CN106538395A - 一种提高濒危植物西藏大花黄牡丹成苗率及幼苗成活率的方法 - Google Patents

Abstract

一种提高濒危植物西藏大花黄牡丹成苗率及幼苗成活率的方法，本发明涉及提高西藏大花黄牡丹成苗率及幼苗成活率的方法。本发明为了解决濒危园艺植物西藏大花黄牡丹成苗率及幼苗成活率低、育苗时间长的问题。本发明步骤为：一：将采集到的大花黄牡丹的种子进行消毒；二：制备MS培养基母液；三：制备大花黄牡丹芽诱导培养基；四：剥去大花黄牡丹种子的种皮及胚乳，分离出种胚后，将其接种至大花黄牡丹芽诱导培养基表面；五：转至培养箱进行培养，得到无菌苗；六：制备生根培养基；七：将无菌苗接种到生根培养基中进行生根培养；八：将生根培养后的无菌苗进行驯化移栽。本发明应用于西藏濒危植物资源保护领域。

Description

一种提高濒危植物西藏大花黄牡丹成苗率及幼苗成活率的 方法

技术领域

本发明涉及提高濒危植物西藏大花黄牡丹成苗率及幼苗成活率的方法。

背景技术

大花黄牡丹(Paeonia ludlowii(Stern etTaylor)Hong)系西藏特有种，为丛生灌木；属国家二级濒危植物，野生植株约有6 000株，大花黄牡丹喜温和气候，较耐寒，抗旱能力较弱，对水分依赖性大，常见于路边、半山腰、小溪边及河边等。分布在西藏林芝地区八一镇至米林县长约100km的开阔河谷地带，垂直分布范围2500-3500m。

1.导致大花黄牡丹濒危的因素

1.1生理特性与环境因素

野生大花黄牡丹分布范围窄，数量少，种群数量不断下降，其原因存在多方面；大花黄牡丹生理特性、特殊的生长环境及人为活动等。杨小林等认为大花黄牡丹在自然条件下的结籽率低，种子在自然条件下的萌发率、幼苗转化率都很低。王文华也认为西藏大花黄牡丹自然状态下主要为种子繁殖，种子发芽率和成苗率低于5％。张蕾认为在自然环境下大花黄牡丹在林芝、山南甚至高原生态所内，自然开裂落地后的种子，至少需要2年，甚至2年以上才能萌发。将种子从未开裂的果荚中剥出后在当地进行播种实验，也证明大花黄牡丹的种子至少需2年才能萌发。种子的这种萌发特性，使其萌发率大大降低，不利于种群数量的增加，是大花黄牡丹在自然界中繁殖速度慢，数量少，且质量低的主要原因之一。此外，何志的研究发现大花黄牡丹种子具上胚轴休眠特性，萌发所需时间较长，解除休眠需要一定的条件，从而限制了种群的更新和发展。大花黄牡丹为虫媒传粉，在传粉过程中，昆虫常有啃食心皮和胚珠的现象，大花黄牡丹的这些生物学特性致使它的自我更新能力存在巨大障碍，同时这也是造成大花黄牡丹极度濒危的根本原因。张蕾实地考察发现大花黄牡丹的花期在4月至5月中旬，当其花蕾直径达3cm左右时，常与当地的晚霜相遇，这使得生长在裸地的大花黄牡丹由于缺乏乔灌木的遮挡而遭受霜害，花朵中途败育不能正常开花结实，最终影响结实率。

