CN102217551A - 一种鼓槌石斛芽尖组织培养快速繁殖方法 - Google Patents

一种鼓槌石斛芽尖组织培养快速繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鼓槌石斛芽尖组织培养快速繁殖的方法，依次经过芽的诱导培养、丛生芽的增殖培养、丛生芽的继代培养、以及生根培养后，得到完整植株，即可出瓶炼苗，并移栽。本发明的方法操作容易，生产成本低，不污染环境，可以实现规模化生产。通过本发明培育出的鼓槌石斛种苗，其遗传性状稳定，保持了亲本的特性，具备包括不变性、投入少、产出高、周期短在内的诸多优势。

Description

一种鼓槌石斛芽尖组织培养快速繁殖方法
技术领域
本发明属于组织培养快速繁殖技术领域，具体涉及一种鼓槌石斛芽尖组织培养快速繁殖方法。
背景技术
鼓槌石斛（Dendrobium chrysanthum Wall.ex Lindl.）为兰科石斛属植物，别名金弓石斛，主要分布于我国的云南、广西、贵州等省，以及马来西亚、印度、缅甸等国家。据《中国药典》记载：其味淡、性微寒，有滋阴养胃，清热解毒的功效；在临床上多用于治疗慢性咽喉炎、眼科疾病、血栓闭塞性疾病，效果十分明显；化学成分及药理活性研究表明：鼓槌石斛中含有鼓槌菲、毛兰素等抗肿瘤活性成分，是脉络宁、通塞脉片、石斛液光丸等著名中成药的主要原料之一。当前，由于过量挖采，野生资源已经濒临灭绝，成为稀缺药材。同时，鼓槌石斛也是一种优良的观赏植物，金黄色的小花格外夺目，10-20朵花构成总状花序，艳丽多姿。目前，国内外对鼓槌石斛快速繁殖技术的研究，主要集中在种子萌发形成愈伤组织、原球茎，然后进行分化、壮苗和生根培养，获得完整植株。通过这种技术培育获得的鼓槌石斛后代性状分离程度高，个体之间差异大，难以实现性状一致的植株，阻碍了鼓槌石斛原生物种的保护及鼓槌石斛在花卉市场上的开发利用。因此，研究鼓槌石斛克隆技术，培育性状一致的植株，对保护鼓槌石斛和满足花卉市场的需求，实现人工规模化生产显得十分关键。
发明内容
有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供了一种鼓槌石斛芽尖组织培养快速繁殖方法，通过丛生芽的途径进行鼓槌石斛组织培养能够获得大量遗传性状稳定的试管苗，保持良好的亲本特性，并且具备包括不变性、投入少、产出高、周期短在内的诸多优势。
本发明通过以下技术方案来解决上述技术问题：
一种鼓槌石斛芽尖组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)外植体的消毒：选取5-8厘米长的幼嫩芽，去除包片，用自来水冲洗干净后剪成两段，在超净工作台上依次通过酒精和升汞溶液进行处理，而后用无菌水冲洗5～8次后，用无菌滤纸吸干残余水分，切取1-2厘米长带有侧芽尖的茎段接种在诱导培养基上；
2)丛生芽的诱导：采用诱导培养基培养10～15天，芽尖增大；30～40天，新芽形成并生长；培养过程中，光照强度1500～2000lx，光照10～12小时/天，温度25～28℃；
3)丛生芽的增殖：利用芽尖培养得到的丛生芽，剪取部分叶片后转移到丛生芽增殖培养基，培养40～60天，获得大量的丛生芽；培养条件为：光照强度1500～2000lx，光照10～12小时/天，温度25～28℃；
4)继代培养：采用继代培养基进行继代培养，每40～60天继代增殖1次，并将继代次数控制在15次内；培养条件为：光照强度1500～2000lx，光照10～12小时/天，温度25～28℃；
5)生根培养：当继代苗达到合适数量后，采用生根培养基进行生根培养，得到生根苗；培养条件为：光照强度1500～2000lx，光照10～12小时/天，温度25～28℃。培养30～50天；
6)试管苗移栽：选择每年3～5月份为出瓶移栽的季节，或者提供类似3～5月份自然条件的生长环境进行出瓶移栽；移栽前，试管苗放置于具自然光散射的温室中炼苗10～15天，然后从试管中取出小苗，清洗根部的培养基，并放于高锰酸钾溶液中浸泡3～5分钟，取出后用水苔种植于口径的塑料杯盆中；温室须保持通风，湿度在70～80%，温度保持在15℃以上至室温范围内，高于30℃必须用风机、水帘降温。
