CN101238794A - 野百合试管鳞茎的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种野百合试管鳞茎的诱导方法，包括如下步骤：(1)选取无病虫害的野百合鳞茎鳞片，用自来水冲洗后，75％酒精浸泡30秒，无菌水冲洗3～4次，再加入3％次氯酸钠浸泡10分钟，中间摇动几下，用无菌水冲洗3～4次，再用3％次氯酸钠浸泡10分钟，中间摇动几下，后用无菌水冲洗6～7次后，然后置于有无菌滤纸的培养皿中切块备用；(2)将鳞片基部接种到诱导培养基中培养，培养温度为23－27℃，光照强度为1500Lx，光照时间为每天12小时；(3)诱导培养30天后，将长出的试管鳞茎置增殖培养基中进行增殖培养，当试管鳞茎直径达1－2cm时，取出种植到有消毒基质的器皿中，浇透水，覆盖保鲜膜保湿，移苗3－5天后通风透气，待试管苗长出新叶，除去保鲜膜。本发明能缩短出苗时间，节约成本、操作简单。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种贵州野百合(Liliumbrownii F.E.)试管鳞茎的诱导方法。
背景技术
百合花形优雅，花色纯洁艳丽，是园林绿化和家庭装饰的上好材料。百合鳞茎富含蛋白质、脂肪、淀粉、糖及维生素B1、B2和维生素C等营养成分，是一种好的强身滋补品。俗话说得好：“山高不过圣堂山，好吃不过百合粉”。随着人类社会和经济的发展，百合已成为高档的食用、药用、观赏多用的高收入经济作物。贵州独特的地理环境和气候条件，蕴藏有丰富的百合资源，其中野百合全省均有分布。以贵州野百合为原材料的名牌产品就有务川百合粉、沿河百合粉等十来种。近年来，由于市场需求增加，人们过度挖掘，加上自然环境的恶化，贵州野百合资源形势严峻。同时，野百合具有较强的抗逆性，是百合育种的好材料，其保护对百合种质创新具有重要意义。迄今为止，未见有对贵州野百合进行试管鳞茎诱导和快速繁殖方法的报道。
百合试管鳞茎诱导技术是目前百合规模化生产手段之一，影响百合试管鳞茎形成和膨大的因素是多方面的，如外植体来源、消毒试剂的选择及作用时间、激素配比、蔗糖浓度、光照、培养温度等等，在已报道的百合试管鳞茎诱导与快速繁殖中，外植体的消毒剂都选用0.1％的升汞。升汞的消毒能力不可置疑，但对实验操作人员的健康和环境的清洁却存在较大的成胁，对实验材料百合鳞茎有较大的腐蚀，重金属汞是否继续存在于百合试管鳞茎还有待研究，而且升汞价格还很贵。总之，升汞在污染环境的同时，外植体通常还会出现变色、腐烂等不利于新鳞茎生成。培养基的激素成分和配比也是影响野百合鳞茎芽形成的重要因素，野生百合在含有不同激素的培养基上形成鳞茎芽的数量存在着差异，诱导培养基和增殖培养基的激素配比不一样，配制时需分开，操作复杂。在选择部位上，不同部位鳞茎芽的形成差异也很大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能缩短出苗时间，节约成本、操作简单的野百合试管鳞茎的诱导方法。
野百合试管鳞茎的诱导方法，包括如下步骤：
(1)选取无病虫害的野百合鳞茎鳞片，用自来水冲洗后，75％酒精浸泡30秒，无菌水冲洗3～4次，再加入3％次氯酸钠浸泡10分钟，中间摇动几下，用无菌水冲洗3～4次，再用3％次氯酸钠浸泡10分钟，中间摇动几下，后用无菌水冲洗6～7次后，然后置于有无菌滤纸的培养皿中切块备用；
(2)将鳞片基部接种到诱导培养基中培养，培养温度为23-27℃，光照强度为1500Lx，光照时间为每天12小时；鳞茎诱导培养基以MS培养基为基本培养基，激素组合为6-碱基嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)，用量为NAA 0.3mg/L，6-BA为1.5mg/L，蔗糖浓度3％，琼脂粉用量为0.75％，培养基PH值5.8；
