CN106359107A - 一种野生百合的组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物组织培养方法领域，具体涉及一种野生百合的组织培养方法，该方法是在开放式的条件下进行，对进行野生百合培养的场地消毒灭菌，选择野生百合的鳞茎作为外植体，经过诱导培养、继代增殖培养、壮苗培养、生根培养得到完整植株，炼苗后移接到室外进行培养。本发明利用组织培养技术，有效降低了野生百合组织培养的污染率，且继代过程中不易出现内生菌污染，组培成功率较高，为百合野生资源的保护提供了有效的手段，具有潜在的生态效益和社会效益。

Description

一种野生百合的组织培养方法
技术领域
本发明属于植物组织培养方法领域，具体涉及一种野生百合的组织培养方法。
背景技术
随着人们对百合日益增长的消费需求，国内对百合种植的研究也越来越深入与广泛。植物组织培养技术已广泛应用于各个研究领域，渗透到育种学、遗传学、分子生物学等学科中，成为生命科学中重要的研究技术和手段。组培狭义指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
百合(Lily)是百合科百合(Lilium L.)属多年生球根花卉，在世界观赏花卉生产中占有重要地位，随着市场需求量的不断增加，人们对百合花的品种质量要求也越来越高，为进一步丰富和改善百合品种及观赏价值，开发野生百合资源，提高百合的组培价值及商品价值，人们对百合野生品种资源、野生百合的组培繁殖以及试管苗生长发育做了大量研究，从依靠鳞片扦插由子球培育成母球的传统的百合种球生产到百合组培快繁。由于百合地下鳞茎数量多，易于获得，取材不受季节限制而成为目前百合组培最主要的外植体材料，但鳞茎生长于地下，带菌多，使得组培消毒过程中难度加大。
目前百合组培苗的获得均采用常规的组织培养方法，但是，在组织培养早期常出现大面积的真菌污染，继代过程中还会出现内生细菌的再次污染，造成了材料的损失，同时浪费了大量的人力物力。野生百合由于生长在野外，无性繁殖的特性使其在生长过程中易不断积累病毒，故长期以来高污染率是困扰野生百合组织培养的难题。
目前，对如何降低野生百合组培过程中的污染率已有相关研究报道，一方面是对组培过程各环节进行严格控制，另一方面是使用表面消毒剂对材料进行消毒如抗生素、次氯酸钠、氯化汞等。但这些消毒剂或达不到很好的污染防控作用，或对材料有伤害并对操作人员及环境有危害。因此，如何寻找一种高效易于操作且环境友好型的外植体处理方法，是野生百合组培过程中亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述存在的不足，本发明提供了一种野生百合的组织培养方法。本发明利用组织培养技术，有效降低了野生百合组织培养的污染率，且继代过程中不易出现内生菌污染，能够迅速去除病毒和更新品种，加快了百合的快速繁殖速度，缩短了百合的生育周期，为百合野生资源的保护提供了有效的手段，具有潜在的生态效益和社会效益。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种野生百合的组织培养方法，该组织培养方法是在开放式的条件下进行，其技术方案包括以下步骤：
步骤（1）：对准备进行野生百合培养的场地消毒灭菌；
步骤（2）：选择野生百合的中层鳞片部位的鳞茎，随后将其切成条状，对其进行灭菌处理，再利用试管再生小鳞茎作为外植体；
步骤（3）：将步骤（2）的外植体直接接入诱导培养基上，进行初始诱导培养25-30d，诱导出野生百合鳞片不定芽；
步骤（4）：将步骤（3）长约0.5-2cm的野生百合鳞片不定芽取出，接种于继代增殖培养基上培养24-28d，得到野生百合组培苗；
步骤（5）：将步骤（4）得到的野生百合组培苗，接种到壮苗培养基A上培养15-20d，一周更换一次培养基，将长至2cm以上的组培苗分成单株，移至壮苗培养基B上，培养20-25d，一周更换一次培养基，得到野生百合幼苗；
步骤（6）：将步骤（5）长约4-5cm的野生百合幼苗，接种于生根培养基上培养15-20d，直接进行诱导长出至少4条根且主根长度大于2cm，得到完整的植株；若生根培养20d生根情况仍达不到要求，则在原培养基上层再倒0.5cm厚生根培养基，用30℃水将组培瓶倾斜沿瓶壁缓缓倒入新加培养基；