优选地，所述诱导培养基成分为1/2MS+6-苄氨基腺嘌呤 0.5～1.0㎎/L+腺嘌呤 1.0～1.5㎎/L+AgNO3 5.0～10.0㎎/L +10.0～20.0%椰子汁+5.0～10.0g/L活性炭，培养基PH值为5.5-5.8。
优选地，所述丛生芽增殖培养基为1/2MS+6-苄氨基腺嘌呤 1.0～3.0㎎/L+腺嘌呤 0.5～1.0㎎/L+AgNO3 5.0～10.0㎎/L +10.0～20.0%椰子汁+5.0～10.0g/L活性炭。
优选地，所述继代培养基为1/2MS+6-苄氨基腺嘌呤1.0～3.0㎎/L+腺嘌呤 0.5～1.0㎎/L+AgNO3 5.0～10.0㎎/L +10.0～20.0%椰子汁+5.0～10.0g/L活性炭。
优选地，所述生根培养基为MS+萘乙酸0.2～0.5㎎/L+10.0～20.0%椰子汁+5.0～10.0g/L活性炭。
优选地，所述外植体的消毒步骤中，依次通过酒精和升汞溶液进行处理是指用70%的酒精浸泡15～45秒，再用0.1%的升汞溶液灭菌8～12分钟。
优选地，所述试管苗移栽中，用于浸泡小苗根部的高锰酸钾溶液为0.1%的高锰酸钾溶液。
相比于现有技术，本发明的鼓槌石斛芽尖组织培养快速繁殖方法的有益效果在于：该方法操作容易，生产成本低，不污染环境，能够实现规模化生产。通过本发明培育出的鼓槌石斛种苗，其遗传性状稳定，保持了亲本的特性，具备包括不变性、投入少、产出高、周期短在内的诸多优势。
具体实施方式
有鉴于此，本发明具体实施方式中提供的一种鼓槌石斛芽尖组织培养快速繁殖方法，具体包括以下步骤：
1)外植体的消毒：选取5-8厘米长的幼嫩芽，去除包片，用自来水冲洗干净后剪成两段，在超净工作台上依次通过酒精和升汞溶液进行处理，而后用无菌水冲洗5～8次后，用无菌滤纸吸干残余水分，切取1-2厘米长带有侧芽尖的茎段接种在诱导培养基上；
2)丛生芽的诱导：采用诱导培养基培养10～15天，芽尖增大；30～40天，新芽形成并生长；培养过程中，光照强度1500～2000lx，光照10～12小时/天，温度25～28℃；
3)丛生芽的增殖：利用芽尖培养得到的丛生芽，剪取部分叶片后转移到丛生芽增殖培养基，培养40～60天，获得大量的丛生芽；培养条件为：光照强度1500～2000lx，光照10～12小时/天，温度25～28℃；
4)继代培养：采用继代培养基进行继代培养，每40～60天继代增殖1次，并将继代次数控制在15次内；培养条件为：光照强度1500～2000lx，光照10～12小时/天，温度25～28℃；
5)生根培养：当继代苗达到合适数量后，采用生根培养基进行生根培养，得到生根苗；培养条件为：光照强度1500～2000lx，光照10～12小时/天，温度25～28℃。培养30～50天；
6)试管苗移栽：选择每年3～5月份为出瓶移栽的季节，或者提供类似3～5月份自然条件的生长环境进行出瓶移栽；移栽前，试管苗放置于具自然光散射的温室中炼苗10～15天，然后从试管中取出小苗，清洗根部的培养基，并放于高锰酸钾溶液中浸泡3～5分钟，取出后用水苔种植于口径的塑料杯盆中；温室须保持通风，湿度在70～80%，温度保持在15℃以上至室温范围内，高于30℃必须用风机、水帘降温。
上述各个步骤中涉及到的处理方式、培养条件、培养时间和培养基的成分都会根据具体需要进行适当的调整。
其中，各培养在成分确定的情况下，其中用到的各组分的含量可根据实际的培养情况进行调整，上述方法中用到的培养基成分和各成分的含量范围如下：
丛生芽的诱导步骤中，诱导培养基成分为1/2MS+6-苄氨基腺嘌呤 0.5～1.0㎎/L+腺嘌呤 1.0～1.5㎎/L+AgNO3 5.0～10.0㎎/L +10.0～20.0%椰子汁+5.0～10.0g/L活性炭，培养基PH值为5.5-5.8。
丛生芽的增殖步骤中，丛生芽增殖培养基为1/2MS+6-苄氨基腺嘌呤 1.0～3.0㎎/L+腺嘌呤 0.5～1.0㎎/L+AgNO3 5.0～10.0㎎/L +10.0～20.0%椰子汁+5.0～10.0g/L活性炭。