(3)诱导培养30天后，将长出的试管鳞茎置增殖培养基(配方与诱导培养基相同)中进行增殖培养，接着在增殖培养基(配方与诱导培养基相同)中进行增殖培养，当鳞茎直径达1-2cm时，取出种植到有消毒基质的器皿中，浇透水，覆盖保鲜膜保湿，移苗3-5天后通风透气，待试管苗长出新叶，除去保鲜膜。
本发明与现有技术相比，选用3％次氯酸钠作消毒剂，重复处理一次，消毒效果非常理想，重要的是在对操作人员、实验材料和环境都不存在不好的影响，价格低廉，节省成本同时不会影响新鳞茎生成。在MS添加NAA0.3mg/L和6-BA 1.5mg/L组合的培养基上，其鳞茎的萌芽率最高，可以得到大量健壮的野生百合试管苗，选用相同的培养基，操作简单，而且在增殖过程中，试管鳞茎还会长根，节省了生根培养步骤，缩短了出苗时间。在选择部位上，选用带基部的鳞片其增殖系数通常较高，因此，在野百合的繁殖过程中，切取鳞茎的基部做外植体。要实现百合资源的可持续开发利用，运用组织培养技术对现存的百合种类进行培养具有重要的经济价值。
具体实施方式
实施例1：
(1)采自贵阳市黔灵山生长健壮、开花性状好、无病虫害的野百合植株的鳞茎鳞片；用自来水冲洗后，75％酒精浸泡30秒后，无菌水冲洗3～4次，再加入3％次氯酸钠浸泡10分钟，中间摇动几下，用无菌水冲洗3～4次，再用3％次氯酸钠浸泡10分钟，后用无菌水冲洗6～7次后，然后置于有无菌滤纸的培养皿中切块备用；
次氯酸钠的消毒效果：经过多次试验得出，用3％次氯酸钠浸泡10分钟，处理两次，消毒效果也非常理想，在接种的120个三角瓶，共360块外植体中，只有4瓶6块外植体污染，其中1瓶为细菌污染。结果显示，用3％次氯酸钠对百合鳞茎外植体进行消毒完全是可行的，而且对操作人员、实验材料和环境都不存在不好的影响，价格还低廉。
(2)不同激素配比对试管鳞茎形成的影响：
当前，未见对贵州野百合进行试管鳞茎诱导和增殖的相关报道，也就是说没有现成的培养基配方供直接使用。为筛选贵州野百合的最佳试管鳞茎诱导培养基，以MS培养基为基本培养基，以细胞分裂素6-碱基嘌呤(6-BA)和生长素萘乙酸(NAA)不同浓度进行配比，研究对贵州野百合鳞茎诱导和增殖的影响。外植体选用消毒过的鳞片基部，培养温度为23-27℃，光照强度为1500Lx，光照时间为每天12小时，接种30天后观察实验结果。结果见表1。
表1 不同激素配比对贵州野百合试管鳞茎形成的影响
| 编号 | 激素浓度(mg/L) | 接种数(块) | 萌芽的外植体块数 | 萌芽率(％) | 总芽数(个) | 芽生长情况 | |
| NAA | 6-BA | ||||||
| 12345678910111213141516 | 0.10.10.10.10.20.20.20.20.30.30.30.30.50.50.50.5 | 0.51.01.52.00.51.01.52.00.51.01.52.00.51.01.52.0 | 20202020202020202020202020202019 | 8101110121315141516181716171817 | 40.050.055.050.060.065.075.070.075.080.090.085.080.085.090.089.5 | 9121411141518151616331816182016 | 弱细壮壮弱细壮，芽基部膨大壮弱壮壮，芽基部膨大，部分长根壮细壮壮，芽基部膨大，部分长根壮，有玻璃化现象 |
