CN112167063A - 一种双脱毒苹果苗的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及苹果栽培领域，提供了一种双脱毒苹果苗的培育方法，包括：S1.脱毒砧木苗和目标品种苗的制备；S2.对脱毒砧木苗和目标品种苗进行生根、驯化和移栽培养；其中，脱毒的砧木苗在驯化中移栽至苗圃中，脱毒的目标品种苗在驯化中移栽至营养钵中；S3.双脱毒苹果苗的嫁接及培养；其中，步骤S1包括外植体的预处理、茎尖培养、多次高温钝化和增值培养及脱毒检测，且步骤S1对砧木和目标品种进行同时处理；综上，将脱毒处理后的砧木与品种进行嫁接，获得所需要的双脱毒苗，以此有效实现苗木无毒，抑制土壤土传性病害的传播，并增对强土传根茎腐烂病、根朽病等病害的抗性，进而能减少农药的使用，为生产绿色无公害水果创造条件。
Description
技术领域
本发明涉及苹果栽培领域，特别涉及一种双脱毒苹果苗的培育方法。
背景技术
苹果，属于蔷薇科大宗水果，不仅是我国最主要的果品，也是世界上种植最广、产量最多的果品；其味道酸甜适口，营养丰富。
在现有苹果种植中存在苗木品种老化、根系欠发达、病虫害严重、结果率不高等问题。各国研究表明大多数苹果栽培品种，都感染一种或者数种病毒，其中以苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎痘病毒和苹果茎沟病毒分布最广，危害性最大。虽然现有的技术已经研究出各种脱毒苹果苗，但分析我国苹果产业的种苗供应体系及商业化市场，不难看出，国内大量使用传统嫁接苗，而目前市场的脱毒苹果苗只是进行了品种脱毒处理，而对于所嫁接的砧木并未脱毒，在此情况下，由于砧木根系带毒，使得脱毒苹果苗还会继续侵染病毒，难以真正实现苗木无毒；
综上可知，需要进一步培育出双脱毒的苹果苗。
发明内容
鉴于此，在本发明中提供一种双脱毒苹果苗的培育方法，以实现砧木和品种的双脱毒培育。
本发明所述的一种双脱毒苹果苗的培育方法，包括如下步骤：
S1.脱毒砧木苗和目标品种苗的制备
外植体的预处理：在夏季晴天午后2点-3点，选取目标砧木上半木质化茎段作为砧木组培用外植体，选取目标苹果品种的幼嫩枝条作为品种组培用外植体，采取体积浓度75％酒精和质量浓度为0.1％升汞配合使用的方式对砧木和品种的组培用外植体进行间隔2天的两次体外消毒，消毒后均置入4℃的冰箱中冷藏20-30天；
茎尖培养：将冷藏后的组培用外植体接种在第一接种培养基中培养12-15天至发芽，发芽后截取1.5-2cm的芽体，接种于第二接种培养基上培养；
初次高温钝化：将上述第二接种培养基置入38℃-40℃的光照培养箱中培养1个月，进行高温钝化，然后剥离芽尖0.2-1.0mm接入第三接种培养基中培养；
二次高温钝化：将上述第三接种培养基再次置入上述光照培养箱中培养30-45天；
增值培养及脱毒检测：将二次高温钝化培养后生长的新芽割下，并接种于增值培养基中，在25℃、光照时长12小时、光照强度6000LX的条件下增值培养20-30天，获得脱毒的砧木苗和目标品种苗，并对脱毒苗进行病毒检测及鉴定；
S2.对脱毒砧木苗和目标品种苗进行生根、驯化和移栽培养；其中，脱毒的砧木苗在驯化中移栽至苗圃中，脱毒的目标品种苗在驯化中移栽至营养钵中；
S3.双脱毒苹果苗的嫁接及培养
嫁接：取脱毒目标品种苗的1-3cm嫩芽，消毒后经6-BA进行预处理；取健壮的脱毒砧木苗，并对其顶端和根端进行切除，留茎长2cm、根长4-5cm，然后在距顶端3-4mm处嫁接预处理后的脱毒目标品种苗的嫩芽；
