CN108401906A - 一种香柚微芽嫁接的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及果树脱毒繁殖技术领域，具体是一种香柚微芽嫁接的方法，包括以下步骤：(1)外植体的选择与消毒，在春季或者秋季取香柚块茎在室内发芽，芽长大后定期喷洒杀菌剂，两周后，再次取芽，芽经过35‑40℃热处理后放在5％的次氯酸钠溶液处理8‑10min，然后在超净台上的解剖镜8‑40倍下进行茎尖剥离，选取顶芽的茎尖或珠心组织作为备用；(2)初代培养，将选取的茎尖或珠心组织再次放入5％的次氯酸钠溶液处理3‑5min后，放入初代培养基中快速繁殖长大；本发明通过对外植体的灭菌、组培中各阶段培养基及激素的选择，建立一种香柚微芽嫁接的方法，为香柚组培苗工厂化生产提供理论依据和技术支持，为新品种选育提供一条新途径。

Description

一种香柚微芽嫁接的方法
技术领域
本发明涉及微芽嫁接技术领域，具体是一种香柚微芽嫁接的方法。
背景技术
香柚果营养价值高，味道香甜，是很具有特色的地方特色农产品，种植香柚对增加农民 收入，改善人民的生活水平具有十分重要的意义。
黄龙病是柚类的代表性病害，已造成我国数以百万计柚果园的毁灭。对优良品种进行脱 毒处理是目前防治这些病害的主要措施。茎尖微芽嫁接脱毒技术主要是利用植物茎尖分生组 织无病毒，细胞分裂速度快的原理发展起来的一种快繁脱毒技术。
自从Murashige等提出微体嫁接技术后，引起了各国科研人员的重视。上世纪八十年代 以来，发达国家利用茎尖微芽嫁接脱毒技术建立了完整的柑橘良种无病毒苗木繁育体系。我 国的柑橘良种无病毒苗木繁育体系建设虽然有一定基础，但不完善，柑橘良种无病毒苗木的 生产能力仅能满足需要的5％左右。马凤桐等通过几个柑橘品种的茎尖微芽嫁接，分别成功获 得甜橙的微芽嫁接苗，但未对脱毒情况进行检测鉴定。姜玲等通过微芽嫁接得到大量嫁接苗， 然后鉴定、证明成功脱除目标病原体。
茎尖微芽嫁接脱毒技术是一种将嫁接和组培相结合的技术，巳被证实可以脱除柑橘黄龙 病、裂皮病、衰退病、碎叶病等病害。但是，目前，此技术在香柚无毒苗繁殖方面的应用还 是一片空白。香柚的繁殖方法主要为高压繁殖和嫁接繁殖，这两种繁殖方式使得病毒极易传 播，运用茎尖微芽嫁接脱毒技术应该接能够去除病毒，加快柑橘繁殖速度，缩短生育周期， 为生产提供优质种源。
永州香柚种植业的快速发展，使得对脱毒苗的需求越来越大，而香柚茎尖快繁脱毒微芽 嫁技术的建立是解决脱毒苗需求的有效途径。因此，充分利用湖南市香柚种质资源，深入开 展香柚茎尖快繁脱毒微芽嫁技术研究，一方面为香柚种苗工厂化、规模化生产提供理论与技 术基础，另一方面也可以为香柚育种、引种及种质保存等提供依据，具有广阔的应用前景。 香柚茎尖快繁脱毒微芽嫁技术的建立，有利于改造江永香柚传统种植业，提高地区特色农业 产品的竞争力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供了一种香柚微芽嫁接的方法， 通过对外植体的灭菌、组培中各阶段培养基及激素的选择，建立一种香柚微芽嫁接的方法， 为香柚组培苗工厂化生产提供理论依据和技术支持，为新品种选育提供一条新途径。
为解决以上技术问题，本发明现提出以下技术方案：一种香柚微芽嫁接的方法，包括以 下步骤：(1)外植体的选择与消毒，在春季或者秋季取香柚块茎在室内发芽，芽长大后定期 喷洒杀菌剂，两周后，再次取芽，芽经过35-40℃热处理后放在5％的次氯酸钠溶液处理 8-10min，然后在超净台上的解剖镜8-40倍下进行茎尖剥离，选取顶芽的茎尖或珠心组织作 为备用；(2)初代培养，将选取的茎尖或珠心组织再次放入5％的次氯酸钠溶液处理3-5min 后，放入初代培养基中快速繁殖长大；(3)次代培养，将长大后的茎尖或珠心组织接种在次 代培养基上培养，诱导分化为愈伤组织或者不定芽；(4)基本培养，将愈伤组织或者不定芽 接种在基本培养基上培养，发育成完整的试管苗；(5)试管苗的脱毒检测；(6)试管苗的嫁 接，将步骤(4)培养的试管苗嫁接在砧木上，形成嫁接苗；(7)炼苗，对嫁接苗进行光、温 锻炼；(8)移栽定植，采用单芽茎段或双芽茎段扦插式移栽，边剪取边扦插，扦插基质可采 用灭过菌的珍珠岩或疏松土壤；(9)看护培养，扦插成活后每隔2-3d喷1次营养液，后期每 隔10d喷一次，以促进扦插苗健壮和顺利成长；(10)无毒种苗，将扦插苗移植于田间，大规 模种植。
进一步的，所述步骤(1)中的杀菌剂为0.1％多菌灵和0.1％链霉素的混合液。
进一步的，所述茎尖或珠心组织为顶芽的前端0.3-0.5mm的部分，所述茎尖或珠心组织 带有1-2个叶原基。
