CN106561456B - 一种海伦兜兰无菌播种快速繁殖方法 - Google Patents

一种海伦兜兰无菌播种快速繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种海伦兜兰无菌播种快速繁殖方法。本发明以合适胚龄的种子作为外植体，在独特的培养基上进行无菌播种、原球茎的分化、原球茎的增殖和壮苗培养，在短时间内生产出大量优质的海伦兜兰种苗。本发明的方法具有种子萌发率高、出苗快、种苗品质好等优点，海伦兜兰种苗可用于供应市场并应用于迁地保护和自然回归，有利于海伦兜兰的资源保护和可持续利用。

Description

一种海伦兜兰无菌播种快速繁殖方法
技术领域：
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种海伦兜兰无菌播种快速繁殖方法。
背景技术：
海伦兜兰(Paphiopedilum helenae Aver.)，分布于我国广西西部和越南北部，观赏价值高。由于其生境的破坏和人工的过度采挖，其野生植物数量已极为稀少，被《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)列入附录I而禁止交易，也被世界自然保护联盟(IUCN)红色名录中列为极危物种(CR)亟待保护，在中国也已被中国国家林业局列为极小种群野生植物需要重点保护。进行海伦兜兰的资源保护，繁殖足够多的种苗是关键。海伦兜兰的常规繁殖可采用分株，但繁殖速度慢，繁殖率低；而在野外，海伦兜兰难结实，即使结果种子萌发率也极低；同时，兜兰在组织培养时，由于外植体去污难、易褐化及增殖速度慢等原因，其组织培养难度也极大。
发明内容：
本发明的目的是提供一种海伦兜兰无菌播种快速繁殖方法，从而进行海伦兜兰的规模化繁殖。
本发明的海伦兜兰无菌播种快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、人工授粉和种子的获得：选择生长健壮的海伦兜兰(Paphiopedilum helenaeAver.)母株进行异株人工授粉，选择授粉后120～180天的粉末状种子作为外植体进行无菌播种；
b、外植体消毒和无菌播种：将授粉后120～180天的蒴果进行消毒处理，切开果实，将粉末状种子接种到种子萌发培养基上培养，培养温度25℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照时间12～16小时/天，胚萌发形成原球茎；所述的种子萌发培养基为：每升含有椰子汁50～100毫升、萘乙酸0.1～0.5毫克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖30克、琼脂6～7克，其余为1/4MS培养基，pH 5.8～6.0；
c、类原球茎的分化：将类原球茎接种到分化培养基上培养，培养温度25℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照时间12～16小时/天，类原球茎分化出小苗；所述的分化培养基为：每升含有6-苄基腺嘌呤0.2～1.0毫克、萘乙酸1.0～2.0毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖30克、琼脂6～7克，其余为1/2MS培养基，pH5.8～6.0；
d、壮苗培养：将小苗接种到壮苗培养基上培养，培养温度25℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照时间12～16小时/天，获得完整植株；所述的壮苗培养基为：每升含有花宝1号1～2克、花宝2号1～2克、MS培养基的维生素和肌醇成分、萘乙酸1.0～2.0毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、香蕉匀浆50～150克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖30克、琼脂6～7克，余量为水，pH 5.8～6.0；
e、试管苗移栽：将完整植株在自然光下炼苗10～15天，然后取出植株洗净根部的培养基，移栽到植金石、松树皮和泥炭土按质量比2～3:2～3:1混合的栽培基质中培养获得海伦兜兰种苗；
在所述的步骤b和步骤c之间还包括以下步骤：
1)类原球茎的诱导和增殖：将步骤b得到的原球茎接种到类原球茎的诱导和增殖的培养基上培养，培养温度25℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照时间12～16小时/天，获得类原球茎，将类原球茎接种到新的类原球茎的诱导和增殖的培养基上进行增殖培养，培养温度25℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照时间12～16小时/天，类原球茎大量增殖；所述的类原球茎的诱导和增殖的培养基为：每升含有6-苄基腺嘌呤5.0～10.0毫克、激动素5.0～10.0毫克、萘乙酸1.0～2.0毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、蔗糖30克、琼脂6～7克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0。
