 8.00～10.00 g/L，pH 5.4～5.6）中，每瓶接一个，将培养皿中已扩繁的菌丝体用1 cm直径的打孔器截取，将截取的4个菌丝块围绕已接种的愈伤组织进行4个方向的等距离接种，30～35天建立起一个无菌稳定的共生体系。
本发明的有益效果是：创新性地建立了滇青冈与牛肝菌的无菌共培养体系，其特点如下，
（1）以滇青冈为例，摸索出了一套共生植物的愈伤组织诱导方法，该方法简单、快速、成功率高； 
（2）提供了一种同时适合愈伤组织和菌丝体生长的共培养基，该培养基配制简单，易操作；
（3）提供了一种植物与真菌共生关系建立的方法，为其它大型真菌与共生植物的研究提供了方法借鉴。
具体实施方式
以下的实施例子是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实例一：
于云南武定狮子山阔叶林中采集滇青冈种子；将种子放至清水中，洗净泥沙及污物，清除漂浮在水面上的烂种；将选出的种子自然干燥，把种皮剔除，挑选子叶中无明显菌斑的种子；将挑选后的种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 s，取出种子，用无菌水清洗2次；将种子放置于0.1% HgCl2溶液中，摇晃浸泡10 min，取出种子，用无菌水清洗2～3次；将消毒处理后的种子芽胚朝上接进种子萌发培养基（MS培养基，无糖，6-BA 1.50mg/L，NAA 0.10mg/L，琼脂 7.50 g/L，pH为6.80），每瓶接种1～2颗，未污染的褐化种子于21～22℃下暗培养10天后开始萌发，转入2000～2500Lux的光照下培养20天，长成10cm的高茎杆小苗（叶少茎长）；将小苗的茎截下，裁剪成1.0～1.5 cm长的小茎段，将其接种至愈伤组织诱导培养基（MS培养基，蔗糖 30.00 g/L，6-BA 1.00mg/L，IAA2.00mg/L，琼脂 7.50g/L，pH为5.60）中，每瓶接种1～2个茎段，21～22℃下暗培养10天后，与培养基接触的茎段基部开始膨大，并逐渐分化出愈伤组织，30天愈伤组织直径达3.0 cm；将已长成的愈伤组织均匀切分成6～8小块，接种至继代培养基（MS培养基，蔗糖30.00 g/L，6-BA 1.00 mg/L，NAA 1.50mg/L，琼脂 7.50 g/L，pH为5.60）中，20天，形成疏松的团块状组织，50天愈伤组织逐渐老化，色泽加深；
于狮子山采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的美味牛肝菌子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0.30～0.50cm2的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基（马铃薯200.00g/L、葡萄糖20.00g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g /L、KH2PO40.50g/L、NH4NO3 0.40g/L、KNO30.40g /L、VB10.10mg/L、麦芽汁150 ml/L、谷氨酸0.16g/L、琼脂13.00g/L，pH5.40）表面，培养温度为22～23℃，暗培养7天，菌块周围开始萌发出白色菌丝，60天菌丝体基本长满培养基；将以上诱导的菌丝转入培养皿中，用扩大培养基（淀粉 5.00g/L，葡萄糖2.50g/L，蛋白胨 4.13g/L，MgSO41.00g /L，CaCl2 1.00g /L，KH2PO4 0.50g /L，VB1 0.10mg/L，谷氨酸 0.16g/L，琼脂10.00g/L，pH5.40）进行扩大培养；
将上面已继代生长30天的滇青冈愈伤组织取出，切分成大小相近的8～10块，分别将切好的愈伤组织接种进共培养培养基（1/2MS培养基，蔗糖 10.00g/L，淀粉2.50g/L，葡萄糖1.25g/L，蛋白胨2.06g/L，VB10.05mg/L，谷氨酸0.08g/L，6-BA1.00mg/L，NAA1.70mg/L，琼脂 10.00 g/L，pH 5.6）中，每瓶接一个，将培养皿中已扩繁的菌丝体用1 cm直径的打孔器截取，将截取的4个菌丝块围绕已接种的愈伤组织进行4个方向的等距离接种，35天建立起一个无菌稳定的共生体系。
实例二：
