CN107460133B - 深色有隔内生真菌hs40及其在铁皮石斛生产上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及深色有隔内生真菌HS40及其在铁皮石斛生产上的应用。本发明公开了保藏编号为CGMCC NO.14345的深色有隔内生真菌HS40，该内生真菌能够显著促进铁皮石斛的生长及发育，接种该菌株的平皿培养铁皮石斛苗株高、茎径、植株鲜重和干重分别较对照增加21.2％、28.4％、7.5％和140.7％,其中，株高和干重与对照差异均达极显著水平；该菌株处理的铁皮石斛盆栽苗分蘖数、植株鲜重、植株干重和茎干多糖含量分别较对照增加400.0％、94.8％、56.8％、15.8％，其中分蘖数与对照差异达显著水平，植株鲜重、干重和茎干多糖含量则分别达到极显著水平，说明HS40可以有效促进铁皮石斛的生长。

Description

深色有隔内生真菌HS40及其在铁皮石斛生产上的应用
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，特别涉及深色有隔内生真菌HS40及其在铁皮石斛生产上的应用。
【背景技术】
近年来，以美国“国家微生物组计划”为代表的世界微生物战略强化并聚焦了农业微生物在解决人类健康、环境保护、能源等重大问题方面的巨大作用，农业微生物研究已成为国际新一轮科技革命的战略“高地”。同时，近年来由于大量施用化肥、农药对粮食安全、生态环境和资源利用产生的危害也已引起国家高度重视，减少化肥、农药施用和提高化肥利用率成为当前我国农业生产中亟待解决的重要问题。利用自然界中植物共生微生物促进农作物生长符合国家的有关政策，将成为我国农业环境保护、农业可持续发展的一个重要方向。深色有隔内生真菌(DARK SEPTATE ENDOPHYTE，DSE)是植物共生真菌的典型代表之一，它们能够定居在植物根部但对宿主无致病性，菌丝深色有分隔，能够在根部形成"微菌核"等结构特征。研究表明，DSE能与宿主互惠共生，赋予植物优良生长性状，能提高宿主的抗病虫能力及在胁迫环境中的抗逆性，从而可减少化肥、农药的使用。这类真菌具有生态分布广泛、宿主范围广及可分离纯培养的特性，这就决定了它们在农业可持续发展中将发挥越来越重要的作用，具有更为广阔的应用前景。
铁皮石斛是一种珍稀名贵的药用和观赏植物，是我国重点保护的濒危珍稀物种。近年来，虽然铁皮石斛组织培养和人工栽培技术得到快速的发展，但铁皮石斛人工栽培生长缓慢、化肥农药过度施用仍是限制铁皮石斛产业发展的主要障碍。目前，铁皮石斛促生研究所涉及的内生真菌大多来源于铁皮石斛本身，很少来自其他宿主植物。谢玲等研究发现，分离自日本茨城大学农学院山茶树叶部的内生真菌24L-4菌株对铁皮石斛具有明显的促生作用。由此我们推测，我国本土优势植物同样蕴藏着可能对铁皮石斛具有良好促生功能的内生真菌。为发掘更多铁皮石斛优良促生内生真菌，在前期研究基础上，本研究拟从广西北部湾红树植物分离的内生真菌中筛选对铁皮石斛有显著促生作用的菌株，并结合菌株的形态学和分子生物学特征对其进行分类学鉴定，以期为广西优势红树植物内生真菌在铁皮石斛生产上的开发利用提供技术支持。
【发明内容】
鉴于上述发掘更多铁皮石斛优良促生内生真菌，促进广西优势红树植物内生真菌在铁皮石斛生产上的开发利用，本发明目的在于提供一种深色有隔内生真菌HS40及其在铁皮石斛生产上的应用。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：深色有隔内生真菌HS40，保藏编号为CGMCC NO.14345。
在本发明中，作为进一步说明，所述的深色有隔内生真菌HS40的分离包括以下步骤：
(1)样品采集：选择红树林优势树种-木榄进行采样，采用五点采样法采集木榄根、茎、叶部组织，放入4℃的冰盒中保存备用；
(2)培养基的配置：菌株分离培养基使用1/2玉米粉培养基；纯化培养基使用麦芽汁培养基或马铃薯培养基；宿主植物-西红柿种子催芽使用纯琼脂培养基；栽培西红柿以及培养真菌菌丝使用燕麦培养基；