步骤（7）：将步骤（6）所述的野生百合完整植株进行炼苗，将生根苗移接到室外进行培养。
进一步地，所述的一种野生百合的组织培养方法，在步骤（1）所述开放式条件下使用的消毒杀菌剂为次氯酸、氧化钙或恶霉灵的一种或者几种。
进一步地，所述的一种野生百合的组织培养方法，在步骤（2）所述灭菌处理指：鳞茎稍加冲洗去掉泥土后，置于含洗洁精的水中浸洗30-40min，然后在自来水流下冲洗1-3h，再用75％酒精浸泡60-90s。此消毒方法避免使用氯化汞、次氯酸钠等对环境有害的化合物，去除了消毒剂及无菌水冲洗时间，操作简便，节约人力物力，提高了操作人员的安全性，减少了环境污染。75％的酒精使菌体蛋白质脱水、变性、沉淀的过程缓慢进行，因而渗透性较强，酒精能不断渗入菌体内部，作用于菌体内所有的蛋白质，最后杀死细菌，且杀菌作用比较彻底。
进一步地，所述的一种野生百合的组织培养方法，步骤（3）所述诱导培养基为MS+6-BA0.3-0.7mg/L+NAA0.3-0.6mg/L+Vc1-4mg/L，pH=5.8的固体培养基。
进一步地，所述的一种野生百合的组织培养方法，在步骤（4）中，所述的继代增殖培养基是固体培养基，其有效成分为MS+6-BA0.5-1.0mg/L+NAA0.3-0.6mg/L+GA30.2-0.4mg/L+IAA0.1-0.5mg/L，pH=5.8。
进一步地，所述的一种野生百合的组织培养方法，步骤（5）所述壮苗培养基A为MS+6-BA1-2mg/L+NAA0.01-0.1mg/L，pH=5.8的固体培养基；壮苗培养基B为MS+6-BA1-2mg/L+NAA0.01-0.1mg/L+GA30.1-1mg/L，pH=5.8的固体培养基。
进一步地，所述的一种野生百合的组织培养方法，在步骤（6）所述生根培养基为1/2MS+NAA0.01-0.1mg/L+IBA1-2mg/L，pH=5.8的固体培养基，其厚度为2-2.5cm。
所述诱导培养基、继代增殖培养基、壮苗培养基、生根培养基的制备方法为：将各原料按配比溶于水，再于125-130℃高温、0.1Mpa下灭菌15-20min，冷却凝固即可。
进一步地，所述的一种野生百合的组织培养方法，在步骤（5）若组培苗在壮苗培养基A上培养20d后还未长至2cm，则切除组培苗底部与培养基接触形成的黑褐色部分，底部茎端没入培养基3-5mm培养，更换壮苗培养基A，再继续培养7-10d。
进一步地，所述的一种野生百合的组织培养方法，所述诱导培养、继代增殖培养、壮苗培养、生根培养均放置到培养室培养,培养温度为26±1℃、光照强度为1800-2000Lx、光照时数为12h/d。光照和温度影响百合生长的两个重要环境因子，温度过高和过低均不利于百合的生长。
本发明还经过比较试验，筛选出野生百合组培各个阶段最佳培养基：
a.诱导培养基：MS+6-BA0.7mg/L+NAA0.3mg/L+Vc4mg/L，pH=5.8是野生百合鳞茎最佳的诱导培养基，不但诱导率高，而且每个外植体新增芽数多，分化率最高，其分化率可达85％。
b.继代增殖培养基：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.4mg/L+GA30.2mg/L+IAA0.3 mg/L，pH=5.8，高浓度的6-BA对百合鳞茎增殖有抑制作用，浓度过高，可抑制芽的生长，随着6-BA浓度的增高，超过1.1mg/L时，丛生矮化明显，易产生玻璃化苗。
c.壮苗培养基：壮苗培养基A为MS+6-BA1mg/L+NAA0.06mg/L，pH=5.8；壮苗培养基B为MS+6-BA1mg/L+NAA0.07mg/L+GA30.6mg/L，pH=5.8。
d.生根培养基：1/2MS+NAA0.05mg/L+IBA1.2mg/L，pH=5.8，其厚度为2.3cm，低盐浓度对细叶百合的生根有利，生根率达90.5％。生根时基部可新增带根的小鳞茎，平均可达4-5个。
本发明实施方案中，在本领域技术人员公知范围内，MS为国际通用配方，6-BA、GA3、Vc、NAA、IBA、IAA分别为6-苄氨基嘌呤、赤霉酸、维生素C、萘乙酸、吲哚丁酸、吲哚-3-乙酸的简称。
综上所述，本发明由于采用了上述方案，具有以下有益效果：
（1）本发明能够迅速去除病毒和更新品种，加快了百合的快速繁殖速度，缩短了百合的生育周期，可以短时间内获得室内大规模繁殖的野生百合组培苗，组培成功率较高。
