CN103563747A - 惠楼山药的脱毒快繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种惠楼山药的脱毒快繁方法，从正在生长的植株中，选择生长健壮，无病虫的植株，剪取带有茎尖的茎蔓，去掉可见叶，消毒灭菌，利用解剖针剥离茎尖含1-2个叶原基，快速接种到分化与诱导培养基中；通过病毒检测后，将脱毒无菌苗剪成带有1-2个节间的茎段转接到增殖培养基中；选取生长势强、健壮的无菌芽苗切成含有1-2个节间的小段转入生根培养基中，生根后进行炼苗。本发明的方法可人为的控制培养基生长条件，不受自然条件的影响，取材量小，培养材料经济，生长周期短，繁殖系数大，管理方便，利于产业化生产。

Description

惠楼山药的脱毒快繁方法

技术领域

本发明涉及一种植物的组织培养脱毒与快繁技术，确切地说是用山药的茎尖分生组织进行脱毒、茎段无性组织培养进行快繁，以及组织培养扩繁时所用的营养物质—培养基的配比。

背景技术

山药是一种介于粮食和蔬菜之间的食物，我国年产量居世界之首，既可大规模集约化生产，也可小面积庭院栽培。但由于我市及周边地区山药栽培历史悠久，山药病毒危害相当严重，田块发病率100%，品种感病率100%。山药感染病毒后，导致品种退化，产量下降30%以上，严重的田块产量下降50%以上，有的甚至绝收；山药病毒已成为导致山药种性退化产量下降的重要原因，每年造成经济损失近亿元。只有采用无性营养体进行组织培养脱毒快繁，才能保持原品种全部的遗传性和实现该品种种质的一致性。

植物组织培养脱毒与快繁技术近几年飞快发展，已广泛应用在花卉、林果、蔬菜以及农作物上。植物不同其培养方法也不同，即使是一种植物，但品种不同培养方法亦不尽相同。也就是说在同一种植物内的每一个品种，都有它各自的生长发育规律，以及适宜生长发育所需要的营养和环境条件。因此，惠楼山药的组织培养脱毒与快繁技术，适宜的惠楼山药茎尖分生组织培养和茎段组培快繁，最佳培养基和外界环境条件，与其他植物的培养物质和环境条件也是不同的。

发明内容

本发明的目的是提供一种山药的组培脱毒与快繁技术以及用于山药组培快繁的培养物质，通过无性营养体进行组织培养脱毒快繁，一是不受季节限制，实现多次、快速、高系数繁殖；二是可保证原品种全部的遗传性和该品种品质的一致性。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明的组培繁育方法包括如下步骤：

（1）分化培养

从正在生长的山药植株中，选择生长健壮，无病虫的植株，剪取带有茎尖的茎蔓，去掉可见叶，在流动的自来水中冲洗，拮干水分；在无菌室内的超净工作台上，用酒精和升汞溶液灭菌，无菌水冲洗5-7遍，采用解剖镜，利用解剖针剥离茎尖，所剥茎尖为0.1-0.3毫米，带1-2个叶原基，接种到分化与诱导培养基中；然后在温度25±2℃，日照系数12-14h光照强度2200-2500LX的条件下培养；24-26d后重新转入分化培养基中继续培养，40-50d后培养瓶内小苗长出5-7片叶，除去病苗弱苗，其余的快繁一次，待苗子长出7-9片叶时进行病毒检测；

（2）茎尖苗带毒检测

脱毒茎尖苗和在形态长势上差异明显，脱毒茎尖苗生长快，叶色浓，植株健壮；带毒茎尖苗长势弱叶色淡，叶片上有明显花叶明脉或褪绿斑；经目测，把带毒症状明显的茎尖苗除去；用血清学检测法对剩余的山药茎尖苗进行检测，去除对山药危害严重的PVA、PVM、PLRV、PVS、PVX、PVY和马铃薯卷叶病毒的茎尖苗；

（3）增殖培养

通过病毒检测后，剩下的无毒苗进行快繁，在超净工作台上，将脱毒无菌苗剪成带有1-2个节间的茎段转接到继代与增殖培养基中进行增殖培养，PH5.6-5.8，在温度26-28℃，光照12-14h/d，光照强度2000-2500lx，湿度65-70%的环境条件下进行培养；20-25d后形成4-5个丛生芽，28-35d生长高度4-6cm左右，在同一培养基上继代繁殖，继代周期为25-28d；循环往复6次以上；

（4）生根培养

选取生长势强、健壮的无菌芽切成含有1-2个节间的小段，长1.0-1.5cm，转入生根培养基中，，培养温度26±2℃，湿度65-75%，光照强度2200-2500LX，光照时间12-14h/d，25-28d后选取长出3-5条0.3-3cm长的根以及展开叶3-5片的植株，待苗长至30-35d时，进行炼苗移栽；

