CN109220789A - 苹果砧木m9-t337的组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种苹果砧木M9‑T337的组培快繁方法，包括如下步骤：取M9‑T337茎尖作为外植体材料，清洗消毒后接种于诱导培养基上诱导出芽，诱导的芽在显微镜下剥出茎尖，再次消毒后转接到缓冲培养基上，诱导无菌芽，无菌芽转接到诱导丛生芽的培养基上培养，丛生芽分株转接到增殖培养基上培养，增殖苗大小分级后，转接到无糖培养盒中，25‑35天后出苗移栽。本发明的苹果砧木M9‑T337的组培快繁方法通过先进的组培生产技术生产M9‑T337组培苗，及利用无糖快繁技术进行生根练苗，可以加快M9‑T337产业优质高效发展。
Description
技术领域
本发明涉及植物组培快繁技术领域，具体来说，涉及一种苹果砧木M9-T337的组培快繁方法。
背景技术
M9-T337是荷兰木本苗木植物苗圃检测服务中心从M9系选育出来的苹果矮化自根砧木优系，又称NAKB T337。比M9矮化程度大20%，易压条繁殖。果业发达国家（如意大利、法国、荷兰等）广泛推广并已获得巨大成功的高纺锤树形果园多采用这种矮化砧。该砧木具有更好的苗圃性状，除了压条易繁殖外，还能春季利用硬枝进行扦插生根，苗木生长整齐。叶片略小，易萌发二次枝。果业发达国家生产上利用该砧木，将两年生自根砧成品苗于60-70cm处短截，培育成带分枝的大苗，具有易成花、早丰产、适应性广等特点，建园成形快、结果早，通常第2-3年即形成可观产量。M9-T337矮化自根砧育苗具有育苗简单、园貌整齐、结果早、产量高、品质好等优点，是世界苹果生产发展的趋势。
2011年，烟台市果茶工作站利用国家项目支持从意大利引进一批M9-T337脱毒砧木定植于山东省莱州市小草沟大自然园艺科技有限公司繁育基地。通过三年的实验研究，和对前人育苗经验进行归纳总结，提出了M9-T337矮化自根砧的育苗技术流程，从砧木母本园建设、砧木繁育、苗木繁育、嫁接技术、嫁接苗管理、土肥水管理和培养带分枝大苗7个方面，对M9-T337矮化自根砧苹果苗的繁育技术进行了论述。目前，M9-T337种苗市场短缺，急需一种M9-T337组织培养增殖的配方和快速生根的方法。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种苹果砧木M9-T337的组培快繁方法，能够克服现有技术的上述不足。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种苹果砧木M9-T337的组培快繁方法，包括以下步骤：
（1）M9-T337外植体选择与接种：
取高5-8cm、长势良好均匀的、幼嫩的M9-T337茎尖作为外植体材料；洗去表面的尘土，用洗洁精清洗20min，进而在流水下冲洗2h，最后用无菌水冲洗后置于超净工作台，进行消毒，消毒结束后，接种于诱导培养基上，诱导培养基配方为MS+6-BA0.7mg/L+NAA0.1mg/L+2%-3%蔗糖，每瓶接种3个外植体，置于培养室的培养架上诱导培养，20天诱导出芽；
（2）茎尖脱毒：
将步骤（1）诱导的芽在显微镜下剥出茎尖，再次消毒，消毒结束后将芽的茎尖转接到缓冲培养基上，诱导无菌芽，所述缓冲培养基配方为MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.01mg/L+2%-3%蔗糖，培养40天；
（3）丛生芽诱导：
将步骤（2）培养的生长良好、经分子技术检测无菌、高2-5cm的M9-T337无菌芽转接到诱导丛生芽的培养基上，所述诱导丛生芽的培养基配方为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+3%蔗糖，放置到培养室培养；
（4）增殖扩繁：
将步骤（3）培养的M9-T337丛生芽分株转接到增殖培养基上，放置到培养室培养，30天后可再次转接；
（5）生根培养：
将增殖苗大小分级后，转接到无糖培养盒中，前3-5天依靠所述无糖培养盒的容器本身的6个自然透气孔进行气体交换，3-5天后人工强制向所述无糖培养盒的容器内通CO2气体，25-35天后，可出苗移栽。
进一步的，步骤（1）中外植体的消毒方法为：在无菌条件下，先将外植体放入75%酒精中，轻轻晃动30s后将其用无菌水冲洗2遍，再用0.1%的升汞溶液消毒8min后用无菌水冲洗5-6遍。
进一步的，步骤（1）中所述诱导培养条件为：温度25±1℃，光照强度2000Lx，每天光照12h。
进一步的，步骤（2）中茎尖的消毒的方法为：先将茎尖用75%的酒精消毒20s，然后用无菌水冲洗2遍，再用2%的次氯酸钠消毒20min左右，最后用无菌水冲洗5遍以上。
进一步的，步骤（4）中所述增殖培养基的初始配方为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+3%蔗糖，随着继代次数增多，植物激素含量逐渐降低，所述增殖培养基最终配方为MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.02mg/L+2%蔗糖；最佳增殖培养基配方为MS+6-BA0.4mg/L+NAA0.02mg/L+3%蔗糖,增殖天数20天。
进一步的，步骤（5）中出苗移栽前练苗1-3天即可。
本发明的有益效果：
（1）外植体消毒结合茎尖脱毒技术，可祛除植物体内98%以上的病原物，增加抗性，增强长势，优于单独使用组培脱毒的方式；
（2）腋芽诱导成功后先转入缓冲培养基上，可显著提高成活率的同时降低畸形苗的发生；
（3）增殖培养基配方分化率高，增殖倍数大、增殖时间短、增殖苗长势好无异常苗；
（4）本发明采用无糖培养生根方法生根多，根系发达，缩短了生根练苗天数至少30-60天，且无糖组培半封闭式培养环境完善了叶片功能，提高了M9-T337组培苗的光合作用能力，继而提高了移栽成活率，自养能力较传统组培苗强，移栽成活率达90%以上，而传统组培方式成活率平均不足50%；
（5）本发明的苹果砧木M9-T337的组培快繁方法整个组培体系周期缩短，无需长时间练苗，成活率高，不仅加快了规模化的生产速度，还提高了M9-T337生产质量，从而解决M9-T337种苗市场短缺等问题，推动产业快速健康发展。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种苹果砧木M9-T337的组培快繁方法，包括以下步骤：
（1）M9-T337外植体选择与接种：
取高5-8cm、长势良好均匀的、幼嫩的M9-T337茎尖作为外植体材料；洗去表面的尘土，用洗洁精清洗20min，进而在流水下冲洗2h，最后用无菌水冲洗后置于超净工作台；在无菌条件下，先将外植体放入75%酒精中，轻轻晃动30s后将其用无菌水冲洗2遍，再用0.1%的升汞溶液消毒8min后用无菌水冲洗5遍；消毒结束后，接种于诱导培养基上，诱导培养基配方为MS+6-BA0.7mg/L+NAA0.1mg/L+2%蔗糖；每瓶接种3个外植体，置于培养室的培养架上诱导培养，培养温度为25±1℃，光照强度2000Lx，每天光照12h，20天诱导出芽；
（2）茎尖脱毒：
将步骤（1）诱导的芽在显微镜下剥出茎尖，再次消毒，消毒时先将茎尖用75%的酒精消毒20s，然后用无菌水冲洗2遍，再用2%的次氯酸钠消毒20min左右，最后用无菌水冲洗5遍；消毒结束后将芽的茎尖转接到缓冲培养基上，诱导无菌芽，缓冲培养基配方为MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.01mg/L+2%蔗糖，培养40天；
（3）丛生芽诱导：
将步骤（2）培养的生长良好、经分子技术检测无菌、高2-5cm的M9-T337无菌芽转接到诱导丛生芽的培养基上，诱导丛生芽的培养基配方为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+3%蔗糖，放置到培养室培养，20天后开始诱导出丛生芽，30天后丛生芽生长到1-3cm的高度,诱导倍数1-3倍；
（4）增殖扩繁：
将步骤（3）培养的M9-T337丛生芽分株转接到增殖培养基上，增殖培养基初始配方为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+3%蔗糖，随着继代次数增多，植物激素含量逐渐降低，增殖培养基最终配方为MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.02mg/L+2%蔗糖；放置到培养室培养，30天后可再次转接；
（5）生根培养：
将增殖苗大小分级后，转接到无糖培养盒中，前3天依靠容器本身的6个自然透气孔进行气体交换，3天后人工强制往培养容器内通CO2气体。25天后出苗移栽。移栽前无需长时间练苗，1天即可；成活率达90%。
实施例2
一种苹果砧木M9-T337的组培快繁方法，包括以下步骤：
（1）M9-T337外植体选择与接种：
取高5-8cm、长势良好均匀的、幼嫩的M9-T337茎尖作为外植体材料；洗去表面的尘土，用洗洁精清洗20min，进而在流水下冲洗2h，最后用无菌水冲洗后置于超净工作台；在无菌条件下，先将外植体放入75%酒精中，轻轻晃动30s后将其用无菌水冲洗2遍，再用0.1%的升汞溶液消毒8min后用无菌水冲洗6遍；消毒结束后，接种于诱导培养基上，诱导培养基配方为MS+6-BA0.7mg/L+NAA0.1mg/L+3%蔗糖；每瓶接种3个外植体，置于培养室的培养架上诱导培养，培养温度为25±1℃，光照强度2000Lx，每天光照12h，20天诱导出芽；
（2）茎尖脱毒：
将步骤（1）诱导的芽在显微镜下剥出茎尖，再次消毒，消毒时先将茎尖用75%的酒精消毒20s，然后用无菌水冲洗2遍，再用2%的次氯酸钠消毒20min左右，最后用无菌水冲洗6遍；消毒结束后将芽的茎尖转接到缓冲培养基上，诱导无菌芽，缓冲培养基配方为MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.01mg/L+3%蔗糖，培养40天；
（3）丛生芽诱导：
将步骤（2）培养的生长良好、经分子技术检测无菌、高2-5cm的M9-T337无菌芽转接到诱导丛生芽的培养基上，诱导丛生芽的培养基配方为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+3%蔗糖，放置到培养室培养，20天后开始诱导出丛生芽，30天后丛生芽生长到1-3cm的高度,诱导倍数1-3倍；
（4）增殖扩繁：
将步骤（3）培养的M9-T337丛生芽分株转接到增殖培养基上，增殖培养基初始配方为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+3%蔗糖，随着继代次数增多，植物激素含量逐渐降低，增殖培养基最终配方为MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.02mg/L+2%蔗糖；放置到培养室培养，30天后可再次转接；
（5）生根培养：
将增殖苗大小分级后，转接到无糖培养盒中，前5天依靠容器本身的6个自然透气孔进行气体交换，5天后人工强制往培养容器内通CO2气体。35天后出苗移栽。移栽前练苗3天即可；成活率达92%。
综上所述，借助于本发明的上述技术方案，通过先进的组培生产技术生产M9-T337组培苗，及利用无糖快繁技术进行生根练苗，可以加快M9-T337产业优质高效发展。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种苹果砧木M9-T337的组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）M9-T337外植体选择与接种：
取高5-8cm、幼嫩的M9-T337茎尖作为外植体材料；洗去表面的尘土，用洗洁精清洗20min，进而在流水下冲洗2h，最后用无菌水冲洗后置于超净工作台，进行消毒，消毒结束后，接种于诱导培养基上，诱导培养基配方为MS+6-BA0.7mg/L+NAA0.1mg/L+2%-3%蔗糖，每瓶接种3个外植体，置于培养室的培养架上诱导培养，20天诱导出芽；
（2）茎尖脱毒：
将步骤（1）诱导的芽在显微镜下剥出茎尖，再次消毒，消毒结束后将芽的茎尖转接到缓冲培养基上，诱导无菌芽，所述缓冲培养基配方为MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.01mg/L+2%-3%蔗糖，培养40天；
（3）丛生芽诱导：
将步骤（2）培养的生长良好、经分子技术检测无菌、高2-5cm的M9-T337无菌芽转接到诱导丛生芽的培养基上，所述诱导丛生芽的培养基配方为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+3%蔗糖，放置到培养室培养；
（4）增殖扩繁：
将步骤（3）培养的M9-T337丛生芽分株转接到增殖培养基上，放置到培养室培养，30天后可再次转接；
（5）生根培养：
将步骤（4）培养的增殖苗按大小分级后，转接到无糖培养盒中，前3-5天依靠所述无糖培养盒的容器本身的6个自然透气孔进行气体交换，3-5天后人工强制向所述无糖培养盒的容器内通CO2气体，25-35天后，可出苗移栽。
2.根据权利要求1所述的苹果砧木M9-T337的组培快繁方法，其特征在于，步骤（1）中外植体的消毒方法为：在无菌条件下，先将外植体放入75%酒精中，轻轻晃动30s后将其用无菌水冲洗2遍，再用0.1%的升汞溶液消毒8min后用无菌水冲洗5-6遍。
3.根据权利要求1所述的苹果砧木M9-T337的组培快繁方法，其特征在于，步骤（1）中所述诱导培养条件为：温度25±1℃，光照强度2000Lx，每天光照12h。
4.根据权利要求1所述的苹果砧木M9-T337的组培快繁方法，其特征在于，步骤（2）中茎尖的消毒的方法为：先将茎尖用75%的酒精消毒20s，然后用无菌水冲洗2遍，再用2%的次氯酸钠消毒20min，最后用无菌水冲洗5遍以上。
5.根据权利要求1所述的苹果砧木M9-T337的组培快繁方法，其特征在于，步骤（4）中所述增殖培养基的初始配方为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+3%蔗糖，随着继代次数增多，植物激素含量逐渐降低，所述增殖培养基最终配方为MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.02mg/L+2%蔗糖。
6.根据权利要求1所述的苹果砧木M9-T337的组培快繁方法，其特征在于，步骤（5）中出苗移栽前练苗1-3天即可。
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|---|---|---|---|---|
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