于云南武定狮子山阔叶林中采集滇青冈种子；将种子放至清水中，洗净泥沙及污物，清除漂浮在水面上的烂种；将选出的种子自然干燥，把种皮剔除，挑选子叶中无明显菌斑的种子；将挑选后的种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 s，取出种子，用无菌水清洗2次；将种子放置于0.1% HgCl2溶液中，摇晃浸泡10 min，取出种子，用无菌水清洗2～3次；将消毒处理后的种子芽胚朝上接进种子萌发培养基（MS培养基，无糖，6-BA 1.30mg/L，NAA 0.10mg/L，琼脂 7.50 g/L，pH为6.80），每瓶接种1～2颗，未污染的褐化种子于21～22℃下暗培养11天后开始萌发，转入2000～2500Lux的光照下培养22天，长成10cm的高茎杆小苗（叶少茎长）；将小苗的茎截下，裁剪成1.0～1.5 cm长的小茎段，将其接种至愈伤组织诱导培养基（MS培养基，蔗糖 30.00 g/L，6-BA 0.80mg/L，IAA2.20mg/L，琼脂 7.50g/L，pH为5.40）中，每瓶接种1～2个茎段，21～22℃下暗培养12天后，与培养基接触的茎段基部开始膨大，并逐渐分化出愈伤组织，32天愈伤组织直径达2.5cm；将已长成的愈伤组织均匀切分成6～8小块，接种至继代培养基（MS培养基，蔗糖30.00 g/L，6-BA 0.80mg/L，NAA 1.80mg/L，琼脂 7.50 g/L，pH为5.40）中，19天，形成疏松的团块状组织，48天愈伤组织逐渐老化，色泽加深；
于狮子山采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的美味牛肝菌子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0.30～0.50cm2的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基（马铃薯200.00g/L、葡萄糖20.00g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g /L、KH2PO40.50g/L、NH4NO3 0.40g/L、KNO30.40g /L、VB10.10mg/L、麦芽汁150 ml/L、谷氨酸0.16g/L、琼脂13.00g/L，pH5.40）表面，培养温度为22～23℃，暗培养7天，菌块周围开始萌发出白色菌丝，60天菌丝体基本长满培养基；将以上诱导的菌丝转入培养皿中，用扩大培养基（淀粉 5.00g/L，葡萄糖2.50g/L，蛋白胨4.13g/L，MgSO41.00g /L，CaCl2 1.00g /L，KH2PO4 0.50g /L，VB1 0.10mg/L，谷氨酸 0.16g/L，琼脂10.00g/L，pH5.40）进行扩大培养；
将上面已继代生长35天的滇青冈愈伤组织取出，切分成大小相近的8～10块，分别将切好的愈伤组织接种进共培养培养基（1/2MS培养基，蔗糖 12.00 g/L，淀粉 2.00g/L，葡萄糖1.00g/L，蛋白胨 2.00g/L，VB10.10mg/L，谷氨酸0.10g/L，6-BA0.80mg/L，NAA2.00 mg/L，琼脂 8.00g/L，pH 5.6）中，每瓶接一个，将培养皿中已扩繁的菌丝体用1 cm直径的打孔器截取，将截取的4个菌丝块围绕已接种的愈伤组织进行4个方向的等距离接种，32天建立起一个无菌稳定的共生体系。
实例三：
于云南武定狮子山阔叶林中采集滇青冈种子；将种子放至清水中，洗净泥沙及污物，清除漂浮在水面上的烂种；将选出的种子自然干燥，把种皮剔除，挑选子叶中无明显菌斑的种子；将挑选后的种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 s，取出种子，用无菌水清洗2次；将种子放置于0.1% HgCl2溶液中，摇晃浸泡10 min，取出种子，用无菌水清洗2～3次；将消毒处理后的种子芽胚朝上接进种子萌发培养基（MS培养基，无糖，6-BA 1.00mg/L，NAA 0.08mg/L，琼脂 7.50 g/L，pH为6.80），每瓶接种1～2颗，未污染的褐化种子于21～22℃下暗培养9天后开始萌发，转入2000～2500Lux的光照下培养23天，长成8cm的高茎杆小苗（叶少茎长）；将小苗的茎截下，裁剪成1.0～1.5 cm长的小茎段，将其接种至愈伤组织诱导培养基（MS培养基，蔗糖 30.00 g/L，6-BA 0.90mg/L，IAA2.30 mg/L，琼脂 7.50g/L，pH为5.60）中，每瓶接种1～2个茎段，21～22℃下暗培养13天后，与培养基接触的茎段基部开始膨大，并逐渐分化出愈伤组织，35天愈伤组织直径达3.0 cm；将已长成的愈伤组织均匀切分成6～8小块，接种至继代培养基（MS培养基，蔗糖30.00 g/L，6-BA 0.90mg/L，NAA 2.00mg/L，琼脂 7.50 g/L，pH为5.60）中，23天，形成疏松的团块状组织，51天愈伤组织逐渐老化，色泽加深；
