CN104429958A - 白榆组培苗瓶内复壮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白榆组培苗瓶内复壮的方法，采用(1)获取白榆组培苗单株a；(2)白榆瓶内复壮苗的制备；将该组培苗再次转接至正常继代培养基中培养20-24天后，得生长健壮、叶片舒展，平均株高3.5-4.0厘米，增殖比例平均1:3.8。复壮后的白榆组培苗降低了组培苗内的激素含量，能够继续进行继代培养20次，减少了重新获取新组培苗的次数，更适于白榆组培苗工厂化生产过程中，不受季节限制、利于生态环境、能短期内为生产提供大量正常健康的无菌组培苗。本发明适用于白榆组培苗瓶内的复壮的培养。

Description

白榆组培苗瓶内复壮的方法

技术领域

本发明属于植物培植领域，涉及一种植物复壮的方法，具体涉及一种白榆组培苗瓶内复壮的方法。

背景技术

白榆也称榆树，榆科榆属落叶乔木，分布较广，在东北、华北、西北及西南各省区均有栽培。白榆在中国乃至世界范围内有着悠久的栽植历史，是中国北方地区五大乡土树种之一，也是世界四大行道树种之一。白榆适应性强，喜光、耐旱、耐寒、耐贫瘠，不择土壤，多用于造林，是榆属植物中造林最为主要的树种。同时，白榆具有耐盐碱能力，可在中低度盐碱地生长，因此可用于滨海盐碱地的造林或四旁绿化。除造林外，白榆还是优良的木材，耐磨、耐腐，可用于造船、建筑、室内装修地板、家具。此外，白榆还具有较高的食用价值，叶片含淀粉和蛋白质，可做饲料，幼嫩果实(榆钱)可食用且具有药用效果。

植物组培技术是保持植物优良性状的有效手段。白榆组培工厂化过程中，随着组培继代次数的增加，植株体内激素不断累积，进而影响植物正常的表现，组培增殖比例下降，更严重的是，组培生根率下降，出现变异的风险增加。通常白榆组培苗继代20次以上，需要采取新的外植体，通过利用升汞、次氯酸等化学物质进行消毒，以获取新的无菌苗替代超继代次数的组培苗。由于常规的外植体消毒方法，使用的升汞等物质中含重金属，易影响身体健康，破坏生态环境；同时该方法以外植体为基础，受季节限制，不利于大规模工厂化生产。

现有技术中通常获得白榆无菌苗的方法，往往受到季节的限制，一般在母本植株生长开始或生长旺季进行外植体材料的采集，此时外植体材料内源激素含量高，容易分化，成活率高，生长速度快，相对易增殖。因此一般在春夏季节进行外植体材料的采集。另外，外植体材料来源少，采集外植体需选定一个优良的母本植株，因同一个植株不同部位相对树龄不同，树冠下部低龄化，所以一般采集树冠下部枝条萌发的新芽，因此材料来源少。获得新芽后，新芽生长需要一定时间，从外植体采集到获得100个无菌材料总耗时2个月。且继代前2个周期内出现无菌苗基部有黄叶、落叶现象，获得正常生长的无菌苗需3.5个月时间，耗时长。对于整个无菌体系建立需要在采集2个月时间内重复进行外植体的采集、消毒、接种。在无菌体系建立过程中使用的升汞为有毒试剂，易对环境产生污染，不慎接触可能产生毒副作用。并且成本相对高，其中无菌体系建立过程中需要使用消毒剂、配制启动培养基和增殖培养基，且均不可重复使用。

白榆组培苗的培养方法的步骤分为无菌苗的获取、瓶内扩繁(继代)、瓶内复壮、瓶内生根，每个阶段所使用的培养基与培养方法均是不同的。并且其中所述的瓶内复壮是在瓶内生根阶段之前的复壮，目的是使生根阶段的生根率提高。

中国发明专利CN102726294公开了“一种白榆组培苗的瓶内生根方法”，采用以下步骤进行(1)继代苗的选取；(2)将继代培养的组培苗接种到WPM生根培养基上；其针对的是白榆组培苗的生根方法，应用阶段为最终的生根阶段。

中国发明专利CN102934612公开了“一种白榆组培苗的继代培养方法”，采用将到达继代周期的白榆组培苗在超净工作台通过切分从生芽形式进行扩繁增殖，接种到继代培养基中。其针对的是白榆组培苗的继代培养阶段。

