CN103583357A - 一种生石花无菌播种及再生体系建立的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生石花无菌播种及再生体系建立的方法，具体操作步骤如下：1）培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分；2)种子消毒及接种；3）愈伤组织的诱导及分化；4）不定芽的增殖；5）壮苗培养。本发明有益的效果：本发明利用植物组织培养技术对生石花进行无菌播种及再生快繁，能够在短时间内获得大量遗传性状一致的优质壮苗，克服了常规繁殖方法慢的缺点，对其规模化生产和种质资源收集及保存都具有积极意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术、植物茎尖培养技术，主要是一种生石花无菌播种及再生体系建立的方法。
背景技术
生石花(Lithops pseudotruncatella)为番杏科生石花属植物。因其形态独特、色彩斑斓，是很受欢迎的小型观赏多肉植物。其自然繁殖率低，且原产地不在我国，加之人类过度采掘和对其生境的破坏，目前数量较少、市售价格居高不下，使其推广受到限制。因此，利用植物组织培养技术进行阿房宫寿的快速繁殖，对于保存优良种质资源、繁殖名优珍稀品种具有重要的意义，以实现其规模化生产以满足国内外市场的需求。植物组织培养方法可以在短期内快使植物速繁殖，不仅繁殖速度块，且因为是无性繁殖可以保持与母株的一致的遗传性状。但是，在此之前还没有关于建立生石花组培再生体系的报道，更没有成功的实例。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种生石花无菌播种及再生体系建立的方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种生石花无菌播种及再生体系建立的方法，包括如下步骤：
1）、培养基的配制：
（1）基本培养基：MS或1/2MS，其中蔗糖20～30g/L，琼脂5～9g/L，pH=5.8;
（2）诱导培养基：MS+6-BA0.1～0.5mg/L+NAA0.05～0.1mg/L;
（3）分化培养基：MS+6-BA0～0.05mg/L；
（4）增殖培养基：MS+6-BA0.05～0.3mg/L+NAA0.05～0.1mg/L;
2）种子的消毒及接种：以生石花的种子为外植体材料，将消毒处理后的种子在无菌条件下接种于诱导培养基上培养；
3）愈伤组织的诱导及分化：将步骤2）种子萌发后诱导愈伤组织形成并进行不定芽的分化培养；
4）不定芽的增殖：将步骤3）的不定芽丛接种于增殖培养基上进行增殖培养；
5）壮苗培养：将步骤4）不定芽分成单株后转至基本培养基上进行壮苗培养。
进一步地，本发明在所述步骤1）中，所述的培养基包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分具体为：
（1）基本培养基：MS培养基，其中蔗糖20～30g/L，琼脂5～9g/L，pH=5.8;
（2）诱导培养基：MS+6-BA0.1～0.5mg/L+NAA0.05～0.1mg/L;
（3）分化培养基：MS+6-BA0～0.05mg/L；
（4）增殖培养基：MS+6-BA0.05～0.3mg/L+NAA0.05～0.1mg/L;
进一步地，本发明在所述步骤2）中，以生石花的种子为外植体材料，将其置于1.5ml或2ml的PE离心管中进行消毒处理，先用洗洁精溶液浸泡0.5h后再用自来水清洗，然后依次在体积比为70%的酒精溶液和有效氯浓度为1%的次氯酸钠溶液中分别浸泡30s和6min，最后用无菌水冲洗3～5遍，每遍2min(移液枪操作)。
进一步地，本发明在所述步骤3）中，种子培养2～4周后陆续萌发，萌发后的生石花在诱导培养基上培养2～3周后有愈伤组织形成，挑取生长状态较好的愈伤组织至于分化培养基上培养，约4周后愈伤组织开始分化不定芽。
进一步地，本发明在所述步骤5）中，不定芽分成单株后转至基本培养基上进行壮苗培养（剥去皮蜕），培养2～4周后成为具有根系的壮苗。
进一步地，本发明在所述步骤3）、4）、5）中，所述的培养条件是，培养温度为23±2℃、光照强度为60～100μmol·m-2·s-1、光照时间为10～16小时/天；
本发明的有益效果是：利用植物组织培养技术对生石花进行了播种及再生快繁培养，能够在较短时间内获得大量遗传性状一致的优质壮苗，克服了常规繁殖方法慢的缺点，对其规模化生产和种质资源保存都具有积极意义，同时本技术也为其遗传转化体系的建立奠定了坚实的实验基础。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步阐述，实施例将帮助更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。
实施例1
本发明提供了一种生石花无菌播种及再生体系建立的方法，其步骤为：
1）、培养基的配制
（1）基本培养基：MS培养基，其中蔗糖30g/L，琼脂7.5g/L，pH=5.8;
（2）诱导培养基：MS+6-BA0.1～0.5mg/L+NAA0.05～0.1mg/L;
（3）分化培养基：MS+6-BA0～0.05mg/L；
（4）增殖培养基：MS+6-BA0.05～0.3mg/L+NAA0.05～0.1mg/L;
2）、种子的消毒及接种
以生石花的种子为外植体材料，将其置于1.5ml或2ml的PE离心管中进行消毒处理，先用洗洁精溶液浸泡0.5h后再用自来水清洗，然后依次在体积比为70%的酒精溶液和有效氯浓度为1%的次氯酸钠溶液中分别浸泡30s和6min，最后用无菌水冲洗3～5遍，每遍2min(移液枪操作)。
3）、愈伤组织的诱导及分化