继代培养步骤中，继代培养基为1/2MS+6-苄氨基腺嘌呤1.0～3.0㎎/L+腺嘌呤 0.5～1.0㎎/L+AgNO3 5.0～10.0㎎/L +10.0～20.0%椰子汁+5.0～10.0g/L活性炭。
生根培养步骤中，生根培养基为MS+萘乙酸0.2～0.5㎎/L+10.0～20.0%椰子汁+5.0～10.0g/L活性炭。
另外，由于培养过程受诸如温度、光照、湿度等多种因素的影响，因而，在本发明的各步骤中，处理方式、培养条件、培养时间都会根据具体需要进行适当的调整。
其中，外植体的消毒步骤中，依次通过酒精和升汞溶液进行处理是指用70%的酒精浸泡15～45秒，再用0.1%的升汞溶液灭菌8～12分钟。另外，所述试管苗移栽中，用于浸泡小苗根部的高锰酸钾溶液为0.1%的高锰酸钾溶液。
为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。
实施例1
选取5-8厘米长的幼嫩芽，去除包片，用自来水冲洗干净后剪成两段，在超净工作台上用70%的酒精浸泡15秒，再用0.1%的升汞溶液灭菌8分钟，无菌水冲洗5次后，用无菌滤纸吸干残余水分，切取1-2厘米长带有侧芽尖的茎段接种在诱导培养基为1/2MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.5㎎/L+AD(腺嘌呤) 1.0㎎/L+AgNO3 5.0 ㎎/L +10.0%椰子汁+5.0g/L活性炭上，光照强度1500～2000lx，光照10小时/天，温度25～28℃。培养40～55天，新芽形成并生长。利用芽尖培养得到的丛生芽，剪取部分叶片后转移到丛生芽增殖培养基1/2MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤) 1.0㎎/L+AD(腺嘌呤) 0.5㎎/L+AgNO3 5.0㎎/L +10.0%椰子汁+5.0g/L活性炭，在光照强度1500～2000lx，光照10小时/天，温度25～28℃条件下，培养40～60天，获得大量的丛生芽，增殖倍数可达3.0。每40～60天继代增殖1次，一般继代次数不超过15次，继代培养基为1/2MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤) 1.0㎎/L+AD(腺嘌呤) 0.5㎎/L+AgNO3 5.0㎎/L +10.0%椰子汁+5.0g/L活性炭，在光照强度1500～2000lx，光照10小时/天，温度25～28℃条件下培养。当继代苗达到一定数量后，可以进行生根培养，生根培养基为MS+NAA(萘乙酸) 0.2㎎/L+00.0%椰子汁+5.0g/L活性炭，在光照强度1500～2000lx，光照10小时/天，温度25～28℃的条件下培养，培养30～50天，得到生根苗。春季为出瓶移栽的季节，移栽前，试管苗放置于具自然光散射的温室中炼苗15天，然后从试管中取出小苗，清洗根部的培养基，并放于0.1%的高锰酸钾溶液中浸泡5分钟，取出后用水苔种植于口径4.8cm的塑料杯盆中，并保持温室通风，湿度在70～80%，温度保持在15℃以上，高于30℃必须用风机、水帘降温，移栽成活率可达90%。
实施例2
选取5-8厘米长的幼嫩芽，去除包片，用自来水冲洗干净后剪成两段，在超净工作台上用70%的酒精浸泡30秒，再用0.1%的升汞溶液灭菌10分钟，无菌水冲洗6次后，用无菌滤纸吸干残余水分，切取1-2厘米长带有侧芽尖的茎段接种在诱导培养基为1/2MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤) 0.75㎎/L+AD(腺嘌呤) 1.25㎎/L+AgNO3 7.5 ㎎/L +15.0%椰子汁+7.5g/L活性炭上，光照强度1500～2000lx，光照11小时/天，温度25～28℃。培养40～55天，新芽形成并生长。