因此，建立一种不受季节限制、耗时短、减少人力的耗费、减少化学试剂的使用和生产成本低的，能短期内为生产提供大量正常健康的无菌组培苗方法具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题，是提供一种白榆组培苗瓶内复壮的方法，该复壮阶段是在无菌苗的获取和瓶内扩繁(继代)之间，所制得的复壮苗较现有技术的继代培养次数增加，在白榆组培苗工厂化生产过程中，不受季节限制、利于生态环境、能短期内为生产提供大量正常健康的无菌组培苗方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种白榆组培苗瓶内复壮的方法，它按照以下步骤顺序进行：

(1)获取白榆组培苗单株a

选取继代周期为21-25天，生长健壮、叶色嫩绿、叶片舒展，茎30％-50％木质化，株高为2.5-3.5厘米的白榆组培苗，切除基部愈伤组织及基部叶片，保留顶芽且株高1.8-2.5厘米的白榆组培苗单株a；

(2)白榆瓶内复壮苗的制备

将白榆组培苗单株a转接至复壮培养基中，光照和暗培养交替进行，光照培养条件为13小时光照，光照强度1500-3500勒克斯，温度为23-27℃；暗培养条件为暗培养11小时，温度为19-23℃，培养40天后，得白榆瓶内复壮苗。

作为本发明的一种限定，步骤(2)中所述的复壮培养基为体积比为30ml:60ml的营养液：蛭石。

作为本发明的另一种限定，营养液为MS培养基中硝酸铵、7水硫酸镁、磷酸二氢钾、硝酸钾四种物质浓度变为原来的1/4-3/4，同时去除肌醇、烟酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸。其中所述的原来的MS培养基为市售的MS培养基。

由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：

采用白榆组培苗瓶内复壮方法，该复壮阶段是在无菌苗的获取和瓶内扩繁(继代)之间，所制得的复壮苗较现有技术的继代培养次数增加，且可以作为无菌苗继续进行复壮、继代培养等下面的步骤，能够进行循环使用。采用(1)获取白榆组培苗单株a；(2)白榆瓶内复壮苗的制备；将该组培苗再次转接至正常继代培养基中培养20-24天后，得生长健壮、叶片舒展，平均株高3.5-4.0厘米，增殖比例平均1:3.8。复壮后的白榆组培苗降低了组培苗内的激素含量，能够继续进行继代培养20次，减少了重新获取新组培苗的次数，更适于白榆组培苗工厂化生产过程中，不受季节限制、利于生态环境、能短期内为生产提供大量正常健康的无菌组培苗。

本发明适用于白榆组培苗瓶内的复壮的培养。

本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。

具体实施方式

实施例1 一种白榆组培苗瓶内复壮的方法

一种白榆组培苗瓶内复壮的方法，它按照以下步骤顺序进行：

(1)获取白榆组培苗单株a

选取继代周期为23天，生长健壮、叶色嫩绿、叶片舒展，茎30％-50％木质化，株高为2.5厘米的白榆组培苗，切除基部愈伤组织及基部叶片，保留顶芽且株高2.5厘米的白榆组培苗单株a；

(2)白榆瓶内复壮苗的制备

将白榆组培苗单株a转接至复壮培养基中，光照和暗培养交替进行，光照培养条件为13小时光照，光照强度3000勒克斯，温度为25℃；暗培养条件为暗培养11小时，温度为20℃，培养40天后，得白榆瓶内复壮苗；其中，复壮培养基为体积比为30ml:60ml的营养液：蛭石。营养液为MS培养基中硝酸铵、7水硫酸镁、磷酸二氢钾、硝酸钾四种物质浓度变为原来的1/4，同时去除肌醇、烟酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸。

将瓶内复壮苗转接到继代培养基中继续进行培养所得到的复壮后的白榆组培苗a与通过外植体消毒获得的无菌苗b在相同的培养基中进行培养，比较培养结果：

(1)复壮后的白榆组培苗a的制备

将上述瓶内复壮苗转接至继代培养基中，培养基的pH为5.8，培养22天，得复壮后的白榆组培苗a。所使用的继代培养基为以改良MS培养基为基础培养基，还添加有BA 0.3mg/L、KT 0.2mg/L、糖30g/L和琼脂6.5g/L。改良MS培养基为包括KNO₃2022mg/L、NH₄NO₃1600mg/L、MgSO₄·7H₂O 740mg/L和KH₂PO₄312mg/L。