（2）本发明利用组织培养技术，有效降低了野生百合组织培养的污染率，且继代过程中不易出现内生菌污染，为百合野生资源的保护提供了有效的手段，具有潜在的生态效益和社会效益。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明一种野生百合的组织培养方法，作进一步说明。本发明培养基配方中所使用的各种原料均为常规市售产品，均能够通过市场购买得到。
实施例1
一种野生百合的组织培养方法，该组织培养方法是在开放式的条件下进行，其技术方案包括以下步骤：
步骤（1）：对准备进行野生百合培养的场地消毒灭菌，所用的消毒杀菌剂为次氯酸和氧化钙；
步骤（2）：选择野生百合的中层鳞片部位的鳞茎，随后将其切成条状，鳞茎稍加冲洗去掉泥土后，置于含洗洁精的水中浸洗30min，然后在自来水流下冲洗1h，再用75％酒精浸泡60s，再利用试管再生小鳞茎作为外植体；
步骤（3）：将步骤（2）的外植体直接接入诱导培养基上，所述诱导培养基为MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.3mg/L+Vc1mg/L，pH=5.8的固体培养基上，进行初始诱导培养25d，诱导出野生百合鳞片不定芽；
步骤（4）：将步骤（3）野生百合鳞片不定芽取出，接种于继代增殖培养基MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+GA30.2mg/L+IAA0.1mg/L，pH=5.8的固体培养基上，培养24d，得到野生百合组培苗；
步骤（5）：将步骤（4）得到的野生百合组培苗，接种到壮苗培养基A为MS+6-BA1mg/L+NAA0.01mg/L，pH=5.8的固体培养基上，培养15d，一周更换一次培养基，将长至2cm以上的组培苗分成单株，移至壮苗培养基B为MS+6-BA1mg/L+NAA0.01mg/L+GA30.1mg/L，pH=5.8的固体培养基上，培养20d，一周更换一次培养基，得到野生百合幼苗；若组培苗在壮苗培养基A上培养20d后还未长至2cm，则切除组培苗底部与培养基接触形成的黑褐色部分，底部茎端没入培养基3mm培养，更换壮苗培养基A，再继续培养7d；
步骤（6）：将步骤（5）长约4cm的野生百合幼苗，接种于生根培养基为1/2MS+NAA0.01mg/L+IBA1mg/L，pH=5.8的固体培养基上，其厚度为2cm，培养15d，直接进行诱导长出至少4条根且主根长度大于2cm，得到完整的植株；若生根培养20d生根情况仍达不到要求，则在原培养基上层再倒0.5cm厚生根培养基，用30℃水将组培瓶倾斜沿瓶壁缓缓倒入新加培养基；
步骤（7）：将步骤（6）所述的野生百合完整植株进行炼苗，将生根苗移接到室外进行培养。
进一步地，所述诱导培养、继代增殖培养、壮苗培养、生根培养均放置到培养室培养,培养温度为26±1℃、光照强度为1800Lx、光照时数为12h/d。
本实施例污染率为5%以下，不定芽诱导率为99%，增值系数为5.6，生根率为93%。缩短了百合的生育周期，提高了诱导率，有效解决了野生百合初代培养中易出现真菌、细菌污染、继代培养中易出现内生菌污染的问题。
实施例2
一种野生百合的组织培养方法，该组织培养方法是在开放式的条件下进行，其技术方案包括以下步骤：
步骤（1）：对准备进行野生百合培养的场地消毒灭菌，所用的消毒杀菌剂为氧化钙和恶霉灵；
步骤（2）：选择野生百合的中层鳞片部位的鳞茎，随后将其切成条状，鳞茎稍加冲洗去掉泥土后，置于含洗洁精的水中浸洗40min，然后在自来水流下冲洗3h，再用75％酒精浸泡90s，再利用试管再生小鳞茎作为外植体；
步骤（3）：将步骤（2）的外植体直接接入诱导培养基上，所述诱导培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.45mg/L+Vc2.5mg/L，pH=5.8的固体培养基上，进行初始诱导培养28d，诱导出野生百合鳞片不定芽；
步骤（4）：将步骤（3）野生百合鳞片不定芽取出，接种于继代增殖培养基MS+6-BA0.7mg/L+NAA0.45mg/L+GA30.3mg/L+IAA0.25mg/L，pH=5.8的固体培养基上，培养26d，得到野生百合组培苗；