利用芽尖培养得到的丛生芽，剪取部分叶片后转移到丛生芽增殖培养基1/2MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤) 1.5㎎/L+AD(腺嘌呤) 0.75㎎/L+AgNO3 7.5㎎/L +15.0%椰子汁+7.5g/L活性炭，在光照强度1500～2000lx，光照11小时/天，温度25～28℃条件下，培养40～60天，获得大量的丛生芽，增殖倍数可达4.0。每40～60天继代增殖1次，一般继代次数不超过15次，继代培养基为1/2MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)1.5㎎/L+AD(腺嘌呤) 0.75㎎/L+AgNO3 7.5㎎/L +15.0%椰子汁+7.5g/L活性炭，在光照强度1500～2000lx，光照11小时/天，温度25～28℃条件下培养。当继代苗达到一定数量后，可以进行生根培养，生根培养基为MS+NAA(萘乙酸) 0.35㎎/L+15.0%椰子汁+7.5g/L活性炭，在光照强度1500～2000lx，光照11小时/天，温度25～28℃的条件下培养，培养30～50天，得到生根苗。春季为出瓶移栽的季节，移栽前，试管苗放置于具自然光散射的温室中炼苗15天，然后从试管中取出小苗，清洗根部的培养基，并放于0.1%的高锰酸钾溶液中浸泡5分钟，取出后用水苔种植于口径4.8cm的塑料杯盆中，并保持温室通风，湿度在70～80%，温度保持在15℃以上，高于30℃必须用风机、水帘降温，移栽成活率可达90%。
实施例3
选取5-8厘米长的幼嫩芽，去除包片，用自来水冲洗干净后剪成两段，在超净工作台上用70%的酒精浸泡45秒，再用0.1%的升汞溶液灭菌12分钟，无菌水冲洗8次后，用无菌滤纸吸干残余水分，切取1-2厘米长带有侧芽尖的茎段接种在诱导培养基为1/2MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤) 1.0㎎/L+AD(腺嘌呤) 1.5㎎/L+AgNO3 10.0 ㎎/L +20.0%椰子汁+10.0g/L活性炭上，光照强度1500～2000lx，光照12小时/天，温度25～28℃。培养40～55天，新芽形成并生长。利用芽尖培养得到的丛生芽，剪取部分叶片后转移到丛生芽增殖培养基1/2MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤) 3.0㎎/L+AD(腺嘌呤) 1.0㎎/L+AgNO3 10.0㎎/L +20.0%椰子汁+10.0g/L活性炭，在光照强度1500～2000lx，光照12小时/天，温度25～28℃条件下，培养40～60天，获得大量的丛生芽，增殖倍数可达6.0。每40～60天继代增殖1次，一般继代次数不超过15次，继代培养基为1/2MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)3.0㎎/L+AD(腺嘌呤) 1.0㎎/L+AgNO3 10.0㎎/L +20.0%椰子汁+10.0g/L活性炭，在光照强度1500～2000lx，光照12小时/天，温度25～28℃条件下培养。当继代苗达到一定数量后，可以进行生根培养，生根培养基为MS+NAA(萘乙酸) 0.5㎎/L+20.0%椰子汁+10.0g/L活性炭，在光照强度1500～2000lx，光照12小时/天，温度25～28℃的条件下培养，培养30～50天，得到生根苗。春季为出瓶移栽的季节，移栽前，试管苗放置于具自然光散射的温室中炼苗15天，然后从试管中取出小苗，清洗根部的培养基，并放于0.1%的高锰酸钾溶液中浸泡5分钟，取出后用水苔种植于口径4.8cm的塑料杯盆中，并保持温室通风，湿度在70～80%，温度保持在15℃以上，高于30℃必须用风机、水帘降温，移栽成活率可达90%。
相比于现有技术，上述方式中揭示的鼓槌石斛芽尖组织培养快速繁殖方法，操作容易，生产成本低，不污染环境，能够实现规模化生产。通过本发明培育出的鼓槌石斛种苗，其遗传性状稳定，保持了亲本的特性，具备包括不变性、投入少、产出高、周期短在内的诸多优势。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种鼓槌石斛芽尖组织培养快速繁殖方法, 其特征在于该方法包括以下步骤：
