CN102657092A

CN102657092A - 一种利用山药带腋芽茎段组织培养方法

Info

Publication number: CN102657092A
Application number: CN2012101585884A
Authority: CN
Inventors: 韩晓勇; 殷剑美; 张培通; 彭琦; 郭文琦; 张恒友
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-05-22
Filing date: 2012-05-22
Publication date: 2012-09-12

Abstract

本发明公开了“一种利用山药带腋芽茎段组织培养方法”。选取山药带腋芽茎段作为外植体，经过芽的诱导、继代增殖、生根培养等一系列操作步骤，最后形成山药试管苗。此方法包括几个阶段培养基成分以及处理方法，仅20天左右就可以获得完整组培苗。本发明能够由带腋芽茎段外植体诱导获得山药组培苗，从而可以室内大量繁殖试管苗，实现山药种薯繁殖工厂化生产。本发明具有繁殖系数高、繁殖速度快、繁殖效率高，种苗病毒少、遗传稳定性好且不受环境条件的影响的特点。

Description

一种利用山药带腋芽茎段组织培养方法

技术领域

本发明“一种利用山药带腋芽茎段组织培养的方法”，是由山药带腋芽茎段外植体经组织培养获得试管苗，属于生物技术领域。

背景技术

山药（Dioscorea Opposita Thunb.），为薯蓣科薯蓣属多年生草质缠绕性藤本植物，我国南北各地均有种植。因其具有较高的营养价值和药用价值，是我国地道的药材和传统出口商品，其产品畅销东南亚和日本等国。由于长期进行营养繁殖, 不仅用种量大、扩繁速度慢, 还因连续种植使病毒不断积累导致种性退化，使其种植面积逐年下降，严重影响了质量和产量的提高。利用植物组织培养技术建立山药离体再生体系, 不仅可以加快山药种苗繁殖速度，提高其繁殖效率，而且可显著改善其品质，提高其产量。山药组织培养的研究国内外均有报道，但多以茎段、零余子等诱导愈伤组织为研究内容，不利于保持品种的稳定性。离体条件下利用山药带腋芽茎段诱导获得试管苗，可明显提高繁殖系数和繁殖速度。它不仅具有繁殖率高和利于诱导形成零余子（另申请专利）的特点，而且利于保持本品种的优良特性。

发明内容

技术问题

本发明的目的是找到既能提高山药种薯繁殖系数和繁殖速度，又能保持品种稳定性的方法，此方法具有繁殖系数高、繁殖速度快、繁殖效率高，种苗病毒少、遗传稳定性好且不受环境条件的影响等优点，可以弥补现有山药薯块繁殖系数低、愈伤组织诱导组培苗繁琐、时间长、效率低的不足，从而为山药种薯扩繁提供一种新的方法。

技术方案

一种利用山药带腋芽茎段组织培养的方法，包括以下步骤：

（1）材料处理：将山药的块茎浅埋在细沙中，栽培在恒温（25℃）培养室中，长出幼苗时待用。

（2）外植体的灭菌：取铁棍山药的嫩茎，去掉叶片，用剪刀截成2-3cm带腋芽的茎段，流动水冲洗10min左右。在超净台上用75%酒精浸泡30s，用NaClO灭菌20min，无菌水漂洗5-7次，用解剖刀切去末端留下约1.5-2cm左右的茎段接种在MS培养基中。

（3）芽的诱导分化：外植体经灭菌后接种6-BA0.5-1mg·l^-1，NAA0-0.1mg浓度的MS培养基中。

（4）继代增殖：诱导培养基上萌发出的不定芽长到带两片和两片以上叶片的时候，切取单芽接种在6-BA 1.5mg·l^-1，NAA 0mg·l^-1浓度的MS培养基中。

（5）生根培养：将高2.0 cm以上、带有2片或两片以上叶的健壮小苗切下, 转入生根培养基上进行培养。生根培养基成分为6-BA1.0mg·l^-1，NAA0.2mg·l^-1，活性炭0.02%浓度的MS培养基中。

（6）培养条件：培养室温度为25±2℃，光照强度1200-1500lx，每天光照12h/d。培养基中琼脂的质量分数为7g/L，蔗糖的质量分数为30g/L。

有益效果

本发明能够由带腋芽茎段外植体诱导获得山药组培苗，从而可以室内大量繁殖试管苗，实现山药种薯繁殖工厂化生产。此方法包括几个阶段培养基成分以及处理方法，仅20天左右就可以获得完整组培苗。