步骤b所述的将授粉后120～180天的蒴果进行消毒处理具体为：将蒴果用体积分数70％～80％的酒精浸泡30～60秒后，用质量分数0.1％～0.2％的升汞溶液消毒10～20分钟，无菌水漂洗4～5次。
MS培养基为国际通用的培养基，其成分和配制方法参看文献(谭文澄、戴策刚主编.观赏植物组织培养技术.北京：中国林业出版社，1991.)；1/2MS培养基是指将MS培养基中大量元素用量为原来的1/2，其余成份不变；1/4MS培养基是指将MS培养基中大量元素用量为原来的1/4，其余成份不变。所述的MS培养基、1/2MS培养基、1/4MS培养基都为液体培养基，不含有琼脂。
本发明以合适胚龄的种子作为外植体，在独特的培养基上进行无菌播种、原球茎的分化和壮苗培养，在短时间内生产出大量优质的海伦兜兰种苗，同时利用类原球茎的增殖可以进行原球茎的大量增殖。本发明的方法具有种子萌发率高、出苗快、种苗品质好等优点，海伦兜兰种苗可用于供应市场并应用于迁地保护和自然回归，有利于海伦兜兰的资源保护和可持续利用。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
(1)人工授粉和种子的获得
在迁地保护温室中选择引种驯化成功的生长健壮的海伦兜兰(Paphiopedilumhelenae Aver.)母株进行异株人工授粉。授粉时间选择在花朵完成展开后的1天。授粉时去掉花朵的唇瓣便于操作，采用消毒的牙签挑取花粉粒粘在另一株花的柱头上。随后挂牌记录授粉日期。海伦兜兰人工授粉成功率95％。然后选择授粉后120天的粉末状种子为外植体进行无菌播种。
(2)外植体消毒和无菌播种
将授粉后120天的蒴果用体积分数70％的酒精浸泡30秒，再用质量分数0.1％的升汞溶液消毒20分钟，无菌水漂洗4次后切开果实，将粉末状种子接种到种子萌发培养基上培养，培养温度25℃，光照度1500勒克斯(lux)，光照时间12小时/天，60天胚萌发形成原球茎，萌发率30％。所述的种子萌发培养基为：每升含有椰子汁50毫升、萘乙酸(NAA)0.1毫克、活性炭(AC)1.0克、蔗糖30克、琼脂6克，其余为1/4MS培养基，pH 5.8，其配制方法是将50毫升椰子汁、0.1毫克萘乙酸、1.0克活性炭、30克蔗糖和6克琼脂，加到少量1/4MS培养基(液体)中，然后用1/4MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(3)类原球茎的诱导和增殖
将原球茎接种到类原球茎的诱导和增殖的培养基上培养，培养温度25℃，光照度1500勒克斯(lux)，光照12小时/天，3个月能诱导出类原球茎。将类原球茎接种到新的类原球茎的诱导和增殖的培养基上进行增殖培养，培养温度25℃，光照度1500勒克斯(lux)，光照时间12小时/天，继代周期3个月，增殖率为2倍。所述的类原球茎的诱导和增殖的培养基为：每升含有6-苄基腺嘌呤(6-BA)5.0毫克、激动素(KT)5.0毫克、萘乙酸(NAA)1.0毫克、椰子汁100毫升、蛋白胨1.0克、蔗糖30克、琼脂6克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8，其配制方法是将5.0毫克6-苄基腺嘌呤、5.0毫克激动素、1.0毫克萘乙酸、100毫升椰子汁、1.0克蛋白胨、30克蔗糖和6克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(4)类原球茎的分化
将类原球茎接种到分化培养基上培养，培养温度25℃，光照度1500勒克斯(lux)，光照时间12小时/天，3个月能分化出小苗。所述的分化培养基为：每升含有6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.2毫克、萘乙酸(NAA)1.0毫克、椰子汁100毫升、蛋白胨1.0克、活性炭(AC)1.0克、蔗糖30克、琼脂6克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8，其配制方法是将100毫升椰子汁、0.2毫克6-苄基腺嘌呤、1.0毫克萘乙酸、1.0克蛋白胨、1.0克活性炭、30克蔗糖和6克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(5)壮苗培养