步骤（5）：将步骤（4）得到的野生百合组培苗，接种到壮苗培养基A为MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.05mg/L，pH=5.8的固体培养基上，培养18d，一周更换一次培养基，将长至2cm以上的组培苗分成单株，移至壮苗培养基B为MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.5mg/L，pH=5.8的固体培养基上，培养23d，一周更换一次培养基，得到野生百合幼苗；若组培苗在壮苗培养基A上培养20d后还未长至2cm，则切除组培苗底部与培养基接触形成的黑褐色部分，底部茎端没入培养基4mm培养，更换壮苗培养基A，再继续培养8d；
步骤（6）：将步骤（5）长约4.5cm的野生百合幼苗，接种于生根培养基为1/2MS+NAA0.05mg/L+IBA1.5mg/L，pH=5.8的固体培养基上，其厚度为2.2cm，培养17d，直接进行诱导长出至少4条根且主根长度大于2cm，得到完整的植株；若生根培养20d生根情况仍达不到要求，则在原培养基上层再倒0.5cm厚生根培养基，用30℃水将组培瓶倾斜沿瓶壁缓缓倒入新加培养基；
步骤（7）：将步骤（6）所述的野生百合完整植株进行炼苗，将生根苗移接到室外进行培养。
进一步地，所述诱导培养、继代增殖培养、壮苗培养、生根培养均放置到培养室培养,培养温度为26±1℃、光照强度为1900Lx、光照时数为12h/d。
本实施例污染率为5%以下，不定芽诱导率为98%，增值系数为5.5，生根率为93%。缩短了百合的生育周期，提高了诱导率，有效解决了野生百合初代培养中易出现真菌、细菌污染、继代培养中易出现内生菌污染的问题。
实施例3
一种野生百合的组织培养方法，该组织培养方法是在开放式的条件下进行，其技术方案包括以下步骤：
步骤（1）：对准备进行野生百合培养的场地消毒灭菌，所用的消毒杀菌剂为次氯酸、氧化钙及恶霉灵；
步骤（2）：选择野生百合的中层鳞片部位的鳞茎，随后将其切成条状，鳞茎稍加冲洗去掉泥土后，置于含洗洁精的水中浸洗35min，然后在自来水流下冲洗2h，再用75％酒精浸泡75s，再利用试管再生小鳞茎作为外植体；
步骤（3）：将步骤（2）的外植体直接接入诱导培养基上，所述诱导培养基为MS+6-BA0.7mg/L+NAA0.6mg/L+Vc4mg/L，pH=5.8的固体培养基上，进行初始诱导培养30d，诱导出野生百合鳞片不定芽；
步骤（4）：将步骤（3）野生百合鳞片不定芽取出，接种于继代增殖培养基MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.6mg/L+GA30.4mg/L+IAA0.5mg/L，pH=5.8的固体培养基上，培养28d，得到野生百合组培苗；
步骤（5）：将步骤（4）得到的野生百合组培苗，接种到壮苗培养基A为MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L，pH=5.8的固体培养基上，培养20d，一周更换一次培养基，将长至2cm以上的组培苗分成单株，移至壮苗培养基B为MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L+GA31mg/L，pH=5.8的固体培养基上，培养25d，一周更换一次培养基，得到野生百合幼苗；若组培苗在壮苗培养基A上培养20d后还未长至2cm，则切除组培苗底部与培养基接触形成的黑褐色部分，底部茎端没入培养基5mm培养，更换壮苗培养基A，再继续培养10d；
步骤（6）：将步骤（5）长约5cm的野生百合幼苗，接种于生根培养基为1/2MS+NAA0.1mg/L+IBA2mg/L，pH=5.8的固体培养基上，其厚度为2.5cm，培养20d，直接进行诱导长出至少4条根且主根长度大于2cm，得到完整的植株；若生根培养20d生根情况仍达不到要求，则在原培养基上层再倒0.5cm厚生根培养基，用30℃水将组培瓶倾斜沿瓶壁缓缓倒入新加培养基；
步骤（7）：将步骤（6）所述的野生百合完整植株进行炼苗，将生根苗移接到室外进行培养。
进一步地，所述诱导培养、继代增殖培养、壮苗培养、生根培养均放置到培养室培养,培养温度为26±1℃、光照强度为2000Lx、光照时数为12h/d。