(3)真菌的分离纯化：对采集到的样本组织进行清洗和表面消毒，将表面消毒后的植物组织块置于菌株分离培养基平板上，每皿3块组织块，每个样本5皿，于25℃培养逐日观察是否有菌丝长出，待菌丝从组织块部位长出后及时转接到纯化培养基上，获得纯化的真菌菌株；
(4)内生真菌的筛选：为排除致病性菌和腐生菌，根据菌落形态、产孢结构将步骤(3)所述的纯化的真菌菌株进行分组，每组随机取一株代表菌株进行致病性测定，具体步骤如下：
(a)将菌株接种于燕麦培养基，每皿3个菌块，培养7-14d，得到培养好的菌落备用；
(b)真菌致病性检测用宿主植物-西红柿种子经表面消毒、在纯琼脂培养基上催芽，待种子发成幼苗后移栽至培养好的菌落上；
(c)在每个菌落上分别移栽1株无菌西红柿幼苗，每皿3株苗，将培养皿放入组培瓶中，于温度为26℃、光照强度为1000-1200Lx和光照时间为16h/d的培养箱中共培养；每个菌株共接种12株西红柿幼苗，即每个菌株设4个重复；
(d)以未接种菌株、直接移栽的西红柿幼苗的处理为对照；
(e)14d后记录西红柿幼苗的发病情况，并将西红柿根部洗净后放入50℃烘箱中烘干至恒重后称量干重；
(f)对不表现病症、生物量与对照差异不显著的菌株处理进行再分离，确定再分离菌株是否为原接种菌株；
(5)内生真菌根部定殖观察：选取上述步骤(4)中无病症的西红柿幼苗进行根部切片和棉兰染色，在显微镜下观察根组织中的菌丝分布、颜色和形态，初步明确内生真菌的定殖情况。
在本发明中，作为进一步说明，所述的深色有隔内生真菌HS40的鉴定方法包括以下步骤：
(1)通过形态学观察，初步判断其分类地位；
(2)是挑取菌丝直接用于PCR反应，rRNA的ITS1-5.8S-ITS4-28S部分区域PCR扩增采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和LR5(5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′)；rRNA的18SrRNA区段PCR扩增采用引物NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)和NS4(5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′)，PCR反应体系：2×EasyTaq PCR SuperMix 25μL，20μmol/L正反引物各1μL，模板DNA 1μL，用ddH2O定容至50μL。
在本发明中，作为进一步说明，步骤(2)所述的PCR反应的条件为：依次在98℃下反应2min、在94℃下反应40s、在50℃下反应1min和在68℃下反应4min，30个循环，最后在72℃下反应10min。
在本发明中，作为进一步说明，深色有隔内生真菌HS40在促进铁皮石斛平皿培养苗生长上的应用。
在本发明中，作为进一步说明，深色有隔内生真菌HS40在促进铁皮石斛盆栽苗生长上的应用。
在本发明中，作为进一步说明，对在平皿培养中接种了HS40菌株的铁皮石斛苗，进行根部切片和棉兰染色，在显微镜下观察根组织中的菌丝分布、颜色和形态，以明确HS40菌株的定殖情况。
在本发明中，作为进一步说明，所述的棉兰染色所用的根部组织染色液由下述物质组成：质量分数为1％的棉蓝1mL，质量分数为50％的醋酸水溶液199mL。
在本发明中，作为进一步说明，所述的棉兰染色所用的真菌封入液由下述物质组成：固体苯酚20g，左旋乳酸16mL，甘油31mL，无菌水20mL。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明涉及的深色有隔内生真菌HS40菌株是首次发现的对铁皮石斛具有明显促生效果的广西北部湾红树植物内生真菌，填补了目前相关领域研究的空白。
(2)深色有隔内生真菌HS40菌株为广西优势红树植物内生真菌在铁皮石斛生产上的开发利用提供了资源保障。
【附图说明】
图1是HS40菌株菌落形态观察图；
图2是HS40菌株孢子结构观察图；
图3是基于HS40菌株及来自GenBank相似真菌的ITS1-5.8S rRNA-ITS2-28S rRNA基因序列构建的NJ系统发育树；
图4是基于HS40菌株及来自GenBank相似真菌的18S rRNA基因序列构建的NJ系统发育树；