将1-2cm的小苗接种到壮苗培养基上培养，培养温度25℃，光照度1500勒克斯(lux)，光照时间12小时/天，3个月能形成株高3厘米高的完整植株。采用标准兰花培养瓶，每瓶20株。所述的壮苗培养基为：每升含有花宝1号1克、花宝2号1克、MS培养基的维生素和肌醇成分(盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5毫克、盐酸硫胺素(维生素B1)0.1毫克、烟酸0.5毫克、甘氨酸2毫克和肌醇100毫克)、萘乙酸(NAA)1.0毫克、椰子汁100毫升、蛋白胨1克、香蕉匀浆50克、活性炭(AC)1.0克、蔗糖30克、琼脂6克，余量为水，pH 5.8，其配制方法是将1克花宝1号、1克花宝2号、MS培养基的维生素和肌醇成分(盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5毫克、盐酸硫胺素(维生素B1)0.1毫克、烟酸0.5毫克、甘氨酸2毫克和肌醇100毫克)、1.0毫克萘乙酸、100毫升椰子汁、1克蛋白胨、50克香蕉匀浆、1.0克活性炭、30克蔗糖和6克琼脂，加入到适量的水中，然后用水补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(6)试管苗移栽
将具株高3厘米高的完整植株从培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗15天，然后将玻璃瓶中敲碎，洗净根部的培养基，整瓶苗种植于一个装有栽培基质的3.7寸白色塑料杯中。栽培基质为植金石(日本进口)、松树皮和泥炭土(以色列进口)按质量比为2:2:1混合均匀。保持适当通风和足够的湿度，由此得到种苗，移栽的成活率均可达95％。一年后要以3株为一盆种植于2.7寸白色塑料杯中。
实施例2：
(1)人工授粉和种子的获得
在迁地保护温室中选择引种驯化成功的生长健壮的海伦兜兰(Paphiopedilumhelenae Aver.)母株进行异株人工授粉。授粉时间选择在花朵完成展开后的3天。授粉时去掉花朵的唇瓣便于操作，采用消毒的牙签挑取花粉粒粘在另一株花的柱头上。随后挂牌记录授粉日期。海伦兜兰人工授粉成功率100％。然后选择授粉后150天的粉末状种子为外植体进行无菌播种。
(2)外植体消毒和无菌播种
将授粉后150天的蒴果用体积分数75％的酒精浸泡45秒，再用质量分数0.15％的升汞溶液消毒15分钟，无菌水漂洗5次后切开果实，将粉末状种子接种到种子萌发培养基上培养，培养温度28℃，光照度1800勒克斯(lux)，光照时间14小时/天，30天胚萌发形成原球茎，萌发率50％。所述的种子萌发培养基为：每升含有椰子汁75毫升、萘乙酸(NAA)0.3毫克、活性炭(AC)1.5克、蔗糖30克、琼脂6.55克，其余为1/4MS培养基，pH 5.9，其配制方法是将75毫升椰子汁、0.3毫克萘乙酸、1.5克活性炭、30克蔗糖和6.55克琼脂，加到少量1/4MS培养基(液体)中，然后用1/4MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(3)类原球茎的诱导和增殖
将原球茎接种到类原球茎的诱导和增殖的培养基上培养，培养温度28℃，光照度1800勒克斯(lux)，光照时间14小时/天，2个月能诱导出类原球茎。将类原球茎接种到新的类原球茎的诱导和增殖的培养基上进行增殖培养，培养温度28℃，光照度1800勒克斯(lux)，光照时间14小时/天，继代周期2个月，类原球茎大量增殖，增殖率为3倍。所述的类原球茎的诱导和增殖的培养基为：每升含有6-苄基腺嘌呤(6-BA)7.5毫克、激动素(KT)7.5毫克、萘乙酸(NAA)1.5毫克、椰子汁150毫升、蛋白胨1.5克、蔗糖30克、琼脂6.55克，其余为1/2MS培养基，pH 5.9，其配制方法是将7.5毫克6-苄基腺嘌呤、7.5毫克激动素、1.5毫克萘乙酸、150毫升椰子汁、1.5克蛋白胨、30克蔗糖和6.55克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(4)类原球茎的分化
将类原球茎接种到分化培养基上培养，培养温度28℃，光照度1800勒克斯(lux)，光照时间14小时/天，2个月能分化出小苗。所述的分化培养基为：每升含有6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.6毫克、萘乙酸(NAA)1.5毫克、椰子汁150毫升、蛋白胨1.5克、活性炭(AC)1.5克、蔗糖30克、琼脂6.55克，其余为1/2MS培养基，pH 5.9，其配制方法是将0.6毫克6-苄基腺嘌呤、1.5毫克萘乙酸、150毫升椰子汁、1.5克蛋白胨、1.5克活性炭、30克蔗糖和6.55克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(5)壮苗培养