培养：将嫁接好的苗放入第一嫁接培养基中，在25℃、光照时长16小时、光照强度2000LX的条件下培养6-7天，然后转入第二嫁接培养基中继续培养，获得双脱毒苗。
进一步地，在外植体的预处理步骤中，所截取的半木质化茎段为5-15cm。
优选的，所述第一/第二/第三接种培养基均为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+GA30.1mg/L+CH200mg/L。
优选的，所述增值培养基为：MT+蔗糖35mg/L+6-BA0.1mg/L+IBA0.05mg/L+GA30.03mg/L+CH200mg/L。
优选的，所述第一嫁接培养基为1/2MT+蔗糖35g/L，PH为5.7-5.9；所述第二嫁接培养基为1/2MT+蔗糖30g/L+GA30.5mg/L，PH为5.8-5.9。
进一步地，在步骤S2中，对脱毒砧木苗和目标品种苗进行生根、驯化和移栽培养包括：
生根培养：将成功通过病毒检测及鉴定的脱毒苗进行至少一次继代培养，然后转移至生根培养基中进行20-30天的生根培养；
温室驯化及移栽：将经生根培养的脱毒苗转移至温室大棚内，覆膜遮阴，5天后将脱毒苗移栽至穴盘中，在逐渐增加光照和通风时间的条件下继续驯化5-10天，然后将脱毒的砧木苗移栽至苗圃中、脱毒的目标品种苗移栽至营养钵中，并继续增加光照和通风时间，直至完全适应外界环境。
优选的，所述生根培养基为：MS+NAA0.5mg/L。
进一步地，在步骤S3中，对脱毒目标品种苗的嫩芽进行消毒时包括：
将嫩芽置入2％NaClO内，进行震荡消毒，且消毒时间为7min；
消毒后，用无菌水冲洗4-5次。
优选的，在步骤S3中，利用0.5mg/L或1.0mg/L的6-BA对消毒后的嫩芽进行10min的浸入预处理。
进一步地，在步骤S3中，当双脱毒苗的苗高培养至10cm以上时，将双脱毒苗移栽至苗圃中。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
在本发明中，将脱毒处理后的砧木与目标品种进行嫁接，获得所需要的双脱毒苗，以此有效实现苗木无毒，抑制土壤土传性病害的传播，并增对强土传根茎腐烂病、根朽病等病害的抗性，进而能减少农药的使用，为生产绿色无公害水果创造条件；并且，本发明所提供的方法可同步实现砧木与目标品种的脱毒处理，由此大大缩短了双脱毒苗的培育时间。
上述，在进行脱毒处理过程中，通过对消毒方法的改进能有效降低外植体培养过程中的被污染率，进而提高外植体培养的存活率。
上述，在进行嫁接处理过程中，利用2％NaClO进行脱毒目标品种苗嫩芽的消毒处理，并利用0.5mg/L或1.0mg/L的6-BA进行浸入预处理，以此有效提高嫁接存活率，进而有效实现双脱毒苹果苗的规模化生产。
具体实施方式
下面对本发明的实施方式进行具体说明。
一种双脱毒苹果苗的培育方法，包括如下步骤：
S1.脱毒砧木苗和目标品种苗的制备
S11.外植体的预处理：在夏季晴天午后2点，以芒果树为目标砧木，并截取芒果树上10cm的半木质化茎段作为砧木组培用外植体，选取德美1号苹果的幼嫩枝条作为品种组培用外植体，且德美1号选自甘肃德美地缘集团选育的苹果品种，采取体积浓度75％酒精和质量浓度为0.1％升汞配合使用的方式对砧木和品种的组培用外植体进行间隔2天的两次体外消毒，消毒后均置入4℃的冰箱中冷藏25天；