1.2人为因素

另一方面人类活动也同样对大花黄牡丹造成许多不良的影响，主要表现在以下几个方面大量地砍伐森林，破坏大花黄牡丹的原生境，使它们失去了生长繁殖的空间，也会对大花黄牡丹造成间接的破坏。大花黄牡丹在人为破坏后的生境中，天然更新受到明显抑制。修路、筑坝、建造机场等活动都会对大花黄牡丹造成间接破坏，导致了生境的片断化。大花黄牡丹天然分布区为林缘坡麓次生灌木林或河谷台地，牲畜活动频繁，生境屡遭破坏，直接影响了大花黄牡丹天然更新和幼苗的生长。大花黄牡丹既是名贵花卉又具有药用价值，不法商贩为了自身的经济利益，盲目索取生物资源，大量的收购造成了大花黄牡丹资源的枯竭，加剧了物种的濒危。根部被挖掘，将会导致大花黄牡丹彻底死亡，被破坏的居群很难恢复如前。旅游的影响在旅游开发过程中，由于开发者缺乏景观保护意识和生态平衡思想，虽然会倡导大家保护濒危植物，但是受经济效益的驱使，有可能使景区严重超载，造成了生物多样性的破坏和旅游资源的退化，影响大花黄牡丹的正常生长。作为宝贵的花卉种质资源，近年来，大花黄牡丹每年约有天然种群的种子被人工采摘运往各地进行引种培育，造成大花黄牡丹天然分布区天然更新种源匾乏。不恰当的繁殖及种植季节导致大花黄牡丹种苗的大量死亡。

2.研究现状

在打破种子休眠方面主要采用化学药剂处理、温水浸种等方法或运用砂纸打磨、剖开种子等物理手段。周生军对大花黄牡丹进行栽培保护的研究，通过沙藏后播种育苗，大花黄牡丹在苗床生长2年后，株高基本达到10cm以上进行起苗移栽。赵仕虎等将大花黄牡丹种子采收后采用随采随播方式，于8月采种后以GA₃、乙醇、机械破皮、沙藏处理后直接播种于大田，以不作处理为对照，种子于第2年3月开始出苗，所有处理从出苗开始至出苗结束历时7个月左右。景新明等研究结果表明：栽培牡丹种子在胚根显露前约有3个月的后熟期，去除种皮及各种理化处理均不能显著促进其萌发。马宏等在播种前室温清水浸泡7天后于15℃恒温培养；待根生长至3cm以上时，GA3浸泡2h，置于15℃恒温培养。按此处理，从播种到种子发芽结束约需4个月。

大花黄牡丹的生态学研究方面，杨翔等研究表明大花黄牡丹与其他各种群的生态位相似性比例不高，生态位重叠值较低，表明它与其他种群之间对资源的竞争不激烈，能够成为该群落中利用资源能力和生态适应性最强的优势种群，在维持群落的物种多样性和相对稳定性中发挥重要作用。苏建荣等研究了濒危植物大花黄牡丹与生境地群落特征的关系，乔木群落中大花黄牡丹多度显著低于灌木群落，但大花黄牡丹平均胸径和平均高则与灌木群落无显著差异。

发明内容

本发明是为了解决濒危园艺植物西藏大花黄牡丹成苗率及幼苗成活率低、育苗时间长的问题，而提出的一种提高濒危植物西藏大花黄牡丹成苗率及幼苗成活率的方法。

一种提高濒危植物西藏大花黄牡丹成苗率及幼苗成活率的方法按以下步骤实现：

步骤一：将采集到的大花黄牡丹的种子进行消毒；

步骤二：制备MS培养基母液；

步骤三：制备大花黄牡丹芽诱导培养基；

具体过程为：在步骤二制备的MS培养基母液中加入浓度为0.5-1mg/L的6-BA，浓度为0.3-0.5mg/L的IAA，浓度为0.2-0.5mg/L的GA₃；所述6-BA为6-苄基腺嘌呤，IAA为吲哚乙酸，GA₃为赤霉素；

步骤四：剥去步骤一消毒后的大花黄牡丹种子的种皮及胚乳，分离出种胚后，将种胚接种至步骤三制备的大花黄牡丹芽诱导培养基表面；

步骤五：步骤四接种后转至培养箱进行培养，得到无菌苗；培养条件为：18℃-20℃、1000-2000lx、13-14h光照培养后9-10h黑暗培养；

步骤六：制备生根培养基；所述生根培养基为1/2MS中加入2g/L IBA和0.1-0.2g/LNAA；所述IBA为吲哚丁酸，NAA为萘乙酸；

步骤七：将步骤五得到的无菌苗接种到步骤六制备的生根培养基中进行生根培养；培养条件为：18-20℃、900-1000lx、13-14h光照培养后9-10h黑暗培养；