种子培养2～4周后陆续萌发，萌发后的生石花在诱导培养基上培养2～3周后有愈伤组织形成，挑取生长状态较好的愈伤组织至于分化培养基上培养，约4周后愈伤组织开始分化不定芽；培养温度为23±2℃、光照强度为60～100μmol·m-2·s-1、光照时间为10～16小时/天；
4）、不定芽的增殖
将生石花的不定芽丛接种于增殖培养基上进行增殖培养；培养温度为23±2℃、光照强度为60～100μmol·m-2·s-1、光照时间为10～16小时/天；
5）、壮苗培养
将增殖芽丛在无菌条件下切割成单株后转接到基本培养基上进行壮苗培养（适时剥去皮蜕），培养30～50天后成为具有根系的壮苗;培养温度为23±2℃、光照强度为60～100μmol·m-2·s-1、光照时间为10～16小时/天。
实施例2
本发明提供了一种生石花无菌播种及再生体系建立的方法，其步骤为：
1）、培养基的配制
（1）基本培养基：MS培养基，其中蔗糖20～30g/L，琼脂5～9g/L，pH=5.8;
（2）诱导培养基：MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.05mg/L;
（3）分化培养基：MS+6-BA0.05mg/L；
（4）增殖培养基：MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L;
2）、种子的消毒及接种
以生石花的种子为外植体材料，将其置于1.5ml或2ml的PE离心管中进行消毒处理，先用洗洁精溶液浸泡0.5h后再用自来水清洗，然后依次在体积比为70%的酒精溶液和有效氯浓度为1%的次氯酸钠溶液中分别浸泡30s和6min，最后用无菌水冲洗3～5遍，每遍2min(移液枪操作)。
3）、愈伤组织的诱导及分化
种子培养2～4周后陆续萌发，萌发后的生石花在诱导培养基上培养2～3周后有愈伤组织形成，挑取生长状态较好的愈伤组织至于分化培养基上培养，约4周后愈伤组织开始分化不定芽；培养温度为23±2℃、光照强度为60～100μmol·m-2·s-1、光照时间为10～16小时/天；
4）、不定芽的增殖
将生石花的不定芽丛接种于增殖培养基上进行增殖培养；培养温度为23±2℃、光照强度为60～100μmol·m-2·s-1、光照时间为10～16小时/天；
5）、壮苗培养
将增殖芽丛在无菌条件下切割成单株后转接到基本培养基上进行壮苗培养（适时剥去皮蜕），培养30～50天后成为具有根系的壮苗;培养温度为23±2℃、光照强度为60～100μmol·m-2·s-1、光照时间为10～16小时/天。
最后需要说明的是，除本实施例外，本发明还可以有其它实施方式和变形，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。凡本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种生石花无菌播种及再生体系建立的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
1）、培养基的配制：
（1）基本培养基：MS或1/2MS，其中蔗糖20～30g/L，琼脂5～9g/L，pH=5.8;
（2）诱导培养基：MS+6-BA0.1～0.5mg/L+NAA0.05～0.1mg/L;
（3）分化培养基：MS+6-BA0～0.05mg/L；
（4）增殖培养基：MS+6-BA0.05～0.3mg/L+NAA0.05～0.1mg/L;
2）种子的消毒及接种：以生石花的种子为外植体材料，将消毒处理后的种子在无菌条件下接种于诱导培养基上培养；
3）愈伤组织的诱导及分化：将步骤2）种子萌发后诱导愈伤组织形成并进行不定芽的分化培养；
4）不定芽的增殖：将步骤3）的不定芽丛接种于增殖培养基上进行增殖培养；
5）壮苗培养：将步骤4）不定芽分成单株后转至基本培养基上进行壮苗培养。
2.根据权利要求1所述的生石花无菌播种及再生体系建立的方法，其特征在于：在所述步骤1）中，所述的培养基包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分具体为：
（1）基本培养基：MS培养基，其中蔗糖20～30g/L，琼脂5～9g/L，pH=5.8;
（2）诱导培养基：MS+6-BA0.1～0.5mg/L+NAA0.05～0.1mg/L;
（3）分化培养基：MS+6-BA0～0.05mg/L；
（4）增殖培养基：MS+6-BA0.05～0.3mg/L+NAA0.05～0.1mg/L。
3.根据权利要求1所述的生石花无菌播种及再生体系建立的方法，其特征在于：在所述步骤2）中，以生石花的种子为外植体材料，将其置于1.5ml或2ml的PE离心管中进行消毒处理，先用洗洁精溶液浸泡0.5h后再用自来水清洗，然后依次在体积比为70%的酒精溶液和有效氯浓度为1%的次氯酸钠溶液中分别浸泡30s和6min，最后用无菌水冲洗3～5遍，每遍2min。
4.根据权利要求1所述的生石花无菌播种及再生体系建立的方法，其特征在于：在所述步骤3）中，种子培养2～4周后陆续萌发，萌发后的生石花在诱导培养基上培养2～3周后有愈伤组织形成，挑取生长状态较好的愈伤组织至于分化培养基上培养，4周后愈伤组织开始分化不定芽。
5.根据权利要求1所述的生石花无菌播种及再生体系建立的方法，其特征在于：在所述步骤5）中，不定芽分成单株后转至基本培养基上进行壮苗培养，培养2～4周后成为具有根系的壮苗。
6.根据权利要求1所述的生石花无菌播种及再生体系建立的方法，其特征在于：在所述步骤3）、4）、5）中，所述的培养条件是，培养温度为23±2℃、光照强度为60～100μmol·m-2·s-1、光照时间为10～16小时/天。
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