S12.茎尖培养：将冷藏后的组培用外植体接种在第一接种培养基中培养15天至发芽，发芽后截取2cm的芽体，接种于第二接种培养基上培养；
S13.初次高温钝化培养：将上述第二接种培养基置入39℃的光照培养箱中培养1个月，进行高温钝化，然后剥离芽尖0.5mm接入第三接种培养基中培养；其中，第一/第二/第三接种培养基均为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+GA30.1mg/L+CH200mg/L；
S14.二次高温钝化培养：将上述第三接种培养基再次置入上述光照培养箱中培养38天；
S15.增值培养及脱毒检测：将二次高温钝化培养后生长的新芽割下，并接种于增值培养基中，在25℃、光照时长12小时、光照强度6000LX的条件下增值培养25天，获得脱毒的砧木苗和目标品种苗，并对脱毒苗进行病毒检测及鉴定；其中，增值培养基为：MT+蔗糖35mg/L+6-BA0.1mg/L+IBA0.05mg/L+GA30.03mg/L+CH200mg/L；
S2.对脱毒砧木苗和目标品种苗进行生根、驯化和移栽培养；其中，脱毒的砧木苗在驯化中移栽至苗圃中，脱毒的目标品种苗在驯化中移栽至营养钵中：
S21.生根培养：将成功通过病毒检测及鉴定的脱毒苗进行至少一次继代培养，然后转移至生根培养基中进行20-30天的生根培养；其中，生根培养基为：MS+NAA0.5mg/L；
S22.温室驯化及移栽：将经生根培养的脱毒苗转移至温室大棚内，覆膜遮阴，5天后将脱毒苗移栽至穴盘中，在逐渐增加光照和通风时间的条件下继续驯化5-10天，然后将脱毒的砧木苗移栽至苗圃中、脱毒的目标品种苗移栽至营养钵中，并继续增加光照和通风时间，直至完全适应外界环境；
S3.双脱毒苹果苗的嫁接及培养
S31.嫁接：取脱毒目标品种苗的2cm嫩芽，将嫩芽置入2％NaClO内震荡消毒7min，取出后用无菌水冲洗4-5次，然后将消毒后的嫩芽浸入0.5mg/L或1.0mg/L的6-BA中预处理10min；取健壮的脱毒砧木苗，并对其顶端和根端进行切除，留茎长2cm、根长4-5cm，然后在距顶端3-4mm处嫁接预处理后的脱毒目标品种苗的嫩芽；
S32.培养：将嫁接好的苗放入第一嫁接培养基中，在25℃、光照时长16小时、光照强度2000LX的条件下培养6-7天，然后转入第二嫁接培养基中继续培养，获得双脱毒苗；其中，第一嫁接培养基为1/2MT+蔗糖35g/L，PH为5.7-5.9；第二嫁接培养基为1/2MT+蔗糖30g/L+GA30.5mg/L，PH为5.8-5.9；另外，当双脱毒苗的苗高培养至10cm以上时，将双脱毒苗移栽至苗圃中。
1、上述，关于步骤S1中外植体的预处理，进行如下对比试验：
试验一(关于外植体取材的时间)
在夏季的晴天、阴雨天分别进行外植体的取材，且取材时间为上午8点、10点、11点，下午2点、3点、4点；
每种天气、每个时间点下取30个外植体进行对比试验，且取材后对外植体均进行一次消毒，消毒后培养，以对比培养过程中的污染率；最终获取试验结果为：在夏季晴天的下午2点至3点时取材，其进行一次消毒后培养的污染率最低，为5％-12％。
试验二(关于外植体的消毒处理方式)
(1)在相同条件下进行一次消毒与二次消毒的对比试验，获得试验结果为二次消毒的污染率低于一次消毒的污染率；
(2)在相同条件下进行不同时间间隔的二次消毒的对比试验，试验间隔时间分别为0/1/2/3天，获得试验结果为：污染率分别为21％、12.5％、4.7％、15.8％，由此可知，间隔2天的二次消毒能有效使外植体培养的污染率降低至10％左右。