(2)通过外植体消毒获得的无菌苗b的制备

通过外植体消毒获得无菌苗b的方法为：选定的母本植株枝条萌发的新芽长2-3cm时开始采集，新芽采集后立即带回实验室进行消毒、接种处理，步骤如下：外植体采集→自来水冲洗两遍→洗衣粉水冲洗瓶内顺时针晃动重新2分钟→流水冲洗30分钟→75％酒精消毒20秒→无菌水冲洗两次→0.04％升汞100毫升+一滴吐温20消毒摇床晃动15分钟→超净工作台内无菌水冲洗六次→用无菌纱布或无菌吸水纸吸除外植体材料上的水→外植体材料进行修剪→接种至培养基中→培养室培养，光照培养条件为13小时光照，光照强度为3000勒克斯，温度为25℃，最终获得无菌苗b。

将通过外植体消毒方法获得的无菌苗b与本实施例所培养出的复壮后的白榆组培苗a生长情况作对比，如下表所示：

实施例2-6 白榆组培苗瓶内复壮的方法

实施例2-6分别为一种白榆组培苗瓶内复壮的方法，与实施例1的复壮过程相似，不同之处仅在于其中所涉及的技术参数不同，具体参见下表：

实施例2-6所培养出的复壮苗再进行继代培养后的生长情况为：生长健壮、-+舒展，叶色翠绿，10高一致，约3.0-3.5cm。基部有新芽发出，增殖比例平均1:3.5-1：3.8。重复继代，生长状态稳定，增殖系数稳定。

实施例7 复壮培养基的筛选

复壮培养基筛选设计如下三种培养基：

1、蛭石：1/2MS＝2：1(体积比)：蛭石作为培养基质。1/2MS的配方中NH₄NO₃、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、KNO₃四种物质减半，去除糖、有机物，不添加琼脂。

2、1/2MS培养基：即MS+琼脂5.8g/L,pH 5.8；其中，NH₄NO₃、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、KNO₃四种物质减半，去除糖、有机物。

3、MS培养基：MS+琼脂5.8g/L,pH 5.8；其中MS去除糖、有机物，添加琼脂。

实验方法：

1)选取继代周期为21-25天，生长健壮、叶色嫩绿、叶片舒展，茎30％-50％木质化，株高为2.5-3.5厘米的白榆组培苗，切除基部愈伤组织及基部叶片，保留顶芽且株高约2厘米的白榆组培苗单株，将白榆组培苗单株转接至复壮培养基中，编号1、2、3。

2)光照和暗培养交替进行，光照培养条件为13小时光照，光照强度1500-3500勒克斯，温度为23-27℃；暗培养条件为暗培养11小时，温度为19-23℃，培养40天后，得白榆瓶内复壮苗。

3)将2)中获得的复壮苗转接在改良MS的继代培养基(改良MS培养基为包括KNO₃2022mg/L、NH₄NO₃1600mg/L、MgSO₄·7H₂O 740mg/L和KH₂PO₄312mg/L。)中，进行扩繁培养，20天后观察结果如下：

由上表可知，由复壮培养基2复壮后的白榆组培苗再进行扩繁培养的生长情况较复壮培养基1和3有明显的差别，新顶芽平均生长的高度和单株的新顶芽生成均为较高水平。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作出的简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明权利要求的保护范围。

Claims (3)

1.一种白榆组培苗瓶内复壮的方法，其特征在于它按照以下步骤顺序进行：

(1)获取白榆组培苗单株a

选取继代周期为21-25天，生长健壮、叶色嫩绿、叶片舒展，茎30％-50％木质化，株高为2.5-3.5厘米的白榆组培苗，切除基部愈伤组织及基部叶片，保留顶芽且株高1.8-2.5厘米的白榆组培苗单株a；

(2)白榆瓶内复壮苗的制备

将白榆组培苗单株a转接至复壮培养基中，光照和暗培养交替进行，光照培养条件为13小时光照，光照强度1500-3500勒克斯，温度为23-27℃；暗培养条件为暗培养11小时，温度为19-23℃，培养40天后，得白榆瓶内复壮苗。

2.根据权利要求1所述的白榆组培苗瓶内复壮的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的复壮培养基为体积比为30ml:60ml的营养液：蛭石。

3.根据权利要求2所述的白榆组培苗瓶内复壮的方法，其特征在于：营养液为MS培养基中硝酸铵、7水硫酸镁、磷酸二氢钾、硝酸钾四种物质浓度变为原来的1/4-3/4，同时去除肌醇、烟酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸。