CN101822211A - 云南铁皮石斛的一种组织培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及云南铁皮石斛的一种组织培育方法，选择采自生长在云南的野生铁皮石斛优质成株，外植体为生长健壮的休眠芽和成熟的果实。主要试剂用大量元素和微量元素以及铁盐、肌醇、甘氨酸、脯氨酸、各种维生素、植物激素。在温度为25℃±2，光照时间为12小时，光照强度为1000～2000μM m^-2s^-1条件下培养。打破了常规育苗受繁殖材料、季节、场地等的限制。本发明的方法可确保种苗品质的一致性，确保铁皮石斛中药材优质种源。解决了铁皮石斛原球茎分化率低、增殖低，试管苗长势弱的瓶颈难题。具有生长周期短、生产成本低、品质好、可规模化生产种苗的特点。

Description

云南铁皮石斛的一种组织培育方法

技术领域

本发明涉及云南铁皮石斛的一种组织培育方法。

背景技术

铁皮石斛是传统名贵中药材，具有2000多年的药用历史，原植物为兰科石斛属铁皮石斛(Dendrobium officinale)。被列入《濒危野生动植物国际贸易公约》濒危植物后，我国对采挖、收购、经营石斛进行了严格限制和管理，野生的药用石斛资源稀少、生长慢，已逐渐成为濒临消亡的珍稀濒危物种。现有的人工种植因规模小、产量低，根本不能满足市场需求，因此价格昂贵原料极其紧缺，出现大量的假冒铁皮石斛。由于铁皮石斛原球茎分化率低、增殖系数低、繁殖时间长、生产成本高等问题，限制了铁皮石斛试管苗生产和发展；导致了种植市场的铁皮石斛种苗全部为种子生产实生苗，需要不断采集野生资源的果实，使其野生资源逐年减少濒临灭绝；而且种子生产实生苗有性繁殖还存在：品种杂，变异大，产品标准不规范，品质无法保证。为此，解决铁皮石斛原球茎分化率低、增殖系数低、繁殖时间长、试管苗生产成本高等技术瓶颈，成为当务之急。

发明内容

本发明的目的是提供云南铁皮石斛的一种组织培育方法，该方法利用组织培养的技术原理，选择铁皮石斛优质外植体，进行无性繁殖；攻克了铁皮石斛原球茎分化率低、增殖系数低、繁殖时间长、试管苗生产成本高的瓶颈难题。为铁皮石斛资源可持续利用和发展、确保中药材种植市场种苗供应，满足铁皮石斛原料需求，实现物种资源保护、再生，及可持续利用和发展提供了有效的方法。

本发明的技术方案如下：

一、快繁技术

材料：经过铁皮石斛多糖含量分析后，选择含量高优质植株外植体，建立单株无菌体系，确保种苗品质的一致性，确保铁皮石斛优质种源。

1)对外植体消毒：

取健状植株外植体冲洗1小时——75％乙醇擦植株——放到超净工作台上按以下步骤操作：用0.1％升汞液浸泡10-15min，放入装有无菌水的瓶子摇洗6次，用消毒镊子取出在用消毒刀片先切芽头部分，然后顺着芽头往下0.5公分切下，切面成正圆形，将切面向下沿瓶边插入MS培养基中，每瓶放一株外植体。盖紧瓶盖，用保鲜袋封好瓶口。

2)组培：

①培养基配制：以MS为基本培养基，根据组培目的，附加不同浓度的植物激素(如：Naphthalene acetc acid，6-benzyladenine，kinetin，Indole-3-butyric acid，Indole-3-actic acid，adenine)蔗糖10～30g/L、琼脂粉6.0-8.0g/L、PH值＝5.6--6.4，生根培养基中加入活性炭1g/L。配制过程按照常规方法，培养瓶为玻璃瓶或透明塑料瓶。灭菌采用121℃灭菌30分钟高压湿热灭菌。

②组培条件：组培室温度25℃、置于光照培养箱中，在温度为25℃±2，光照时间为12小时，光照强度为1000～2000μM m^-2 s^-1条件下培养。

本发明的有益效果：

优选多糖含量高的优质植株为外植体进行单株组培，可确保种苗品质的一致性，确保铁皮石斛中药材优质种源。诱导出的原球茎分化率为100％，增殖系数为6-10倍以上，有效缩短生长周期，降低了生产成本。原球茎分化小苗和继代培养：将原球茎分化小苗，转接到壮苗、生根培养基中培养，生根达3-5厘米。逐步开盖炼苗5-7天后，大田种植的适应性强，成活率达95％以上，解决了组培试管苗增殖系数低、繁殖时间长、生产成本高的技术难题。

用铁皮石斛种子进行有性繁殖种苗，容易出现退化变异，而且品种杂、质量不稳定。利用多糖含量高的铁皮石斛优质植株为外植体进行单株组培，在一年内即可培育三批组培试管苗，确保了种苗品质。此发明创造技术与现有其他技术相比，具有生长周期短、生产成本低、品质好、可规模化生产种苗的特点。有利于铁皮石斛物种资源可持续利用和发展。

具体实施方式

实施例1：外植体培养

健壮的铁皮石斛休眠芽，经酒精、升汞消毒后，接种到含有生长素、细胞分裂素和200ml/L椰汁、3％活性炭的MS蔗糖琼脂培养基上，在光照培养室中培养2~3周后大部分都能萌发长出新芽，在NAA0.5mg/L+6-BA 1.0-2.0mg/L的培养基中都有较高的萌发率和良好的生长，2个月后，苗高达1.5cm-3.0cm。

实施例2：原球茎诱导及其培养

利用已经建立了无菌体系的组培苗，把茎切成小段继续诱导分化原球茎，在0.2-0.5mg/L NAA和1.0-2.0mg/L 6-BA激素范围，添加100ml/L椰汁的MS蔗糖琼脂培养基上，置于光照培养室中培养1个月后，从母体周围长出原球茎，分化频率为100％，增殖系数为10倍以上。按此方法每1个月继代培养，每个芽的年增殖系数理论上为1.0×10¹⁰以上。

实施例3：侧芽分化及其继代培养

将上述小苗剪成1~2cm长短的带叶茎段，接种在含生长素0.2-0.8mg/L NAA、细胞分裂素1.0-2.5mg/L BA、100ml/L椰汁的MS蔗糖琼脂培养基上，在光照培养箱中培养1个半月后，从茎段叶腋处长出腋芽，分化频率为100％，增殖系数为2倍以上。按此方法每1个半月继代培养，每个芽的年增殖系数理论上为1.9×10⁴以上。

实施例4：不定根诱导及炼苗

选取生长良好的无根苗，转接到含0.5-1.0mg/L IAA、0.5-1.0mg/L NAA、活性炭0.3％的生根培养基上，在光照培养室中培养约1个月后，小苗基部或紧靠培养基的茎上长出3-5条的不定根，生根诱导频率为98％左右，将生根苗移栽到细树皮碎砖块基质中炼苗，约4周后即可定植，几乎所有苗都能移栽成活，良好生长。

Claims (3)

1.云南铁皮石斛的一种组织培育方法，其特征是包括：

材料：选择采自生长在云南的野生铁皮石斛优质成株，外植体为生长健壮的休眠芽和成熟的果实。

主要试剂：大量元素和微量元素以及铁盐、肌醇、甘氨酸、脯氨酸、各种维生素、植物激素。

组培条件：在温度为25℃±2，光照时间为12小时，光照强度为1000～2000μM m^-2s^-1条件下培养；

2.云南铁皮石斛的一种组织培育方法，其特征为步骤如下：

1.2.1培养基配制

基础培养基组分为MS(Murashige和Skoog，1962)培养基，碳源为1~3％蔗糖，支撑物为0.6-0.8％琼脂，pH为5.4~5.6，生根培养基中加入活性炭1g/L，根据不同的培养目的加入不同种类、不同的外源植物激素。

配制过程按照常规方法，培养瓶为玻璃瓶或透明塑料瓶。灭菌采用121℃灭菌30分钟高压湿热灭菌。

1.2.2外植体培养

取健壮铁皮石斛休眠芽，用75％的乙醇表面消毒1-3分钟，再用0.1％的升汞消毒10-15分钟，灭菌蒸馏水洗三次，每次10分钟。然后，将消毒的外植体接种萌发培养基上，置于光照培养箱中，在温度为25℃±2，光照时间为12小时，光照强度为90μM m^-2s^-1条件下培养。

1.2.3侧芽分化及继代

将萌发的小苗剪成1~2cm长短的带叶茎段，接种在不定芽分化和继代培养基中，在温度为25℃±2，光照时间为14小时，光照强度为100μM m^-2s^-1条件下培养。

1.2.4原球茎诱导

把无菌茎段切成小块，接种在诱导分化原球茎的培养基上，在温度为25℃±2，光照时间为14小时，光照强度为100μM m^-2s^-1条件下培养。

1.2.5不定根诱导

选取生长健壮、高度为1.5-3.0cm的无根苗，转接到生根培养基中，置于光照培养箱中，在温度为25℃±2，光照时间为10小时，光照强度为110μM^-2s^-1条件下培养。

3.云南铁皮石斛的一种组织培育方法，其特征为具体炼苗方法：

将获得的再生小苗在自然光照、温度条件下放置5-8天后，从生根培养基中取出再生小苗，用自来水洗去培养基。然后，将小苗移栽至树皮和砖块(按4∶1混合)基质上，并将其转移至温室中炼苗，前3~5天根据天气、温度、基质湿度情况，制定合适的浇水方案，保持温室的光照强度为200μMm^-2s^-1，气温为20-28℃，相对湿度为70-100％。