于狮子山采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的美味牛肝菌子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0.30～0.50cm2的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基（马铃薯200.00g/L、葡萄糖20.00g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g /L、KH2PO40.50g/L、NH4NO3 0.40g/L、KNO30.40g /L、VB10.10mg/L、麦芽汁150 ml/L、谷氨酸0.16g/L、琼脂13.00g/L，pH5.40）表面，培养温度为22～23℃，暗培养7天，菌块周围开始萌发出白色菌丝，60天菌丝体基本长满培养基；将以上诱导的菌丝转入培养皿中，用扩大培养基（淀粉 5.00g/L，葡萄糖2.50g/L，蛋白胨 4.13g/L，MgSO41.00g /L，CaCl2 1.00g /L，KH2PO4 0.50g /L，VB1 0.10mg/L，谷氨酸 0.16g/L，琼脂10.00g/L，pH5.40）进行扩大培养；
将上面已继代生长32天的滇青冈愈伤组织取出，切分成大小相近的8～10块，分别将切好的愈伤组织接种进共培养培养基（1/2MS培养基，蔗糖 13.00 g/L，淀粉 2.00g/L，葡萄糖1.00g/L，蛋白胨3.00g/L，VB1 0.08mg/L，谷氨酸0.12g/L，6-BA0.90mg/L，NAA2.30 mg/L，琼脂 9.00g/L，pH 5.4）中，每瓶接一个，将培养皿中已扩繁的菌丝体用1 cm直径的打孔器截取，将截取的4个菌丝块围绕已接种的愈伤组织进行4个方向的等距离接种，30天建立起一个无菌稳定的共生体系。
实例四：
于云南武定狮子山阔叶林中采集滇青冈种子；将种子放至清水中，洗净泥沙及污物，清除漂浮在水面上的烂种；将选出的种子自然干燥，把种皮剔除，挑选子叶中无明显菌斑的种子；将挑选后的种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 s，取出种子，用无菌水清洗2次；将种子放置于0.1% HgCl2溶液中，摇晃浸泡10 min，取出种子，用无菌水清洗2～3次；将消毒处理后的种子芽胚朝上接进种子萌发培养基（MS培养基，无糖，6-BA 1.20mg/L，NAA 0.08mg/L，琼脂 7.50 g/L，pH为6.80），每瓶接种1～2颗，未污染的褐化种子于21～22℃下暗培养12天后开始萌发，转入2000～2500Lux的光照下培养21天，长成9cm的高茎杆小苗（叶少茎长）；将小苗的茎截下，裁剪成1.0～1.5 cm长的小茎段，将其接种至愈伤组织诱导培养基（MS培养基，蔗糖 30.00 g/L，6-BA 1.00mg/L，IAA2.50mg/L，琼脂 7.50g/L，pH为5.40）中，每瓶接种1～2个茎段，21～22℃下暗培养13天后，与培养基接触的茎段基部开始膨大，并逐渐分化出愈伤组织，33天愈伤组织直径达2.7cm；将已长成的愈伤组织均匀切分成6～8小块，接种至继代培养基（MS培养基，蔗糖30.00 g/L，6-BA 1.00 mg/L，NAA 1.60mg/L，琼脂 7.50 g/L，pH为5.40）中，21天，形成疏松的团块状组织，49天愈伤组织逐渐老化，色泽加深；
于狮子山采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的美味牛肝菌子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0.30～0.50cm2的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基（马铃薯200.00g/L、葡萄糖20.00g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g /L、KH2PO40.50g/L、NH4NO3 0.40g/L、KNO30.40g /L、VB10.10mg/L、麦芽汁150 ml/L、谷氨酸0.16g/L、琼脂13.00g/L，pH5.40）表面，培养温度为22～23℃，暗培养7天，菌块周围开始萌发出白色菌丝，60天菌丝体基本长满培养基；将以上诱导的菌丝转入培养皿中，用扩大培养基（淀粉 5.00g/L，葡萄糖2.50g/L，蛋白胨 4.13g/L，MgSO41.00g /L，CaCl2 1.00g /L，KH2PO4 0.50g /L，VB1 0.10mg/L，谷氨酸 0.16g/L，琼脂10.00g/L，pH5.40）进行扩大培养；
将上面已继代生长33天的滇青冈愈伤组织取出，切分成大小相近的8～10块，分别将切好的愈伤组织接种进共培养培养基（1/2MS培养基，蔗糖 11.00g/L，淀粉 3.00g/L，葡萄糖2.00g/L，蛋白胨 2.50g/L，VB1 0.05mg/L，谷氨酸 0.08g/L，6-BA1.00 mg/L，NAA2.50 mg/L，琼脂 10.00 g/L，pH 5.4）中，每瓶接一个，将培养皿中已扩繁的菌丝体用1 cm直径的打孔器截取，将截取的4个菌丝块围绕已接种的愈伤组织进行4个方向的等距离接种，34天建立起一个无菌稳定的共生体系。 