本实施例污染率为5%以下，不定芽诱导率为100%，增值系数为5.4，生根率为92%。缩短了百合的生育周期，提高了诱导率，有效解决了野生百合初代培养中易出现真菌、细菌污染、继代培养中易出现内生菌污染的问题。
综上所述，本发明利用组织培养技术，有效降低了野生百合组织培养的污染率，且继代过程中不易出现内生菌污染，能够迅速去除病毒和更新品种，加快了百合的快速繁殖速度，缩短了百合的生育周期，可以短时间内获得室内大规模繁殖的野生百合组培苗，组培成功率较高，为百合野生资源的保护提供了有效的手段，具有潜在的生态效益和社会效益。
以上所述仅为发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种野生百合的组织培养方法，其特征在于，该组织培养方法是在开放式的条件下进行，其技术方案包括以下步骤：
步骤（1）：对准备进行野生百合培养的场地消毒灭菌；
步骤（2）：选择野生百合的中层鳞片部位的鳞茎，随后将其切成条状，对其进行灭菌处理，再利用试管再生小鳞茎作为外植体；
步骤（3）：将步骤（2）的外植体直接接入诱导培养基上，进行初始诱导培养25-30d，诱导出野生百合鳞片不定芽；
步骤（4）：将步骤（3）长约0.5-2cm的野生百合鳞片不定芽取出，接种于继代增殖培养基上培养24-28d，得到野生百合组培苗；
步骤（5）：将步骤（4）得到的野生百合组培苗，接种到壮苗培养基A上培养15-20d，一周更换一次培养基，将长至2cm以上的组培苗分成单株，移至壮苗培养基B上，培养20-25d，一周更换一次培养基，得到野生百合幼苗；
步骤（6）：将步骤（5）长约4-5cm的野生百合幼苗，接种于生根培养基上培养15-20d，直接进行诱导长出至少4条根且主根长度大于2cm，得到完整的植株；若生根培养20d生根情况仍达不到要求，则在原培养基上层再倒0.5cm厚生根培养基，用30℃水将组培瓶倾斜沿瓶壁缓缓倒入新加培养基；
步骤（7）：将步骤（6）所述的野生百合完整植株进行炼苗，将生根苗移接到室外进行培养。
2.根据权利要求1所述的一种野生百合的组织培养方法，其特征在于：在步骤（1）所述开放式条件下使用的消毒杀菌剂为次氯酸、氧化钙或恶霉灵的一种或者几种。
3.根据权利要求1所述的一种野生百合的组织培养方法，其特征在于：在步骤（2）所述灭菌处理指：鳞茎稍加冲洗去掉泥土后，置于含洗洁精的水中浸洗30-40min，然后在自来水流下冲洗1-3h，再用75％酒精浸泡60-90s。
4.根据权利要求1所述的一种野生百合的组织培养方法，其特征在于：步骤（3）所述诱导培养基为MS+6-BA0.3-0.7mg/L+NAA0.3-0.6mg/L+Vc1-4mg/L，pH=5.8的固体培养基。
5.根据权利要求1所述的一种野生百合的组织培养方法，其特征在于：在步骤（4）中，所述的继代增殖培养基是固体培养基，其有效成分为MS+6-BA0.5-1.0mg/L+NAA0.3-0.6mg/L+GA30.2-0.4mg/L+IAA0.1-0.5mg/L，pH=5.8。
6.根据权利要求1所述的一种野生百合的组织培养方法，其特征在于：步骤（5）所述壮苗培养基A为MS+6-BA1-2mg/L+NAA0.01-0.1mg/L，pH=5.8的固体培养基；壮苗培养基B为MS+6-BA1-2mg/L+NAA0.01-0.1mg/L+GA30.1-1mg/L，pH=5.8的固体培养基。
7.根据权利要求1所述的一种野生百合的组织培养方法，其特征在于：在步骤（6）所述生根培养基为1/2MS+NAA0.01-0.1mg/L+IBA1-2mg/L，pH=5.8的固体培养基，其厚度为2-2.5cm。
8.根据权利要求1所述的一种野生百合的组织培养方法，其特征在于：在步骤（5）若组培苗在壮苗培养基A上培养20d后还未长至2cm，则切除组培苗底部与培养基接触形成的黑褐色部分，底部茎端没入培养基3-5mm培养，更换壮苗培养基A，再继续培养7-10d。
9.根据权利要求1至8任一项所述的一种野生百合的组织培养方法，其特征在于：所述诱导培养、继代增殖培养、壮苗培养、生根培养均放置到培养室培养,培养温度为26±1℃、光照强度为1800-2000Lx、光照时数为12h/d。
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