步骤八：将步骤七生根培养后的无菌苗进行驯化移栽。

发明效果：

本发明可以解决大花黄牡丹种子繁殖时，播种当年上胚轴休眠，只生根不发芽，第2年才发芽，育苗时间长的问题。虽然能通过物理或化学药剂处理提高萌发率及缩短萌发时间，但效果还是有限的，育苗周期仍较长，受季节的限制。本发明将植物组织培养技术运用于大花黄牡丹的繁育中，提高成苗率及缩短育苗周期，大量繁育幼苗，提高大花黄牡丹幼苗的种群数量。

本发明通过方法5大花黄牡丹种子的成苗率能够达到95％，且幼苗成活率能够达到90％，相比大花黄牡丹自然状态下种子繁殖时种子发芽率和成苗率低于5％提高了85％-90％。

人工播种，大花黄牡丹的种子成苗周期为两年(第一年胚根萌发，第二年子叶萌发)，通过方法5种子的成苗周期为2-3个月，大大缩短了大花黄牡丹种子育苗的周期。

附图说明

图1为剥离种胚的萌动图；

图2为剥离种胚的子叶的萌发图；

图3为带柄子叶的胚根萌发1图；

图4为带柄子叶的胚根萌发2图；

图5为诱导生根图；

图6为获得的无菌苗图；

图7为无菌苗的移栽1图；

图8为无菌苗的移栽2图；

图9为方法1处理后的种子接种到培养基上的示意图；

图10为方法2处理后的种子接种到培养基上的示意图；

图11为方法3处理后的种子接种到培养基上的示意图；

图12为方法4处理后的种子接种到培养基上的示意图；

图13为方法5处理后的种子接种到培养基上的示意图。

具体实施方式

具体实施方式一：一种提高濒危植物西藏大花黄牡丹成苗率及幼苗成活率的方法包括以下步骤：

步骤一：将采集到的大花黄牡丹的种子进行消毒；

步骤二：制备MS培养基母液；

步骤三：制备大花黄牡丹芽诱导培养基；

具体过程为：在步骤二制备的MS培养基母液中加入浓度为0.5-1mg/L的6-BA，浓度为0.3-0.5mg/L的IAA，浓度为0.2-0.5mg/L的GA₃；所述6-BA为6-苄基腺嘌呤，IAA为吲哚乙酸，GA₃为赤霉素；

步骤四：剥去步骤一消毒后的大花黄牡丹种子的种皮及胚乳，分离出种胚后，将种胚接种至步骤三制备的大花黄牡丹芽诱导培养基表面；剥离种胚的萌动和剥离种胚的子叶的萌发，如图1和图2所示；带柄子叶的胚根萌发，如图3和图4所示；

步骤五：步骤四接种后转至培养箱进行培养，得到无菌苗；培养条件为：18℃-20℃、1000-2000lx、13-14h光照培养后9-10h黑暗培养；

步骤六：制备生根培养基；所述生根培养基为1/2MS中加入2g/L IBA和0.1-0.2g/LNAA；所述IBA为吲哚丁酸，NAA为萘乙酸；

步骤七：将步骤五得到的无菌苗接种到步骤六制备的生根培养基中进行生根培养；培养条件为：18-20℃、900-1000lx、13-14h光照培养后9-10h黑暗培养；诱导生根，如图5所示；

步骤八：将步骤七生根培养后的无菌苗进行驯化移栽。获得的无菌苗，如图6所示；无菌苗的移栽，如图7和图8所示；

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述步骤一中将采集到的大花黄牡丹的种子进行消毒的具体过程为：

将采集的种子加入75％的乙醇(用无水乙醇配置成体积百分比为75％的乙醇)，消毒30-35s，无菌水冲洗1-2次，加入0.1％的升汞(质量百分比)，处理15min-16min，无菌水冲洗2-3次，加入60-65mL无菌水浸泡2-3天。