图5是平皿培养铁皮石斛苗接种HS40菌株后长势对照；
图6是盆栽铁皮石斛苗接种HS40菌株后长势对照；
图7是HS40菌株在铁皮石斛根部的定殖情况。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例：
实施例1：
深色有隔内生真菌HS40的分离
(1)红树植物样品采集
在广西北海市山口国家红树林生态自然保护区选择具有一定规模红树林优势树种-木榄进行采样，采用五点采样法，每个点之间距离约2m，采集木榄根、茎、叶部组织，放入4℃冰盒暂时保存备用。
(2)培养基配制
菌株分离培养基使用1/2玉米粉培养基；纯化培养基使用麦芽汁培养基(麦芽提取物10.0g/L，酵母浸膏2.0g/L，玉米粉琼脂8.5g/L，琼脂7.5g/L)或马铃薯培养基(马铃薯200.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂15.0g/L)；宿主植物—西红柿种子催芽使用纯琼脂培养基；栽培西红柿以及培养真菌菌丝使用燕麦培养基(燕麦粉10.0g/L，琼脂14.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaNO3 1.0g/L)。
(3)真菌的分离纯化
对采集到的样本组织进行清洗和表面消毒。植物组织的表面消毒：75％乙醇振荡消毒10s，再用1％次氯酸钠振荡消毒1-5min(其中根3min，茎5min，叶1min)，用无菌水漂洗3次以上后放置于无菌滤纸上吸去多余水分，置于超净工作台上过夜，晾干；将表面消毒后的植物组织块置于1/2CM培养基平板上，每皿3块组织块，每个样本5皿，于25℃培养逐日观察是否有菌丝长出，待菌丝从组织块部位长出后及时转接到麦芽汁培养基(或马铃薯培养基)上，获得纯化的真菌菌株。
(4)内生真菌的筛选
为排除致病性菌和腐生菌，根据菌落形态、产孢结构将步骤(3)所分离菌株进行分组，每组随机取一株代表菌株用于致病性测定。将菌株接种于燕麦培养基，每皿3个菌块，培养7d后备用。真菌致病性检测用宿主植物-西红柿种子经表面消毒、在纯琼脂培养基上催芽，待种子发成幼苗后移栽至培养好的菌落上。在每个菌落上分别移栽1株无菌西红柿幼苗，每皿3株苗，将培养皿放入组培瓶中，于温度为26℃、光照强度为1000lx和光照时间为16h/d的培养箱中共培养；每个菌株共接种12株西红柿幼苗，即每个菌株设4个重复；以未接种菌株、直接移栽的西红柿幼苗的处理为对照。14d后记录西红柿幼苗的发病情况(0级：无发病症状；1级：植物黄化，长势稍差；2级：植物明显矮小黄化；3级：植物枯萎或死亡)，并将西红柿根部洗净后放入50℃烘箱中烘干至恒重后称量干重。对不表现病症、生物量与对照差异不显著的菌株处理进行再分离，确定再分离菌株是否为原接种菌株。
(5)内生真菌根部定殖观察
选取上述(4)中无病症的西红柿幼苗进行根部切片和棉兰染色，在显微镜下观察根组织中的菌丝分布、颜色和形态。初步明确内生真菌的定殖情况。染色剂：①根部组织染色液：质量分数为1％的棉蓝1mL，质量分数为50％的醋酸水溶液199mL；②真菌封入液：固体苯酚20g，左旋乳酸16mL，甘油31mL，无菌水20mL。
实施例2：
深色有隔内生真菌HS40的分离
(1)红树植物样品采集
在广西北海市山口国家红树林生态自然保护区选择具有一定规模红树林优势树种-木榄进行采样，采用五点采样法，每个点之间距离约2m，采集木榄根、茎、叶部组织，放入4℃冰盒暂时保存备用。
(2)培养基配制
菌株分离培养基使用1/2玉米粉培养基；纯化培养基使用麦芽汁培养基(麦芽提取物10.0g/L，酵母浸膏2.0g/L，玉米粉琼脂8.5g/L，琼脂7.5g/L)或马铃薯培养基(马铃薯200.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂15.0g/L)；宿主植物—西红柿种子催芽使用纯琼脂培养基；栽培西红柿以及培养真菌菌丝使用燕麦培养基(燕麦粉10.0g/L，琼脂14.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaNO3 1.0g/L)。