1)外植体的消毒：选取5-8厘米长的幼嫩芽，去除包片，用自来水冲洗干净后剪成两段，在超净工作台上依次通过酒精和升汞溶液进行处理，而后用无菌水冲洗5～8次后，用无菌滤纸吸干残余水分，切取1-2厘米长带有侧芽尖的茎段接种在诱导培养基上；
2)丛生芽的诱导：采用诱导培养基培养10～15天，芽尖增大；30～40天，新芽形成并生长；培养过程中，光照强度1500～2000lx，光照10～12小时/天，温度25～28℃；
3)丛生芽的增殖：利用芽尖培养得到的丛生芽，剪取部分叶片后转移到丛生芽增殖培养基，培养40～60天，获得大量的丛生芽；培养条件为：光照强度1500～2000lx，光照10～12小时/天，温度25～28℃；
4)继代培养：采用继代培养基进行继代培养，每40～60天继代增殖1次，并将继代次数控制在15次内；培养条件为：光照强度1500～2000lx，光照10～12小时/天，温度25～28℃；
5)生根培养：当继代苗达到合适数量后，采用生根培养基进行生根培养，得到生根苗；培养条件为：光照强度1500～2000lx，光照10～12小时/天，温度25～28℃，培养30～50天；
6)试管苗移栽：选择每年3～5月份为出瓶移栽的季节，或者提供类似3～5月份自然条件的生长环境进行出瓶移栽；移栽前，试管苗放置于具自然光散射的温室中炼苗10～15天，然后从试管中取出小苗，清洗根部的培养基，并放于高锰酸钾溶液中浸泡3～5分钟，取出后用水苔种植于口径的塑料杯盆中；温室须保持通风，湿度在70～80%，温度保持在15℃以上至室温范围内，高于30℃必须用风机、水帘降温。
2.如权利要求1所述的鼓槌石斛芽尖组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述诱导培养基成分为1/2MS+6-苄氨基腺嘌呤 0.5～1.0㎎/L+腺嘌呤 1.0～1.5㎎/L+AgNO3 5.0～10.0㎎/L +10.0～20.0%椰子汁+5.0～10.0g/L活性炭，培养基PH值为5.5-5.8。
3.如权利要求1所述的鼓槌石斛芽尖组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述丛生芽增殖培养基为1/2MS+6-苄氨基腺嘌呤 1.0～3.0㎎/L+腺嘌呤 0.5～1.0㎎/L+AgNO3 5.0～10.0㎎/L +10.0～20.0%椰子汁+5.0～10.0g/L活性炭。
4.如权利要求1所述的鼓槌石斛芽尖组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述继代培养基为1/2MS+6-苄氨基腺嘌呤1.0～3.0㎎/L+腺嘌呤 0.5～1.0㎎/L+AgNO3 5.0～10.0㎎/L +10.0～20.0%椰子汁+5.0～10.0g/L活性炭。
5.如权利要求1所述的鼓槌石斛芽尖组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述生根培养基为MS+萘乙酸0.2～0.5㎎/L+10.0～20.0%椰子汁+5.0～10.0g/L活性炭。
6.如权利要求1所述的鼓槌石斛芽尖组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述外植体的消毒步骤中，依次通过酒精和升汞溶液进行处理是指用70%的酒精浸泡15～45秒，再用0.1%的升汞溶液灭菌8～12分钟。
7.如权利要求1所述的鼓槌石斛芽尖组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述试管苗移栽中，用于浸泡小苗根部的高锰酸钾溶液为0.1%的高锰酸钾溶液。
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