其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：所述步骤二中制备MS培养基母液的具体过程为：

取100mL大量元素、10mL微量元素、10mL铁盐、10mL有机物，加入30g蔗糖，加蒸馏水定容至1L，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，121℃、15min高压灭菌。

表1MS基础培养基母液配置表

MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。基于此这种培养基就用他们的名字来命名了。1/2MS是把其中的大量元素减少到原来的1/2叫1/2MS培养基。IBA为吲哚丁酸，NAA为萘乙酸，GA₃为赤霉素，6-BA为6-苄基腺嘌呤，IAA为吲哚乙酸。

其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：所述步骤三中6-BA的浓度为1mg/L，IAA的浓度为0.3mg/L，GA₃的浓度为0.2mg/L。

其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：所述步骤五中培养条件为：19℃、1500lx(lx为光照强度的单位，是指单位面积上所接受可见光的能量，简称照度，单位勒克斯)、14h光照培养后10h黑暗培养。

其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：所述步骤七中培养条件为：19℃、1000lx、14h光照培养后10h黑暗培养。

其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：所述步骤八中将步骤七生根培养后的无菌苗进行驯化移栽的具体过程为：

无菌苗苗龄达到2-3个月，幼苗高约5-5.5cm，打开培养瓶的瓶盖，炼苗一周，移栽到腐殖土中，在15-18℃、避光、湿度为60％-70％的环境中培养，13-14天后，逐渐降低湿度至30％-50％，长出新根或新叶后转至自然光照下培养。

其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。

实施例一：

一种提高濒危植物西藏大花黄牡丹成苗率及幼苗成活率的方法包括以下步骤：

1、种子收集及消毒

九月底至西藏林芝地区米林县机场、养殖场及南伊沟采集大花黄牡丹果荚，放置阴凉通风处，种皮发黑时转至室外暴晒，备用。将种子转至超净工作台，倒入200mL无菌瓶中，加入75％无水乙醇，消毒30s，无菌水冲洗1次，加入0.1％升汞，处理15min，无菌水冲洗3次，加入60mL无菌水浸泡2-3天，备用。

2、培养基的制备

配制MS母液(10倍大量元素、100倍微量元素、100倍铁盐、100倍有机物)，低温保存，备用。量取100mL大量元素、10mL微量元素、10mL铁盐、10mL有机物，加入30g蔗糖，定容至1L，调pH至6.0，加入7g琼脂粉。121℃、15min高压灭菌，冷却至60℃加入植物生长调节剂，混匀后每瓶分装40mL，对照组不加入任何植物生长调节剂，配方见下表2和表3。

表2.芽诱导培养基配方

表3.生根培养基配方

3、接种

将种子转至超净工作台，放置于无菌滤纸上，按照下列5种方法进行处理后分别接种至10种培养基上，每瓶接种5粒，每种方法各接种5瓶。

方法1：不进行任何处理，直接接种，如图9。

方法2：剥去种皮后接种至培养基上，如图10。

方法3：纵切种子，暴露出胚且保持胚的完整性，接种时切面不接触到培养基，如图11。

方法4：横切种子，接种带胚的一部分，如图12。

方法5：剥去种皮及胚乳，分离出种胚，将其接种至培养基表面，如图13。

4、培养

接种后转至培养箱中进行培养，18-20℃、1000-2000lx、14h光照/10h黑暗。培养3-5天，方法5种胚开始萌动，7天种胚萌发，15天子叶抽出，长约1-4cm，30天胚根抽出。方法1、方法3和方法4种子或种胚易污染，方法2去除种皮虽可降低种子的污染率但种子萌发率不高(20％-60％)且种子萌发时间被延长，时长为1-3个月。

5、生根培养

将方法5的第8种培养基培育出的无菌苗转接到上述7种生根培养基中，且将根部插入培养基，18-20℃、1000lx、14h光照/10h黑暗。生根培养基的最优配方为：1/2MS+2g/LIBA+0.1g/L NAA和1/2MS+2g/L IBA+0.2g/L NAA，胚根长势良好，生长粗壮，侧根数多，侧根诱导率能够达到60％-80％。