（5）炼苗与移栽

练苗前首先揭开培养瓶的封口膜，练苗时逐步调节湿度和温度使得其接近自然环境，练苗时间为5-7天，然后取出，用自来水冲洗净苗基部的培养基，并灭菌，然后移栽到已灭过菌的腐殖质、碎炉渣、珍珠岩以3-5：1-2：1-2的比例混合的基质中，前期适当遮阴并保持湿度在90%，逐步降至70-75%，15天后去掉薄膜罩，定期杀菌，7-10天一次，共计2-3次。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的步骤1）中的灭菌过程是指采用重量百分比为70-80%的酒精浸泡15-25秒钟，用百分比为0.05-0.15%的升汞溶液灭菌6-11分钟。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的山药是惠楼山药。

本发明的培养物质及配比：

惠楼山药的脱毒快繁的培养物质：由基本培养基、生长调节剂加椰汁、蔗糖和琼脂组成分化与诱导培养基、继代与增殖培养基和生根培养基。基本培养基为MS，基本培养基MS的配置方法为公知技术，生长调节剂由6-苄基腺嘌呤（6-BA）、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-D）、a-萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IBA）、玉米素（ZT）组合而成。

1、分化与诱导培养基：MS基本培养基1升加6-苄基腺嘌呤（6-BA）1.0-3.5mg、a-萘乙酸（NAA）0.5-3.0mg、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-D）0.2-2.5mg、玉米素（ZT）0.1-0.3mg、椰汁100-200mg、蔗糖30g、琼脂6.5g；

2、继代与增殖培养基：MS基本培养基1升加6-苄基腺嘌呤（6-BA）1.0-3.0mg、a-萘乙酸（NAA）0.5-2.0mg、吲哚丁酸（IBA）0.2-1.5mg、玉米素（ZT）0.1-0.3mg、蔗糖30g、琼脂6g；

3、生根培养基：1/2MS基本培养基1升加a-萘乙酸（NAA）0.5-2.0mg、蔗糖20g、琼脂6g。

本发明的积极效果是：

1、利用“惠楼山药”的茎尖脱毒、茎段快繁，解决了年复一年用零余子繁殖、块根顶部繁殖导致“惠楼山药”病毒病严重、使新育品种品质变劣、种质退化、产量降低等难题；脱毒后在保持原品种特征特性的基础上，纯化了种质，增强了品种抗疫性，提高了品质和产量，增产30%以上，并且薯皮光滑，薯块耐储存；

2、快繁克服了传统的块根顶部繁殖速度慢的弊端，1年内1个生长点或1个茎段可增殖70-80万个，1个人1年内可快繁10-15万个与母体生理特征完全一致的小植株，可实现工厂化育苗、高效率生产；

3、可人为的控制培养生长条件，不受自然条件的影响，取材量小，培养材料经济，生长周期短，繁殖系数大，管理方便，利于产业化生产；

4、培养基质是腐殖质、碎炉渣、珍珠岩以4：1：1比例混合的物质，既经济又有效，降低了生产成本；

5、采用脱毒山药苗三级育苗体系和无病毒甘薯种苗的繁殖更新，有效地防止了品种退化，确保了种质纯度。

具体实施方式

本实施例是用河南豫东四大特产之一“惠楼山药”进行组培快繁的实例。

1、分化与诱导培养

从正在生长的植株中，选择生长健壮，无病虫，具有本品种特征特性的植株，剪取带有茎尖的茎蔓，去掉可见叶，在流动的自来水中冲洗20-30min，拮干水分待用。在无菌室内的超净工作台上，用重量百分比为75%的酒精浸泡20秒钟，0.1%的升汞溶液灭菌8-12分钟，无菌水冲洗5-7遍，在借助于60-80倍解剖镜下，利用解剖针剥离茎尖，所剥茎尖为0.1-0.3毫米，带1-2个叶原基，快速接种到分化与诱导培养基：MS+6-苄基腺嘌呤（6-BA）3.0mg/L+a-萘乙酸（NAA）1.0mg/L+2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-D）1mg/L+玉米素（ZT）0.2mg/L+椰汁120mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L中，封口后做好标记，然后在温度26±2℃，日照系数16h，光照强度2200-2500LX的条件下培养。20d后重新转入分化培养基中继续培养，40-50d后培养瓶内小苗长出5-7片叶，除去病苗弱苗，其余的进行编号并快繁一次，待苗子长出7-9片叶时即可以进行病毒检测。

2、增殖培养

通过病毒检测后，不符合标准的全部淘汰，剩下的无毒苗加速快繁。在超净工作台上，将脱毒无菌苗剪成带有1-2个节间的茎段转接到增殖培养基：MS+6-苄基腺嘌呤（6-BA）2.0mg/L+a-萘乙酸（NAA）1mg/L+吲哚丁酸（IBA）0.5mg/L+玉米素（ZT）0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L中进行增殖培养，PH5.6-5.8，在温度26-28℃，光照12-14h/d，光照强度2200-2500lx，湿度65-70%的环境条件下进行培养。28-35d生长高度5cm左右，即可在同一培养基上继代繁殖，继代周期为25-28d。循环往复，增殖倍数6以上。

3、生根培养

选取生长势强、健壮的无菌芽苗切成含有1-2个节间的小段长1.0-1.5cm转入生根培养基：1/2MS+a-萘乙酸（NAA）1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L中，25-28d有95%以上的植株长出3-5条0.3-3cm长的根，展开叶3-5片，待苗长至30-35d时，即可炼苗移栽，培养温度（26±2）℃，湿度65-75%，光照强度2200-2500LX，光照时间12-14h/d。

