CN104429942A - 苹果组培苗热处理结合化学处理的脱毒方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苹果病毒脱除方法。该方法是将苹果组培苗茎尖接种于含15-25μg/mL病毒醚的培养基中，升温至34-36℃条件下进行恒温热处理。本发明的优点为：植株的存活率高、脱毒效果好、所需时间短，选用的化学药剂不具有寄主选择性，应用前景广阔。

Description

苹果组培苗热处理结合化学处理的脱毒方法

技术领域

本发明涉及一种苹果病毒脱除方法，特别涉及一种苹果组培苗热处理结合化学处理的脱毒方法。

背景技术

我国栽植的苹果普遍感染多种病毒。苹果花叶病毒(ApMV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎痘病毒(ASPV)和苹果茎沟病毒(ASGV)是侵染苹果的最常见病毒。苹果感染ApMV后，叶片上会出现大小不一的鲜黄色或黄白色斑块，形成花叶，还可能出现沿叶脉褪绿黄化的网纹型症状。ACLSV、ASGV和ASPV在多数苹果栽培品种中呈潜隐性，不表现症状，只在少数感病品种或指示植物上表现症状。在我国苹果主要栽培区，3种潜隐病毒的带毒株率高达80％～100％，每年使苹果减产约17％～40％。如果土壤贫瘠、水肥欠缺、管理不善或利用了对病毒较敏感的砧木和品种时，会使植株衰弱死亡，造成果园残缺不全，甚至全园毁灭。苹果病毒主要通过嫁接传染，随带毒繁殖材料(如苗木、接穗、营养系砧木等)远距离传播扩散，迄今尚未发现任何传毒介体。苹果一旦感染病毒，就很难防治。

采用脱毒技术，培育无病毒原种，建立用于繁殖接穗和营养系砧木的母本园，栽植无病毒苗木，是防治病毒病的根本措施。目前用于苹果脱毒的方法主要包括茎尖培养、热处理和化学处理等。这些方法都存在不足之处，采用茎尖培养的方法，切取的茎尖大小一般为0.1-0.5mm，操作困难，且成活率低；由于苹果对温度较为敏感，热处理脱毒过程中，植株的成活率与温度呈反比，脱毒率与温度正比，兼顾成活率和脱毒率，就需延长处理时间；苹果化学处理常用的药剂为病毒醚(Ribavirin)，脱毒的脱除效果与药剂的浓度成正比，且当其浓度高于25μg/mL时，将对植株产生严重的药害。目前，一直没有既能够保证成活率，又能获得很好的脱毒效果的苹果病毒脱除方法。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种植株成活率高、脱毒效果好、处理时间短的苹果组培苗热处理结合化学处理的脱毒方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

苹果组培苗热处理结合化学处理的脱毒方法，苹果组培苗生长在含有15-25μg/mL病毒醚(Ribavirin)的培养基中，同时在34-36℃的条件下进行恒温热处理。具体是将苹果组培苗茎尖接种于含15-25μg/mL病毒醚的培养基中，升温至34-36℃条件下进行恒温热处理。所述苹果组培苗茎尖可为0.1-1.0cm，优选0.7cm。

所述恒温热处理处理时间为18-25天，优选20天。

在温度为36℃，病毒醚(Ribavirin)的浓度为25μg/mL的条件下，苹果病毒的脱除效果最好。

所述方法还包括在升温之前先在24℃下培养1天，然后，依次升温培养：28℃培养1天、30℃培养1天、32℃培养1天。

所述含15-25μg/mL病毒醚的培养基是在基础培养基中添加病毒醚，使病毒醚终浓度为15-25μg/mL，所述基础培养基为MS培养基中添加终浓度为1mg/L6-苄氨基嘌呤和终浓度为0.1mg/L萘乙酸得到的培养基。

上述病毒醚(Ribavirin，)又名病毒唑，化学名为1-β-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4，-三氮唑-3-羧酰胺。

所述方法中，整个处理过程中，光照时间12-16小时/天，光照强度1800-2200Lux，优选光照强度2000Lux，光照时间16小时/天。

本发明的优点如下：

1.处理植株成活率高。本发明中的热处理温度和化学药剂浓度都较低，对植株的生长影响较小，植株的死亡率低。

2.再生植株的脱毒效果好。本发明将热处理和化学处理结合后，脱毒效率明显高于单独热处理或化学处理。

3.脱毒处理时间短。本发明中苹果试管苗脱毒处理需要的时间为20天，与单独热处理或化学处理相比时间明显缩短。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中使用的病毒醚(Ribavirin，)又名病毒唑，化学名为1-β-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4，-三氮唑-3-羧酰胺。

实施例1、苹果组培苗热处理结合化学处理的脱毒方法：

1、含病毒醚(Ribavirin)培养基的配制：

制备苹果的扩繁培养基，配方为MS+1mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+0.1mg/L萘乙酸(NAA)，高温灭菌，冷却至60-70℃时，在无菌的环境中，将过滤除菌的病毒醚加入到培养基中，摇匀，使其终浓度分别为15和25μg/mL。