本发明具有繁殖系数高、繁殖速度快、繁殖效率高，种苗病毒少、遗传稳定性好且不受环境条件的影响的特点。

日本白、无架山药等品种，利用带腋芽茎段按本发明进行组织培养，均可得到完整组培苗。其中日本白的增殖倍数为2.5，无架山药为1.5。

附图说明

图1带腋芽茎段。

图2丛生芽。

图3 继代培养

图4 生根培养。

图5 组培苗。

具体实施方式

下面通过基于带腋芽茎段外植体诱导获得山药组培苗实施例进一步说明本发明。

1 材料处理

将来源于河南温县的铁棍山药的块茎浅埋在细沙中，栽培在恒温（25℃）培养室中，长出幼苗时待用。

2 培养基灭菌及培养条件

高压灭菌前调整培养基pH值为5.8，保持121℃灭菌20min。培养室温度为25±2℃，光照强度1200-1500lx，每天光照12h。培养基中琼脂的质量分数为7g/L，蔗糖的质量分数为30g/L。

3 外植体的灭菌试验

3.1 试验设计

取铁棍山药的嫩茎，去掉叶片，用剪刀截成2-3cm带腋芽的茎段，流动水冲洗10min左右。在超净台上用75%酒精浸泡30s，用NaClO分别灭菌15min、20 min、30 min，无菌水漂洗5-7次，用解剖刀切去末端留下约1.5-2cm左右的茎段接种在MS培养基中，观察杀菌效果。

3.2不同灭菌时间对外植体灭菌效果的影响

从表1可以看出，外植体灭菌20min效果较好，灭菌成功率达85.2%，死亡率仅为3.7%。由此可见，在NaClO浓度相同的情况下，外植体的灭菌时间应该控制在20min左右，时间太长会增加死亡棵数，时间太短则会使污染数增加，影响灭菌成功率。

表1不同灭菌时间对外植体灭菌效果的影响

灭菌时间/min	接种茎段数/个	污染数/个	死亡数/个	污染率/%	死亡率/%
						10	27	7	0	25.9	0.0
20	27	4	1	14.8	3.7
						30	27	2	3	7.4	11.1

外植体灭菌的方法是：在超净台上用75%酒精浸泡30s，用NaClO灭菌20min，无菌水漂洗5-7次。

4 芽的诱导分化试验

4.1 试验设计

外植体经灭菌后接种在添加不同浓度的6-BA和NAA的MS培养基中，接种20d后统计芽数、芽的诱导率、芽高度及叶子的长相长势等确定适宜芽分化的培养基。激素浓度设置8个处理，每个处理各接种27个芽：

①MS+6-BA0.5mg·l^-1+NAA0.1mg·l^-1； ②MS+6-BA0.5mg·l^-1+NAA0.0mg·l^-1； ③MS+6-BA1.0mg·l^-1+NAA0.1mg·l^-1； ④MS+6-BA1.0mg·l^-1+NAA0.0mg·l^-1； ⑤MS+6-BA1.5mg·l^-1+NAA0.1mg·l^-1； ⑥MS+6-BA1.5mg·l^-1+NAA0.0mg·l^-1； ⑦MS+6-BA1.5mg·l^-1+NAA0.1mg·l^-1；⑧MS+6-BA1.5mg·l^-1+NAA0.0mg·l^-1。

4.2铁棍山药腋芽诱导分化的最佳激素浓度配比

从表2 可以看出，用MS+6-BA0.5mg·l^-1+NAA0.1mg·l^-1、MS+6-BA0.5mg·l^-1+NAA0.0mg·l^-1和MS+6-BA1.0mg·l^-1+NAA0.1mg·l^-1培养基诱导的不定芽数和芽的长势明显优于其它几个培养基，其中以MS+6-BA0.5mg·l^-1+NAA0.1mg·l^-1培养基诱导的芽数最多，高度最高。随着激素浓度的提高，叶片会发生卷曲，出现变态性状。培养基中单独添加6-BA的情况下，随着激素浓度的提高，诱导的芽数呈先升后降的趋势，两种激素都加，诱导的芽数呈下降趋势。

表2 不同培养基对外植体诱导的影响

芽的诱导分化的方法是：将外植体经灭菌后接种6-BA 0.5-1mg·l-1，NAA 0-0.1mg浓度的MS培养基中培养。

5继代增殖试验

5.1 试验设计

诱导培养基上萌发出的不定芽长到带两片和两片以上叶片的时候，切取单芽接种在添加不同浓度的6-BA和NAA 的MS培养基中，30d后观察其增殖倍数。激素浓度设置13个处理。激素浓度设置8个处理，每个处理各接种24个单芽：