将2cm的小苗接种到壮苗培养基上培养，培养温度28℃，光照度1800勒克斯(lux)，光照时间14小时/天，2个月能形成株高4厘米高的完整植株。采用标准兰花培养瓶，每瓶23株。所述的壮苗培养基为：每升含有花宝1号1.5克、花宝2号1.5克、MS培养基的维生素和肌醇成分(盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5毫克、盐酸硫胺素(维生素B1)0.1毫克、烟酸0.5毫克、甘氨酸2毫克和肌醇100毫克)、萘乙酸(NAA)1.5毫克、椰子汁150毫升、蛋白胨1.5克、香蕉匀浆100克、活性炭1.5克、蔗糖30克、琼脂6.55克，余量为水，pH 5.9，其配制方法是将1.5克花宝1号、1.5克花宝2号、MS培养基的维生素和肌醇成分(盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5毫克、盐酸硫胺素(维生素B1)0.1毫克、烟酸0.5毫克、甘氨酸2毫克和肌醇100毫克)、1.5毫克萘乙酸、150毫升椰子汁、1.5克蛋白胨、100克香蕉匀浆、1.5克活性炭、30克蔗糖和6.55克琼脂，加入到适量的水中，然后用水补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(6)试管苗移栽
将具株高4厘米高的完整植株从培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗12天，然后将玻璃瓶中敲碎，洗净根部的培养基，整瓶苗种植于一个装有栽培基质的3.7寸白色塑料杯中。栽培基质为植金石(日本进口)、松树皮和泥炭土(以色列进口)按质量比为3:2:1混合均匀。保持适当通风和足够的湿度，由此得到种苗，移栽的成活率均可达100％。一年后要以2株为一盆种植于2.7寸白色塑料杯中。
实施例3：
(1)人工授粉和种子的获得
在迁地保护温室中选择引种驯化成功的生长健壮的海伦兜兰(Paphiopedilumhelenae Aver.)母株进行异株人工授粉。授粉时间选择在花朵完成展开后的6天。授粉时去掉花朵的唇瓣便于操作，采用消毒的牙签挑取花粉粒粘在另一株花的柱头上。随后挂牌记录授粉日期。海伦兜兰人工授粉成功率85％。然后选择授粉后180天的粉末状种子为外植体进行无菌播种。
(2)外植体消毒和无菌播种
将授粉后180天的蒴果用体积分数80％的酒精浸泡30秒，再用质量分数0.2％的升汞溶液消毒10分钟，无菌水漂洗5次后切开果实，将粉末状种子接种到种子萌发培养基上培养，培养温度30℃，光照度2000勒克斯(lux)，光照时间16小时/天，45天胚萌发形成原球茎，萌发率40％。所述的种子萌发培养基为：每升含有椰子汁100毫升、萘乙酸(NAA)0.5毫克、活性炭(AC)2克、蔗糖30克、琼脂7克，其余为1/4MS培养基，pH6.0，其配制方法是将100毫升椰子汁、0.5毫克萘乙酸、2克活性炭、30克蔗糖和7克琼脂，加到少量1/4MS培养基(液体)中，然后用1/4MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(3)类原球茎的诱导和增殖
将原球茎接种到类原球茎的诱导和增殖的培养基上培养，培养温度30℃，光照度2000勒克斯(lux)，光照16小时/天，75天能诱导出类原球茎。将类原球茎接种到新的类原球茎的诱导和增殖的培养基上进行增殖，培养温度30℃，光照度2000勒克斯(lux)，光照时间16小时/天，继代周期为75天，类原球茎大量增殖，增殖率为2.5倍。所述的类原球茎的诱导和增殖的培养基为：每升含有6-苄基腺嘌呤(6-BA)10.0毫克、激动素(KT)10.0毫克、萘乙酸(NAA)2.0毫克、椰子汁200毫升、蛋白胨2克、蔗糖30克、琼脂7克，其余为1/2MS培养基，pH6.0，其配制方法是将10.0毫克6-苄基腺嘌呤、10.0毫克激动素、2.0毫克萘乙酸、200毫升椰子汁、2克蛋白胨、30克蔗糖和7克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(4)类原球茎的分化
将类原球茎接种到分化培养基上培养，培养温度30℃，光照度2000勒克斯(lux)，光照时间16小时/天，75天能分化出小苗。所述的分化培养基为：每升含有6-苄基腺嘌呤(6-BA)1.0毫克、萘乙酸(NAA)2.0毫克、椰子汁200毫升、蛋白胨2.0克、活性炭(AC)2.0克、蔗糖30克、琼脂7克，其余为1/2MS培养基，pH 6.0，其配制方法是将1.0毫克6-苄基腺嘌呤、2.0毫克萘乙酸、200毫升椰子汁、2.0克蛋白胨、2.0克活性炭、30克蔗糖和7克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(5)壮苗培养
将1.5cm的小苗接种到壮苗培养基上培养，培养温度30℃，光照度2000勒克斯(lux)，光照时间16小时/天，75天能形成株高5厘米高的完整植株。采用标准兰花培养瓶，每瓶20株。所述的壮苗培养基为：每升含有花宝1号2克、花宝2号2克、MS培养基的维生素和肌醇成分(盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5毫克、盐酸硫胺素(维生素B1)0.1毫克、烟酸0.5毫克、甘氨酸2毫克和肌醇100毫克)、萘乙酸(NAA)2.0毫克、椰子汁200毫升、蛋白胨2.0克、香蕉匀浆150克、活性炭(AC)2.0克、蔗糖30克、琼脂7克，余量为水，pH 6.0，其配制方法是将2克花宝1号、2克花宝2号、MS培养基的维生素和肌醇成分(盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5毫克、盐酸硫胺素(维生素B1)0.1毫克、烟酸0.5毫克、甘氨酸2毫克和肌醇100毫克)、2.0毫克萘乙酸、200毫升椰子汁、2.0克蛋白胨、150克香蕉匀浆、2.0克活性炭、30克蔗糖和7克琼脂，加入到适量的水中，然后用水补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(6)试管苗移栽