6、驯化移栽

待无菌苗苗龄达到2-3个月，幼苗高约5cm，打开培养瓶的瓶盖，炼苗一周，移栽到透气性好的腐殖土中，15-18℃、避光、湿度为60％～70％的环境中培养，2周后，逐渐降低湿度至30％-50％，待长出新根或新叶后转至自然光照下培养。

Claims (7)

1.一种提高濒危植物西藏大花黄牡丹成苗率及幼苗成活率的方法，其特征在于，所述提高濒危植物西藏大花黄牡丹成苗率及幼苗成活率的方法包括以下步骤：

步骤一：将采集到的大花黄牡丹的种子进行消毒；

步骤二：制备MS培养基母液；

步骤三：制备大花黄牡丹芽诱导培养基；

具体过程为：在步骤二制备的MS培养基母液中加入浓度为0.5-1mg/L的6-BA，浓度为0.3-0.5mg/L的IAA，浓度为0.2-0.5mg/L的GA₃；所述6-BA为6-苄基腺嘌呤，IAA为吲哚乙酸，GA₃为赤霉素；

步骤四：剥去步骤一消毒后的大花黄牡丹种子的种皮及胚乳，分离出种胚后，将种胚接种至步骤三制备的大花黄牡丹芽诱导培养基表面；

步骤五：步骤四接种后转至培养箱进行培养，得到无菌苗；培养条件为：18℃-20℃、1000-2000lx、13-14h光照培养后9-10h黑暗培养；

步骤六：制备生根培养基；所述生根培养基为1/2MS中加入2g/L IBA和0.1-0.2g/LNAA；所述IBA为吲哚丁酸，NAA为萘乙酸；

步骤七：将步骤五得到的无菌苗接种到步骤六制备的生根培养基中进行生根培养；培养条件为：18-20℃、900-1000lx、13-14h光照培养后9-10h黑暗培养；

步骤八：将步骤七生根培养后的无菌苗进行驯化移栽。

2.根据权利要求1所述的一种提高濒危植物西藏大花黄牡丹成苗率及幼苗成活率的方法，其特征在于，所述步骤一中将采集到的大花黄牡丹的种子进行消毒的具体过程为：

将采集的种子加入75％的乙醇，消毒30-35s，无菌水冲洗1-2次，加入0.1％的升汞，处理15min-16min，无菌水冲洗2-3次，加入60-65mL无菌水浸泡2-3天。

3.根据权利要求2所述的一种提高濒危植物西藏大花黄牡丹成苗率及幼苗成活率的方法，其特征在于，所述步骤二中制备MS培养基母液的具体过程为：

取100mL大量元素、10mL微量元素、10mL铁盐、10mL有机物，加入30g蔗糖，加蒸馏水定容至1L，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，121℃、15min高压灭菌。

4.根据权利要求3所述的一种提高濒危植物西藏大花黄牡丹成苗率及幼苗成活率的方法，其特征在于，所述步骤三中6-BA的浓度为1mg/L，IAA的浓度为0.3mg/L，GA₃的浓度为0.2mg/L。

5.根据权利要求4所述的一种提高濒危植物西藏大花黄牡丹成苗率及幼苗成活率的方法，其特征在于，所述步骤五中培养条件为：19℃、1500lx、14h光照培养后10h黑暗培养。

6.根据权利要求5所述的一种提高濒危植物西藏大花黄牡丹成苗率及幼苗成活率的方法，其特征在于，所述步骤七中培养条件为：19℃、1000lx、14h光照培养后10h黑暗培养。

7.根据权利要求6所述的一种提高濒危植物西藏大花黄牡丹成苗率及幼苗成活率的方法，其特征在于，所述步骤八中将步骤七生根培养后的无菌苗进行驯化移栽的具体过程为：

无菌苗苗龄达到2-3个月，幼苗高约5-5.5cm，打开培养瓶的瓶盖，炼苗一周，移栽到腐殖土中，在15-18℃、避光、湿度为60％-70％的环境中培养，13-14天后，逐渐降低湿度至30％-50％，长出新根或新叶后转至自然光照下培养。