(3)真菌的分离纯化
对采集到的样本组织进行清洗和表面消毒。植物组织的表面消毒：75％乙醇振荡消毒20s，再用1％次氯酸钠振荡消毒1-5min(其中根3min，茎5min，叶1min)，用无菌水漂洗3次以上后放置于无菌滤纸上吸去多余水分，置于超净工作台上过夜，晾干；将表面消毒后的植物组织块置于1/2CM培养基平板上，每皿3块组织块，每个样本5皿，于25℃培养逐日观察是否有菌丝长出，待菌丝从组织块部位长出后及时转接到麦芽汁培养基(或马铃薯培养基)上，获得纯化的真菌菌株。
(4)内生真菌的筛选
为排除致病性菌和腐生菌，根据菌落形态、产孢结构将步骤(3)所分离菌株进行分组，每组随机取一株代表菌株用于致病性测定。将菌株接种于燕麦培养基，每皿3个菌块，培养10d后备用。真菌致病性检测用宿主植物-西红柿种子经表面消毒、在纯琼脂培养基上催芽，待种子发成幼苗后移栽至培养好的菌落上。在每个菌落上分别移栽1株无菌西红柿幼苗，每皿3株苗，将培养皿放入组培瓶中，于温度为26℃、光照强度为1100lx和光照时间为16h/d的培养箱中共培养；每个菌株共接种12株西红柿幼苗，即每个菌株设4个重复；以未接种菌株、直接移栽的西红柿幼苗的处理为对照。14d后记录西红柿幼苗的发病情况(0级：无发病症状；1级：植物黄化，长势稍差；2级：植物明显矮小黄化；3级：植物枯萎或死亡)，并将西红柿根部洗净后放入50℃烘箱中烘干至恒重后称量干重。对不表现病症、生物量与对照差异不显著的菌株处理进行再分离，确定再分离菌株是否为原接种菌株。
(5)内生真菌根部定殖观察
选取上述(4)中无病症的西红柿幼苗进行根部切片和棉兰染色，在显微镜下观察根组织中的菌丝分布、颜色和形态。初步明确内生真菌的定殖情况。染色剂：①根部组织染色液：质量分数为1％的棉蓝1mL，质量分数为50％的醋酸水溶液199mL；②真菌封入液：固体苯酚20g，左旋乳酸16mL，甘油31mL，无菌水20mL。
实施例3：
深色有隔内生真菌HS40的分离
(1)红树植物样品采集
在广西北海市山口国家红树林生态自然保护区选择具有一定规模红树林优势树种-木榄进行采样，采用五点采样法，每个点之间距离约2m，采集木榄根、茎、叶部组织，放入4℃冰盒暂时保存备用。
(2)培养基配制
菌株分离培养基使用1/2玉米粉培养基；纯化培养基使用麦芽汁培养基(麦芽提取物10.0g/L，酵母浸膏2.0g/L，玉米粉琼脂8.5g/L，琼脂7.5g/L)或马铃薯培养基(马铃薯200.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂15.0g/L)；宿主植物—西红柿种子催芽使用纯琼脂培养基；栽培西红柿以及培养真菌菌丝使用燕麦培养基(燕麦粉10.0g/L，琼脂14.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaNO3 1.0g/L)。
(3)真菌的分离纯化
对采集到的样本组织进行清洗和表面消毒。植物组织的表面消毒：75％乙醇振荡消毒30s，再用1％次氯酸钠振荡消毒1-5min(其中根3min，茎5min，叶1min)，用无菌水漂洗3次以上后放置于无菌滤纸上吸去多余水分，置于超净工作台上过夜，晾干；将表面消毒后的植物组织块置于1/2CM培养基平板上，每皿3块组织块，每个样本5皿，于25℃培养逐日观察是否有菌丝长出，待菌丝从组织块部位长出后及时转接到麦芽汁培养基(或马铃薯培养基)上，获得纯化的真菌菌株。
(4)内生真菌的筛选
为排除致病性菌和腐生菌，根据菌落形态、产孢结构将步骤(3)所分离菌株进行分组，每组随机取一株代表菌株用于致病性测定。将菌株接种于燕麦培养基，每皿3个菌块，培养14d后备用。真菌致病性检测用宿主植物-西红柿种子经表面消毒、在纯琼脂培养基上催芽，待种子发成幼苗后移栽至培养好的菌落上。在每个菌落上分别移栽1株无菌西红柿幼苗，每皿3株苗，将培养皿放入组培瓶中，于温度为26℃、光照强度为1200lx和光照时间为16h/d的培养箱中共培养；每个菌株共接种12株西红柿幼苗，即每个菌株设4个重复；以未接种菌株、直接移栽的西红柿幼苗的处理为对照。14d后记录西红柿幼苗的发病情况(0级：无发病症状；1级：植物黄化，长势稍差；2级：植物明显矮小黄化；3级：植物枯萎或死亡)，并将西红柿根部洗净后放入50℃烘箱中烘干至恒重后称量干重。对不表现病症、生物量与对照差异不显著的菌株处理进行再分离，确定再分离菌株是否为原接种菌株。