2、上述，关于步骤S1中茎尖培养，进行如下对比试验：
试验三
在MS培养基中，添加不同浓度的6-BA、NAA、GA3和CH；具体试验中，以其中一个变量进行多组试验；例如：
在仅有6-BA为变量时，随着6-BA浓度的增多，嫩芽萌发数量越多，并且在0.5mg/L时所产生的促进萌芽效果最好；在仅有NAA为变量时，随着NAA浓度的减少，嫩芽萌发数量越多，其中在0.3mg/L时所产生的促进萌芽效果最好；
仅利用上述0.5mg/L的6-BA与0.3mg/L的NAA能有效达到促进嫩芽萌发的效果，但是所萌发的嫩芽瘦弱，叶片细小，并容易掉落。
固定上述6-BA和NAA的浓度，添加GA3，根据试验数据可知，当GA3的浓度添加0.1-0.3mg/L时，所萌发的嫩芽的存活率达到最高(80％-90％)；
固定上述6-BA、NAA和GA3的浓度，仅以CH作为变量，随着CH浓度的增大，其嫩芽萌发数量不变，但是嫩芽逐渐变得健壮，叶片逐渐增大，且在CH浓度为200mg/L时，效果最佳。
基于此，根据试验数据能有效获得外植体培养时其使用培养基成本的最佳比例，以提高培养效率。
3、上述，关于步骤S3对脱毒目标品种苗(德美1号苹果)嫩芽的消毒，进行如下对比试验：
试验四
选取不同消毒剂0.2％NaClO和0.1％HgCl2进行对比试验；并进行不同时间的消毒对比；至少包括5min/7min/10min/15min的8组对比；取30个嫩芽进行消毒嫁接，根据试验结果，获得0.2％NaClO在7min下的消毒效果最佳，嫁接存活率达65％；
在本试验中，还进行无菌水清洗的空白对比试验，在空白对比中，嫁接存活率为35％。
4、上述，关于步骤S3对脱毒目标品种苗(德美1号苹果)嫩芽的预处理，进行如下对比试验：
试验五
选取不同浓度的6-BA对同样条件下消毒后的嫩芽进行浸入预处理对比，至少包括0.1mg/L、0.5mg/L和1.0mg/L；
另外，还对每个浓度进行不同浸入时间的对比，至少包括5min/10min/20min；每个浓度取30个嫩芽进行试验，
根据试验结果，获得嫩芽在经0.5mg/L或1.0mg/L的6-BA的10min预处理后，其嫁接存活率均可达80％以上；
在本试验中，还进行无菌水预处理的空白对比试验，在空白对比中，嫁接存活率为40％。
根据上述实验四和试验五可知，在本发明中进行嫁接嫩芽的消毒和预处理能有效提高嫁接存活率。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。
Claims (10)
1.一种双脱毒苹果苗的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.脱毒砧木苗和目标品种苗的制备
外植体的预处理：在夏季晴天午后2点-3点，选取目标砧木上半木质化茎段作为砧木组培用外植体，选取目标苹果品种的幼嫩枝条作为品种组培用外植体，采取体积浓度75％酒精和质量浓度为0.1％升汞配合使用的方式对砧木和品种的组培用外植体进行间隔2天的两次体外消毒，消毒后均置入4℃的冰箱中冷藏20-30天；
茎尖培养：将冷藏后的组培用外植体接种在第一接种培养基中培养12-15天至发芽，发芽后截取1.5-2cm的芽体，接种于第二接种培养基上培养；
初次高温钝化：将上述第二接种培养基置入38℃-40℃的光照培养箱中培养1个月，进行高温钝化，然后剥离芽尖0.2-1.0mm接入第三接种培养基中培养；