将具株高5厘米高的完整植株从培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗10天，然后将玻璃瓶中敲碎，洗净根部的培养基，整瓶苗种植于一个装有栽培基质的3.7寸白色塑料杯中。栽培基质为植金石(日本进口)、松树皮和泥炭土(以色列进口)按质量比为3:3:1混合均匀。保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达98％。一年后要以2株为一盆种植于2.7寸白色塑料杯中。

Claims (2)

1.一种海伦兜兰无菌播种快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、人工授粉和种子的获得：选择生长健壮的海伦兜兰(Paphiopedilum helenaeAver.)母株进行异株人工授粉，选择授粉后120～180天的粉末状种子作为外植体进行无菌播种；
b、外植体消毒和无菌播种：将授粉后120～180天的蒴果进行消毒处理，切开果实，将粉末状种子接种到种子萌发培养基上培养，培养温度25℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照时间12～16小时/天，胚萌发形成原球茎；所述的种子萌发培养基为：每升含有椰子汁50～100毫升、萘乙酸0.1～0.5毫克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖30克、琼脂6～7克，其余为1/4MS培养基，pH 5.8～6.0；
c、类原球茎的诱导和增殖：将步骤b得到的原球茎接种到类原球茎的诱导和增殖的培养基上培养，培养温度25℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照时间12～16小时/天，获得类原球茎，将类原球茎接种到新的类原球茎的诱导和增殖的培养基上进行增殖培养，培养温度25℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照时间12～16小时/天，类原球茎大量增殖；所述的类原球茎的诱导和增殖的培养基为：每升含有6-苄基腺嘌呤5.0～10.0毫克、激动素5.0～10.0毫克、萘乙酸1.0～2.0毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、蔗糖30克、琼脂6～7克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0；
d、类原球茎的分化：将类原球茎接种到分化培养基上培养，培养温度25℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照时间12～16小时/天，类原球茎分化出小苗；所述的分化培养基为：每升含有6-苄基腺嘌呤0.2～1.0毫克、萘乙酸1.0～2.0毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖30克、琼脂6～7克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0；
e、壮苗培养：将小苗接种到壮苗培养基上培养，培养温度25℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照时间12～16小时/天，获得完整植株；所述的壮苗培养基为：每升含有花宝1号1～2克、花宝2号1～2克、MS培养基的维生素和肌醇成分、萘乙酸1.0～2.0毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、香蕉匀浆50～150克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖30克、琼脂6～7克，余量为水，pH 5.8～6.0；
f、试管苗移栽：将完整植株在自然光下炼苗10～15天，然后取出植株洗净根部的培养基，移栽到植金石、松树皮和泥炭土按质量比2～3:2～3:1混合的栽培基质中培养获得海伦兜兰种苗。
2.根据权利要求1所述的海伦兜兰无菌播种快速繁殖方法，其特征在于，步骤b所述的将授粉后120～180天的蒴果进行消毒处理具体为：将蒴果用体积分数70％～80％的酒精浸泡30～60秒后，用质量分数0.1％～0.2％的升汞溶液消毒10～20分钟，无菌水漂洗4～5次。
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