2、脱毒处理：

当苹果组培苗扩繁到所需数量后，选取长势一致的植株，切取0.7cm的茎尖，分别将茎尖移入含15和25μg/mL病毒醚的培养基中，先在室温25℃下放置1天，然后移入光照培养箱内，依次升温培养：28℃培养1天、30℃培养1天、32℃培养1天，最后将温度分别升至34℃和36℃，处理20天，该处理过程中，光照强度2000Lux，光照时间16小时/天；然后统计成活情况，并切取1mm茎尖(包括主芽和≥0.5cm的侧芽)移入新鲜的苹果扩繁培养基中，进行再生培养。再生培养的温度为25℃，光照强度2000Lux，光照时间12小时/天。

单独热处理的对照：当苹果组培苗扩繁到所需数量后，选取长势一致的植株，切取0.7cm的茎尖，分别将茎尖移入苹果扩繁培养基中，先在室温25℃下放置1天，然后移入光照培养箱内，依次升温培养：28℃培养1天、30℃培养1天、32℃培养1天，最后将温度分别升至34℃和36℃，处理20天，该处理过程中，光照强度2000Lux，光照时间16小时/天；然后统计成活情况，并切取1mm茎尖(包括主芽和≥0.5cm的侧芽)移入新鲜的苹果扩繁培养基中，进行再生培养。再生培养的温度为25℃，光照强度2000Lux，光照时间12小时/天。

单独化学处理的对照：当苹果组培苗扩繁到所需数量后，选取长势一致的植株，切取0.7cm的茎尖，分别将茎尖移入含15和25μg/mL病毒醚的培养基中，处理60天后，该处理过程中，光照强度2000Lux，光照时间16小时/天；统计成活情况，并切取1mm茎尖(包括主芽和≥0.5cm的侧芽)移入新鲜的苹果扩繁培养基中，进行再生培养。再生培养的温度为25℃，光照强度2000Lux，光照时间12小时/天。

上述苹果扩繁培养基为：MS+1mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+0.1mg/L萘乙酸(NAA)。

3、再生植株的病毒检测：

当再生植株继代培养2次后，采用RT-PCR的方法对再生植株中的病毒进行检测，计算脱毒效果。上述继代培养的方法为：茎尖再生培养成完整的苹果植株后(约培养60天)，在无菌的条件下，从再生培养后的苹果组培苗上切取约1.0cm的茎尖，转入新鲜的苹果扩繁培养基中进行继代培养，各个处理及其结果如表1-表3所示。

表1

表2

表3

从表3中可以看出，采用热处理与化学处理结合的方式所设置的4个处理中，处理植株均未产生药害，且成活率均较高，除36℃和25μg/mL病毒醚处理的植株有3株死亡外，其余3个处理的植株全部存活；4个处理的再生植株的成活率均在60％以上；对再生后的苹果组培苗进行病毒检测发现，采用热处理与化学处理结合的方式所设置的4个处理的脱毒率均在75％以上，其中36℃和25μg/mL病毒醚处理后的再生植株的脱毒率最高，达到95.0％。

从表1和表2中可以看出，15-25μg/mL病毒醚处理60天，苹果组培苗的病毒脱除率在75.0％左右，而单独高温34℃和36℃处理20天，苹果组培苗的脱毒率分别仅为35.7％和52.4％。而将热处理和化学处理结合后，苹果组培苗在34℃结合15-25μg/mL病毒醚的条件下，处理20天后的脱除效果就与单独15-25μg/mL病毒醚处理60天的结果相近，但脱除所用时间明显减少，随着处理温度升至36℃，脱毒率也显著增加。因此，本发明在保证了苹果试管苗较高成活率的前提下，提高了病毒脱除效率，缩短了处理所需时间，满足苹果病毒脱除的需求，此外，化学药剂病毒醚(Ribavirin)不具有寄主选择性，可用于其他植物病毒的脱除，应用前景广阔。

Claims (6)

1.苹果组培苗热处理结合化学处理的脱毒方法，是将苹果组培苗茎尖接种于含15-25μg/mL病毒醚的培养基中，升温至34-36℃条件下进行恒温热处理。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述恒温热处理的处理时间为18-25天。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述恒温热处理的处理时间为20天。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在升温之前先在25℃下培养1天，然后，依次升温培养：28℃培养1天、30℃培养1天、32℃培养1天。

5.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于：所述含15-25μg/mL病毒醚的培养基是在基础培养基中添加病毒醚，使病毒醚的终浓度为15-25μg/mL，所述基础培养基为MS培养基中添加终浓度为1mg/L 6-苄氨基嘌呤和终浓度为0.1mg/L萘乙酸得到的培养基。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述含15-25μg/mL病毒醚的培养基中病毒醚的终浓度为25ug/mL，所述恒温热处理的温度为36℃。