(5)内生真菌根部定殖观察
选取上述(4)中无病症的西红柿幼苗进行根部切片和棉兰染色，在显微镜下观察根组织中的菌丝分布、颜色和形态。初步明确内生真菌的定殖情况。染色剂：①根部组织染色液：质量分数为1％的棉蓝1mL，质量分数为50％的醋酸水溶液199mL；②真菌封入液：固体苯酚20g，左旋乳酸16mL，甘油31mL，无菌水20mL。
实施例4：
深色有隔内生真菌HS40的鉴定
(1)菌株的形态学观察
①将供试真菌菌株接种于麦芽汁培养基上，培养3周后观察菌落形态特征；②用无菌盖玻片斜插入燕麦培养基上，于培养基一侧接种供试真菌菌株，25℃培养2-4周，待明显看到菌丝着生在盖玻片上时，将玻片取出，于光学显微镜下进行观察菌丝和孢子生长情况。
HS40菌株菌落形态观察结果见图1，HS40菌株孢子结构形态观察结果见图2。
如图1所示：菌株在麦芽汁培养基上长速一般，25℃培养2周后菌落直径25mm左右，黄褐色至褐色，绒毡状，圆形。
如图2所示：菌丝浅黄褐色，有隔，直径1.4-4.0μm；分生孢子梗黄褐色，2-多个分隔，直立，不分枝，大小为23.2-154.2×2.2-5.5μm；分生孢子浅黄褐色至黄褐色，长条状、长棍棒状或长椭圆形，0-4个分隔，直径为8.3-60.2×1.8-3.6μm。上述特征与Zasmidium的形态特征基本相符。
(2)菌株的分子生物学鉴定
挑取CMMY平皿上的菌丝直接用于PCR反应，rRNA的ITS1-5.8S-ITS4-28S部分区域PCR扩增采用通用引物ITS1(5′-TCCG TAGGTGAACCTGCGG-3′)和LR5(5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′)；rRNA的18S rRNA区段PCR扩增采用引物NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)和NS4(5′-CTTC CGTC AATT CCTT TAAG-3′)，PCR反应体系：2×EasyTaq PCR SuperMix 25μL，20μmol/L正反引物各1μL，模板DNA1μL(挑取少量菌丝)，用ddH2O定容至50μL。PCR反应条件：依次在98℃下反应2min，在94℃下反应40s，在50℃下反应1min，在68℃下反应4min，30个循环；最后在72℃下反应10min。PCR产物纯化后直接测序，测序工作由华大基因科技服务有限公司完成。
实验获得的序列在GenBank中进行同源比对，下载最相似序列，使用Clustalx1.81和MEGA6.0软件基于Kimura双参数模型构建Neighbor-Joining系统发育树，经Bootstrap 1000次循环检验系统树的可靠性，结果见表1。
基于HS40菌株及来自GenBank相似真菌的ITS1-5.8S rRNA-ITS2-28S rRNA基因序列构建的NJ系统发育树和基于HS40菌株及来自GenBank相似真菌的18S rRNA基因序列构建的NJ系统发育树如图3和图4所示。
表1：
如图3和表1所示：基于HS40菌株及相似真菌ITS 1-5.8S rRNA-ITS2-28S rRNA基因序列构建的NJ系统发育树显示，HS40以99％的支持率和98％的序列相似性与Zasmidiumcitri聚为一类；
如图4和表1所示：基于18S rRNA基因序列构建的NJ系统发育树显示，HS40以99％的支持率和99％的序列相似性与Zasmidium citri griseum聚为一类。
结合形态学与分子生物学鉴定结果，将HS40定为球腔菌科(Mycosphaerellaceae)的Zasmidium sp.。
实施例5：
平皿试验：