从表1可看出，不同浓度的激素配比对贵州野百合鳞茎芽诱导效果存在明显差异。6-BA浓度相同的条件下，NAA的浓度上升，鳞茎芽的萌芽率相应提高，到0.5mg/L时平均可达80.0％以上。当NAA的浓度不变时，6-BA的浓度在1.5mg/L时，野百合的鳞茎芽萌发率最大，诱导的芽数最多，芽长得也较壮，并且芽基部都出现膨大，部分鳞茎芽还长出新根。当6-BA的浓度低于1.0mg/L时，野百合的鳞茎芽萌发率普遍不高，而且长出的芽普遍生长势弱。浓度过高，则导致部分鳞茎芽出现玻璃化现象，不利于增殖。可见，不管是低浓度的激素配比，还是高浓度的激素配比，都不利于野百合鳞茎芽的产生。最好的激素配比就是0.3mg/L的NAA和1.5mg/L的6-BA组合，此时的鳞茎芽萌发率达90.0％，诱导的芽数也最多，平均每块外植体2个鳞茎芽。生长势上，鳞茎芽也较壮，没有出现变态芽和玻璃化芽，所以此激素组合比较适合用于野百合鳞茎芽的诱导。
不同部位外植体对试管鳞茎形成的影响：
采用前面筛选得到的野百合试管鳞茎最佳诱导培养基研究发育程度、不同部位外植体对试管鳞茎形成的影响。具体操作是接种时将消毒的贵州野百合鳞茎外层、中、内层以及上、中、下段分开接种。结果外层和中层都见有新鳞茎产生，而内层几乎没有新鳞茎生成。不同的部位对新鳞茎形成的影响见表2。
表2 不同部位对试管鳞茎生成的影响
| 接种外植体部位 | 接种数(块) | 萌芽的外植体数(块) | 萌芽率(％) | 总芽数(个) |
| 鳞片基部鳞片中部鳞片上部 | 404040 | 331910 | 82.547.525.0 | 1203611 |
表2显示贵州野百合诱导能力强弱依次为鳞片基部、鳞片中部、鳞片上部。表2中，鳞茎基部诱导鳞茎芽的萌发率可达82.5％，平均每一个鳞茎基部就可形成3-4个新鳞茎芽。而鳞茎的中部和上部的鳞茎芽萌发率却相对比较低，平均芽数也少。上部的鳞茎芽萌发率仅有25.0％，平均鳞茎芽只有1个而已。于是得出，越靠近鳞片基部，器官发生能力也越强，这可能与极性有关。因此，为了获得好的实验结果和降低材料消耗，外植体选择百合鳞茎的基部是最理想的。
(3)试管鳞茎的增殖和移栽
将筛选的最佳激素配比的诱导培养基用于野百合鳞茎芽的增殖培养，培养条件同诱导培养。结果在接种15天左右，有新的鳞茎芽生成，成丛生状。培养时间越长，芽数越多。25天左右，部分鳞茎芽生出粗壮的根。当鳞茎直径达1-2cm左右时，取出种植到有消毒基质的器皿中，浇透定根水，覆盖保鲜膜保湿，移苗3-5天后通风透气，待试管苗长出新叶，除去保鲜膜。移栽成活率在90％以上。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (2)
1、一种野百合试管鳞茎的诱导方法，包括如下步骤：
(1)选取无病虫害的野百合鳞茎鳞片，用自来水冲洗后，75％酒精浸泡30秒，无菌水冲洗3～4次，再加入3％次氯酸钠浸泡10分钟，中间摇动几下，用无菌水冲洗3～4次，再用3％次氯酸钠浸泡10分钟，中间摇动几下，后用无菌水冲洗6～7次后，然后置于有无菌滤纸的培养皿中切块备用；
(2)将鳞片基部接种到诱导培养基中培养，培养温度为23-27℃，光照强度为1500Lx，光照时间为每天12小时；
(3)诱导培养30天后，将长出的试管鳞茎置增殖培养基中进行增殖培养，当鳞茎直径达1-2cm时，取出种植到有消毒基质的器皿中，浇透水，覆盖保鲜膜保湿，移苗3-5天后通风透气，待试管苗长出新叶，除去保鲜膜。
2、如权利要求1所述的野百合试管鳞茎的诱导方法，其中：鳞茎诱导培养基和增殖培养基相同，均以MS培养基为基本培养基，激素组合为6-碱基嘌呤和萘乙酸，用量为NAA 0.3mg/L，6-BA为1.5mg/L，蔗糖浓度3％，琼脂粉用量为0.75％，培养基PH值5.8。
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