二次高温钝化：将上述第三接种培养基再次置入上述光照培养箱中培养30-45天；
增值培养及脱毒检测：将二次高温钝化培养后生长的新芽割下，并接种于增值培养基中，在25℃、光照时长12小时、光照强度6000LX的条件下增值培养20-30天，获得脱毒的砧木苗和目标品种苗，并对脱毒苗进行病毒检测及鉴定；
S2.对脱毒砧木苗和目标品种苗进行生根、驯化和移栽培养；其中，脱毒的砧木苗在驯化中移栽至苗圃中，脱毒的目标品种苗在驯化中移栽至营养钵中；
S3.双脱毒苹果苗的嫁接及培养
嫁接：取脱毒目标品种苗的1-3cm嫩芽，消毒后经6-BA进行预处理；取健壮的脱毒砧木苗，并对其顶端和根端进行切除，留茎长2cm、根长4-5cm，然后在距顶端3-4mm处嫁接预处理后的脱毒目标品种苗的嫩芽；
培养：将嫁接好的苗放入第一嫁接培养基中，在25℃、光照时长16小时、光照强度2000LX的条件下培养6-7天，然后转入第二嫁接培养基中继续培养，获得双脱毒苗。
2.如权利要求1所述的一种双脱毒苹果苗的培育方法，其特征在于：在外植体的预处理步骤中，所截取的半木质化茎段为5-15cm。
3.如权利要求1所述的一种双脱毒苹果苗的培育方法，其特征在于，所述第一/第二/第三接种培养基均为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+GA30.1mg/L+CH200mg/L。
4.如权利要求1所述的一种双脱毒苹果苗的培育方法，其特征在于，所述增值培养基为：MT+蔗糖35mg/L+6-BA0.1mg/L+IBA0.05mg/L+GA30.03mg/L+CH200mg/L。
5.如权利要求1所述的一种双脱毒苹果苗的培育方法，其特征在于，所述第一嫁接培养基为1/2MT+蔗糖35g/L，PH为5.7-5.9；所述第二嫁接培养基为1/2MT+蔗糖30g/L+GA30.5mg/L，PH为5.8-5.9。
6.如权利要求1所述的一种双脱毒苹果苗的培育方法，其特征在于，在步骤S2中，对脱毒砧木苗和目标品种苗进行生根、驯化和移栽培养包括：
生根培养：将成功通过病毒检测及鉴定的脱毒苗进行至少一次继代培养，然后转移至生根培养基中进行20-30天的生根培养；
温室驯化及移栽：将经生根培养的脱毒苗转移至温室大棚内，覆膜遮阴，5天后将脱毒苗移栽至穴盘中，在逐渐增加光照和通风时间的条件下继续驯化5-10天，然后将脱毒的砧木苗移栽至苗圃中、脱毒的目标品种苗移栽至营养钵中，并继续增加光照和通风时间，直至完全适应外界环境。
7.如权利要求6所述的一种双脱毒苹果苗的培育方法，其特征在于，所述生根培养基为：MS+NAA0.5mg/L。
8.如权利要求1所述的一种双脱毒苹果苗的培育方法，其特征在于，在步骤S3中，对脱毒目标品种苗的嫩芽进行消毒时包括：
将嫩芽置入2％NaClO内，进行震荡消毒，且消毒时间为7min；
消毒后，用无菌水冲洗4-5次。
9.如权利要求8所述的一种双脱毒苹果苗的培育方法，其特征在于，在步骤S3中，利用0.5mg/L或1.0mg/L的6-BA对消毒后的嫩芽进行10min的浸入预处理。
10.如权利要求1、8或9所述的一种双脱毒苹果苗的培育方法，其特征在于，在步骤S3中，当双脱毒苗的苗高培养至10cm以上时，将双脱毒苗移栽至苗圃中。
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