将菌株HS40活化后接种于燕麦培养基(燕麦粉10g/L，琼脂18g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaNO3 1g/L)上，每皿接种3个菌块，待菌落长大后备用。选择株高和茁壮程度基本一致的无菌铁皮石斛幼苗移栽至菌落上，在每个菌落上分别移栽1株无菌铁皮石斛幼苗，每皿3株，将培养皿放入组培瓶中，于培养箱中共培养，培养温度为26℃，光照强度为1000-1200lx和光照时间为16h/d，60d后测量株高等生长指标。以未接种菌株为对照处理。每个处理4杯，设4个重复。
平皿培养结果见表2，平皿培养铁皮石斛苗接种HS40菌株后长势对照见图5。
表2：
株高(mm) 根长(cm) 茎径(mm) 鲜重(mg) 干重(mg)
HS40 56.67A 2.77 4.21 790.1 125.4A
CK 46.77B 2.50 3.28 735.0 52.1C
备注：1.同列数据后不同大写字母分别表示差异达1％极显著水平；2.上表仅列出HS40和对照的方差分析结果(共5个菌株和1个对照)。
如表2所示：接种该菌株的铁皮石斛苗株高、茎径、植株鲜重和干重分别较对照增加21.2％、28.4％、7.5％和140.7％,其中，株高和干重与对照差异均达极显著水平，说明内生真菌HS40对于平皿试验中铁皮石斛苗的生长具有明显的促进作用，也进一步说明了内生真菌HS40菌株是对铁皮石斛具有明显的促生效果的内生真菌。
实施例6：
盆栽试验：
(1)组培苗种植、养护：铁皮石斛组培苗为广西农业科学院花卉所选育的品质784。用水草种植铁皮石斛组培苗，5株/杯，共种植320杯；
(2)施菌方法：铁皮石斛苗种植30d时开始浇菌。设置20个处理(即包含HS40在内的19个菌株和对照CK)，每个处理4杯，4个重复(尽量选取生长较一致的杯苗为一个重复)，一个处理16杯。设4个重复。施菌方法：浇20ml/杯，间隔15d再浇一次，共浇3次。另以未浇菌液为对照处理；
(3)生长指标测定：第一次浇菌后180d取样，调查不同处理铁皮石斛盆栽苗成活率，记录株高、茎径、根长、并测定鲜重、干重、叶片生长素IAA、茎干多糖含量等相关生长指标；
(4)统计分析：采用Excel 2003和DPS 6.55软件进行分析，试验数据以平均值±标准误表示。
盆栽试验结果见表3，盆栽铁皮石斛苗接种HS40菌株后长势对照见图6，HS40菌株在铁皮石斛根部定殖情况见图7。
表3：
备注：1.同列数据后不同大小写字母分别表示差异达1％极显著水平和5％显著水平。2.上图仅列出HS40和对照的方差分析结果(共20个菌株和1个对照)。
如表3所示，该菌株处理的铁皮石斛盆栽苗分蘖数、植株鲜重、植株干重和茎干多糖含量分别较对照增加400.0％、94.8％、56.8％、15.8％，其中分蘖数与对照差异达显著水平，鲜重、干重和茎干多糖含量则分别达到极显著水平，说明HS40不仅可以促进铁皮石斛盆栽苗的生长，还可以提高铁皮石斛有效成分(多糖)含量，进而提高其品质。测定吲哚乙酸(IAA)含量发现，接种该菌株的铁皮石斛叶片内IAA含量比对照高16.2％，差异达极显著水平，说明HS40可促进铁皮石斛叶片IAA的合成，进而促进铁皮石斛生长与发育；也进一步说明了内生真菌HS40菌株是对铁皮石斛具有明显的促生效果的内生真菌。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院微生物研究所
<120> 深色有隔内生真菌HS40及其在铁皮石斛上的应用
<130> ZP17101962/WSW
<141> 2017-08-30
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(zasmidium sp.)
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(zasmidium sp.)
<400> 2
tcctgaggga aacttcg 17
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(zasmidium sp.)
<400> 3
gtagtcatat gcttgtctc 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(zasmidium sp.)