5.2 继代增殖效果

由表3 可以看出，诱导丛生苗增殖最适宜培养基为MS+6-BA1.5mg·l^-1+NAA0.0mg·l^-1，丛生苗的长势正常，增殖倍数可达4.1。降低或升高培养基中激素的浓度均能降低丛生的数量。培养基中单独添加6-BA时，随着6-BA浓度的升高诱导丛生苗增殖倍数逐渐提高，但高浓度(2.0 mg·L-1)容易造成茎尖黄化，最终导致死亡。两种激素组合，增值效果不理想。因此，铁棍山药的增殖系数主要取决于培养基中6-BA的浓度。

表3 不同激素浓度对外植体增殖的影响

继代增殖方法是：诱导培养基上萌发出的不定芽长到带两片和两片以上叶片的时候，切取单芽接种在6-BA 1.5mg·l^-1，NAA 0mg·l^-1浓度的MS培养基中。

6生根培养试验

6.1 试验设计

将高2.0 cm以上、带有2片或两片以上叶的健壮小苗切下，转入生根培养基上进行培养。生根培养基加活性炭作为对照。调查不同处理的平均生根天数，45d的生根苗数，生根率，根系平均长度及根系形态。生根培养基设置6个处理，每个处理各接种24个小苗：

①1/2MS+6-BA0.2mg·l^-1+NAA0.8mg·l^-1+活性炭0.02%；

②1/2MS+6-BA0.2mg·l^-1+NAA0.8mg·l^-1；

③1/2MS+6-BA0.2mg·l^-1+NAA1.0mg·l^-1+活性炭0.02%；

④1/2MS+6-BA0.2mg·l^-1+NAA1.0mg·l^-1；

⑤1/2MS+6-BA0.2mg·l^-1+NAA1.2mg·l^-1+活性炭0.02%；

⑥1/2MS+6-BA0.2mg·l^-1+NAA1.2mg·l^-1。

6.2生根培养效果

由表4 可以看出，培养基中添加活性炭后，试管苗的平均生根天数、生根率及根系长度都明显优于未添加活性炭，即活性炭利于铁棍山药根系的形成。培养基中添加活性炭后，试管苗在两周左右基部开始出现白色根点，随后根系逐渐伸长，45d后平均根系长度在0.76cm左右。培养基未添加活性炭，试管苗在一个月后才出现白色根点且试管苗的褐化严重。不同 6-BA 和 NAA 浓度对合铁棍山药生根的影响较大，激素浓度为6-BA0.2mg·l^-1+NAA1.0mg·l^-1+活性炭0.02%，生根效果最好，生根率可达 100 %，45d后根系最长，为1.04cm，且根系长而粗。随着NAA浓度增大，根系会逐渐变短变粗。

表4 不同激素浓度和活性炭对生根的影响

生根培养的方法是：将高2.0 cm以上、带有2片或两片以上叶的健壮小苗切下，转入生根培养基上进行培养。生根培养基成分为6-BA1.0mg·l^-1，NAA0.2mg·l^-1，活性炭0.02%浓度的MS培养基中。

7 利用一种山药腋芽茎段组织培养方法的应用效果

日本白、无架山药等品种，利用带腋芽茎段按步骤1-6进行组织培养，均可得到完整组培苗。其中日本白的增殖倍数为2.5，无架山药为1.5。(图1-5)

Claims

1.一种利用山药带腋芽茎段组织培养方法，包括外植体的灭菌、芽的诱导分化和继代增殖、生根培养，其特征在于：

（1）外植体的灭菌：取铁棍山药的嫩茎，去掉叶片，用剪刀截成2-3cm带腋芽的茎段，流动水冲洗10min；在超净台上用75%酒精浸泡30s，用NaClO灭菌20min，无菌水漂洗5-7次，切去末端留下1.5-2cm的带腋芽茎段接种在MS培养基中；

（2）芽的诱导分化：外植体经灭菌后接种在诱导培养基中，诱导为含0.5-1mg·l^-16-BA，0-0.1mg·l^-1NAA的MS培养基；

（3）继代增殖：诱导培养基上萌发出的不定芽长到带两片或两片以上叶片的时候，切取单芽接种在继代增殖培养基中，继代增殖培养基为含1.5mg·l^-16-BA，0mg·l^-1NAA 的MS培养基；

（4）生根培养：将高2.0 cm以上、带有2片叶的健壮小苗切下, 转入生根培养基上进行培养，生根培养基成分为含1.0mg·l^-16-BA，0.2mg·l^-1NAA，质量比为0.02%的活性炭的MS培养基。

2.根据权利要求1所述一种利用山药带腋芽茎段组织培养方法，其特征在于：其所述步骤（2）～（4）的培养条件为：培养室温度为25±2℃，光照强度1200-1500lx，每天光照12h，培养基中琼脂的质量分数为7g/L，蔗糖的质量分数为30g/L。