4、炼苗与移栽

炼苗前首先揭开培养瓶的封口膜，炼苗时间5-7天，炼苗时在保证温、湿度的条件下，逐步接近自然环境，以利提高成活率，然后小心取出，用自来水冲洗净苗基部的培养基，并灭菌，然后移栽到已灭过菌的腐殖质与碎炉渣以2:1的比例混合的基质中，前期适当遮阴并保持湿度在90%，逐步降至70-75%，15天后去掉薄膜罩，定期杀菌，7-10天一次，共计2-3次，成活率达95%以上。

采取组织培养脱毒和快速繁殖新技术，对脱毒山药进行无性繁殖，是解决生产和市场对其大量需求的一个有效途径。1年内1个生长点或1个茎段可增殖70-80万个，1个人1年内可快繁10-15万个与母体生理特征完全一致的小植株，可实现工厂化育苗、高效率生产。而且所培育的品种适宜种植范围广，产量1800-2500kg/亩，脱毒后较脱毒前增产38.9%，对促进农民增收、农业增效具有很大的意义。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (4)

1.山药组培繁育方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）分化培养

从正在生长的山药植株中，选择生长健壮，无病虫的植株，剪取带有茎尖的茎蔓，去掉可见叶，在流动的自来水中冲洗，拮干水分；在无菌室内的超净工作台上，用酒精和升汞溶液灭菌，无菌水冲洗5-7遍，采用解剖镜，利用解剖针剥离茎尖，所剥茎尖为0.1-0.3毫米，带1-2个叶原基，接种到分化与诱导培养基中；然后在温度25±2℃，日照系数12-14h光照强度2200-2500LX的条件下培养；24-26d后重新转入分化培养基中继续培养，40-50d后培养瓶内小苗长出5-7片叶，除去病苗弱苗，其余的快繁一次，待苗子长出7-9片叶时进行病毒检测；

（2）茎尖苗带毒检测

脱毒茎尖苗和在形态长势上差异明显，脱毒茎尖苗生长快，叶色浓，植株健壮；带毒茎尖苗长势弱叶色淡，叶片上有明显花叶明脉或褪绿斑；经目测，把带毒症状明显的茎尖苗除去；用血清学检测法对剩余的山药茎尖苗进行检测，去除对山药危害严重的PVA、PVM、PLRV、PVS、PVX、PVY和马铃薯卷叶病毒的茎尖苗；

（3）增殖培养

通过病毒检测后，剩下的无毒苗进行快繁，在超净工作台上，将脱毒无菌苗剪成带有1-2个节间的茎段转接到继代与增殖培养基中进行增殖培养，PH5.6-5.8，在温度26-28℃，光照12-14h/d，光照强度2000-2500lx，湿度65-70%的环境条件下进行培养；20-25d后形成4-5个丛生芽，28-35d生长高度4-6cm左右，在同一培养基上继代繁殖，继代周期为25-28d；循环往复6次以上；

（4）生根培养

选取生长势强、健壮的无菌芽切成含有1-2个节间的小段，长1.0-1.5cm，转入生根培养基中，，培养温度26±2℃，湿度65-75%，光照强度2200-2500LX，光照时间12-14h/d，25-28d后选取长出3-5条0.3-3cm长的根以及展开叶3-5片的植株，待苗长至30-35d时，进行炼苗移栽；

（5）炼苗与移栽

练苗前首先揭开培养瓶的封口膜，练苗时逐步调节湿度和温度使得其接近自然环境，练苗时间为5-7天，然后取出，用自来水冲洗净苗基部的培养基，并灭菌，然后移栽到已灭过菌的腐殖质、碎炉渣、珍珠岩以3-5：1-2：1-2的比例混合的基质中，前期适当遮阴并保持湿度在90%，逐步降至70-75%，15天后去掉薄膜罩，定期杀菌，7-10天一次，共计2-3次。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤1）中的灭菌过程是指采用重量百分比为70-80%的酒精浸泡15-25秒钟，用百分比为0.05-0.15%的升汞溶液灭菌6-11分钟。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的山药是惠楼山药。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

（1）分化与诱导培养基的配方为：MS基本培养基1升加6-苄基腺嘌呤（6-BA）1.0-3.5mg、a-萘乙酸（NAA）0.5-3.0mg、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-D）0.2-2.5mg、玉米素（ZT）0.1-0.3mg、椰汁100-200mg、蔗糖30g、琼脂6.5g；

（2）继代与增殖培养基的配方为：MS基本培养基1升加6-苄基腺嘌呤（6-BA）1.0-3.0mg、a-萘乙酸（NAA）0.5-2.0mg、吲哚丁酸（IBA）0.2-1.5mg、玉米素（ZT）0.1-0.3mg、蔗糖30g、琼脂6g；

（3）生根培养基的配方为：1/2MS基本培养基1升加a-萘乙酸（NAA）0.5-2.0mg、蔗糖20g、琼脂6g。