<400> 4
cttccgtcaa ttcctttaag 20

Claims (7)

1.深色有隔内生真菌HS40在铁皮石斛生产上的应用，其特征在于：包括深色有隔内生真菌HS40在促进铁皮石斛平皿培养苗生长上的应用和深色有隔内生真菌HS40在促进铁皮石斛盆栽苗生长上的应用；
所述的深色有隔内生真菌HS40的保藏编号为CGMCC NO.14345。
2.根据权利要求1所述的深色有隔内生真菌HS40在铁皮石斛生产上的应用，其特征在于：所述的深色有隔内生真菌HS40的分离包括以下步骤：
（1）样品采集：选择红树林优势树种-木榄进行采样，采用五点采样法采集木榄根、茎、叶部组织，放入4℃的冰盒中保存备用；
（2）培养基的配置：菌株分离培养基使用1/2玉米粉培养基；纯化培养基使用麦芽汁培养基或马铃薯培养基；宿主植物-西红柿种子催芽使用纯琼脂培养基；栽培西红柿以及培养真菌菌丝使用燕麦培养基；
（3）真菌的分离纯化：对采集到的样本组织进行清洗和表面消毒，将表面消毒后的植物组织块置于菌株分离培养基平板上，每皿3 块组织块，每个样本5皿，于25℃培养逐日观察是否有菌丝长出，待菌丝从组织块部位长出后及时转接到纯化培养基上，获得纯化的真菌菌株；
（4）内生真菌的筛选：为排除致病性菌和腐生菌，根据菌落形态、产孢结构将步骤（3）所述的纯化的真菌菌株进行分组，每组随机取一株代表菌株进行致病性测定，具体步骤如下：
（a）将菌株接种于燕麦培养基，每皿3个菌块，培养7−14d，得到培养好的菌落备用；
（b）真菌致病性检测用宿主植物-西红柿种子经表面消毒、在纯琼脂培养基上催芽，待种子发成幼苗后移栽至培养好的菌落上；
（c）在每个菌落上分别移栽1株无菌西红柿幼苗，每皿3株苗，将培养皿放入组培瓶中，于温度为26℃、光照强度为1000-1200Lx和光照时间为16h/d的培养箱中共培养；每个菌株共接种12株西红柿幼苗，即每个菌株设4个重复；
（d）以未接种菌株、直接移栽的西红柿幼苗的处理为对照；
（e）14d后记录西红柿幼苗的发病情况，并将西红柿根部洗净后放入50℃烘箱中烘干至恒重后称量干重；
（f）对不表现病症、生物量与对照差异不显著的菌株处理进行再分离，确定再分离菌株是否为原接种菌株；
（5）内生真菌根部定殖观察：选取上述步骤（4）中无病症的西红柿幼苗进行根部切片和棉兰染色，在显微镜下观察根组织中的菌丝分布、颜色和形态，初步明确内生真菌的定殖情况。
3.根据权利要求1所述的深色有隔内生真菌HS40在铁皮石斛生产上的应用，其特征在于：所述的深色有隔内生真菌HS40的鉴定方法包括以下步骤：
（1）通过形态学观察，初步判断其分类地位；
（2）是挑取菌丝直接用于PCR反应，rRNA的ITS1-5.8S-ITS4-28S部分区域PCR扩增采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和LR5(5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′)；rRNA的18SrRNA区段PCR扩增采用引物NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)和NS4(5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′)，PCR反应体系：2×EasyTaq PCR SuperMix 25μL，20μmol/L正反引物各1μL，模板DNA 1μL，用ddH2O定容至50μL。
4.根据权利要求3所述的深色有隔内生真菌HS40在铁皮石斛生产上的应用，其特征在于：步骤（2）所述的PCR反应的条件为：依次在98℃下反应2 min、在94℃下反应40s、在50℃下反应1min和在68℃下反应4min，30个循环，最后在72℃下反应10min。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的深色有隔内生真菌HS40在铁皮石斛生产上的应用，其特征在于：对在平皿培养中接种了HS40菌株的铁皮石斛苗，进行根部切片和棉兰染色，在显微镜下观察根组织中的菌丝分布、颜色和形态，以明确HS40菌株的定殖情况。
6.根据权利要求5所述的深色有隔内生真菌HS40在铁皮石斛生产上的应用，其特征在于：所述的棉兰染色所用的根部组织染色液由下述物质组成：质量分数为1%的棉蓝1mL，质量分数为50%的醋酸水溶液199mL。
7.根据权利要求5所述的深色有隔内生真菌HS40在铁皮石斛生产上的应用，其特征在于：所述的棉兰染色所用的真菌封入液由下述物质组成：固体苯酚20g，左旋乳酸 16mL，甘油31mL，无菌水20mL。
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