Claims (4)

1.一种滇青冈与牛肝菌纯共生关系的建立方法，其特征为，利用野外采集的滇青冈(Cyclobalanopsis glaucoides )种子培养无菌苗，诱导愈伤组织，利用野外采集的美味牛肝菌(Boletus edulis s.l.)子实体诱导菌丝体，将愈伤组织与菌丝体进行共培养，室内建立共生关系，主要包括下列步骤：
（1）滇青冈愈伤组织的诱导及培养：于云南武定狮子山阔叶林中采集滇青冈种子；将种子放至清水中，洗净泥沙及污物，清除漂浮在水面上的烂种；将选出的种子自然干燥，把种皮剔除，挑选子叶中无明显菌斑的种子；将挑选后的种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 s，取出种子，用无菌水清洗2次；将种子放置于0.1% HgCl2溶液中，摇晃浸泡10 min，取出种子，用无菌水清洗2～3次；将消毒处理后的种子芽胚朝上接进萌发培养基，每瓶接种1～2颗，未污染的褐化种子于21～22℃下暗培养9～12天后开始萌发，转入2000～ 2500Lux的光照下培养20～23天，长成8～10cm的高茎杆小苗（叶少茎长）；将小苗的茎截下，裁剪成1.0～1.5 cm长的小茎段，将其接种至愈伤组织诱导培养基中，每瓶接种1～2个茎段，21～22℃下暗培养10～13天后，与培养基接触的茎段基部开始膨大，并逐渐分化出愈伤组织，30～35天愈伤组织直径达2.0～3.0 cm；将已长成的愈伤组织均匀切分成6～8小块，接种至继代培养基中，19～23天，形成疏松的团块状组织，48～51天愈伤组织逐渐老化，色泽加深；
（2）美味牛肝菌菌丝体的诱导及培养：于狮子山采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的美味牛肝菌子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0.30～0.50cm2的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基表面，培养温度为22～23℃，暗培养7天，菌块周围开始萌发出白色菌丝，60天菌丝体基本长满培养基；将以上诱导的菌丝转入培养皿中，用扩大培养基进行扩大培养；
（3）滇青冈愈伤组织与牛肝菌菌丝体的共培养：将上面已继代生长30～35天的滇青冈愈伤组织取出，切分成大小相近的8～10块，分别将切好的愈伤组织接种进共培养培养基中，每瓶接一个，将培养皿中已扩繁的菌丝体用1 cm直径的打孔器截取，将截取的4个菌丝块围绕已接种的愈伤组织进行4个方向的等距离接种，30～35天建立起一个无菌稳定的共生体系。
2.根据权利要求1所述的滇青冈与牛肝菌共生关系的建立方法，其特征在于步骤（1）中的
滇青冈种子萌发培养基为：MS培养基，无糖，6-BA 1.00～1.50mg/L，NAA 0.08 ～0.10mg/L，琼脂 7.50 g/L，pH为6.80；愈伤组织诱导培养基为：MS培养基，蔗糖 30.00 g/L，6-BA 0.80～1.00mg/L，IAA2.00～2.50 mg/L，琼脂 7.50g/L，pH为5.40～5.60；愈伤组织继代培养基为：MS培养基，蔗糖 30.00 g/L，6-BA 0.80～1.00 mg/L，NAA 1.50～2.00mg/L，琼脂 7.50 g/L，pH为5.40～5.60。
3.根据权利要求1所述的滇青冈与牛肝菌共生关系的建立方法，其特征在于步骤（2）中的
美味牛肝菌菌丝体的诱导培养基为：马铃薯200.00g/L、葡萄糖20.00g/L、MgSO41.00g/L、CaCl21.00g /L、KH2PO40.50g/L、NH4NO3 0.40g/L、KNO3 0.40g /L、VB1 0.10mg/L、麦芽汁 150 ml/L、谷氨酸 0.16g/L、琼脂13.00g/L，pH5.40；扩大培养基为：淀粉 5.00g/L，葡萄糖2.50g/L，蛋白胨 4.13g/L，MgSO41.00g /L，CaCl2 1.00g /L，KH2PO4 0.50g /L，VB1 0.10mg/L，谷氨酸 0.16g/L，琼脂10.00g/L，pH5.40。
4.根据权利要求1所述的滇青冈与牛肝菌共生关系的建立方法，其特征在于步骤（3）中的共培养培养基为：1/2MS培养基，蔗糖 10.00～13.00 g/L，淀粉 2.00～3.00g/L，葡萄糖1.00～2.00g/L，蛋白胨 2.00～3.00g/L，VB1 0.05～0.10mg/L，谷氨酸 0.08～0.12g/L，6-BA0.80～1.00 mg/L，NAA1.70～2.50 mg/L，琼脂 8.00～10.00 g/L，pH 5.4～5.6。
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