进一步的，所述初代培养基的组成为：MS培养基+0.1-0.5mg/L的NAA和/或0.1-0.5mg/L 的BA，PH为5.6-6.0。
进一步的，所述初代培养的初期的光照强度为1000lx，4周后增加到2000lx，6周后增 加到4000lx，培养温度为21-25℃，光照时间为14-18h/d。
进一步的，所述次代培养基的组成为：MS培养基+0.1-0.5mg/L的NAA和/或0.1-0.5mg/L 的BA+0.6-1.0mg/L的GA，PH为5.6-6.0。
进一步的，所述基本培养基的组成为：MS培养基+6-BA 0.2-0.5mg/L+NAA 0.2-0.5mg/L+ 蔗糖28-32g/L+琼脂6-8g/L，PH 5.6-7.0。
进一步的，所述初代培养基、次代培养基和所述基本培养基均是经过巴氏杀毒冷却后再 使用的。
进一步的，所述试管苗通过PCR病毒检测方法确定是否含有香柚病毒的。
进一步的，所述步骤(7)炼苗的具体做法是：移植前7d左右，将长有3～5片叶、高2～ 3cm的嫁接苗摆放在温室内的驯化畦内，畦内浇上水，畦上方半遮阳进行驯化，以防止强光、 高温灼伤嫁接苗和维持嫁接苗周围的温度，炼苗期温室内的温度要求白天23～27℃，夜间不 低于10℃。
与现有技术相比较，本发明的有益效果在于：1、本发明通过对外植体的灭菌、组培中各 阶段培养基及激素的选择，建立一种香柚微芽嫁接的方法，为香柚组培苗工厂化生产提供理 论依据和技术支持，为新品种选育提供一条新途径；
2、本发明通过对外植体选择使用茎尖或者珠心组织，并对其进行消毒，提高了成活率， 降低了病毒感染率，实现了脱毒的目的；
3、通过在培养基上培养，提供了合适的营养素，提高了存活率，避免了外界因素的影响， 实现了快速繁殖的目的；
4、整个培养过程严格控制，有利于对香柚组培技术的进一步研究；
5、对试管苗进行了病毒检测，确保了香柚的脱毒率，从而为香柚种苗优质、安全、高产 和大面积推广奠定了基础。
具体实施方式
为使对本发明的结构特征及所达成的功效有更进一步的了解和认识，用以较佳的实施例 说明，具体说明如下：
(一)培养基的配制
实施例1
1)初代培养基：MS培养基+0.1mg/L的NAA和/或0.1mg/L的BA，PH为5.6。
2)次代培养基：MS培养基+0.1mg/L的NAA和/或0.1mg/L的BA+0.6mg/L的GA，PH为5.6。
3)基本培养基：MS培养基+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖28g/L+琼脂6g/L，PH5.6。
以配置1L的初代培养基为例，其具体配制过程是：称取1L培养基所需的MS培养基的 各质量份依次溶解、混合；然后依次称取初代培养基配方中的NAA0.1mg和/或BA0.1mg，分 别加入到MS溶液中依次溶解，定容，调节PH值为5.6；最后进行分装，在高温121℃、高压0.1MPa灭菌15-20分钟，培养基冷却后使用。
实施例2
1)初代培养基：MS培养基+0.3mg/L的NAA和/或0.3mg/L的BA，PH为5.8。
2)次代培养基：MS培养基+0.3mg/L的NAA和/或0.3mg/L的BA+0.8mg/L的GA，PH为5.8。
3)基本培养基：MS培养基+6-BA 0.3mg/L+NAA 0.3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，PH5.8。
以配置1L的初代培养基为例，其具体配制过程是：称取1L培养基所需的MS培养基的 各质量份依次溶解、混合；然后依次称取初代培养基配方中的NAA0.3mg和/或BA0.3mg，分 别加入到MS溶液中依次溶解，定容，调节PH值为5.8；最后进行分装，在高温121℃、高压0.1MPa灭菌15-20分钟，培养基冷却后使用。
实施例3
1)初代培养基：MS培养基+0.5mg/L的NAA和/或0.5mg/L的BA，PH为6.0。
2)次代培养基：MS培养基+0.5mg/L的NAA和/或0.5mg/L的BA+1.0mg/L的GA，PH为6.0。
3)基本培养基：MS培养基+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖32g/L+琼脂8g/L，PH6.0。
以配置1L的初代培养基为例，其具体配制过程是：称取1L培养基所需的MS培养基的 各质量份依次溶解、混合；然后依次称取初代培养基配方中的NAA0.5mg和/或BA0.5mg，分 别加入到MS溶液中依次溶解，定容，调节PH值为6.0；最后进行分装，在高温121℃、高压0.1MPa灭菌15-20分钟，培养基冷却后使用。
表1
由表1可知，培养基成分的选择对组培的影响较小。
(二)香柚茎尖的快繁脱毒
一种香柚微芽嫁接的方法，包括以下步骤：(1)外植体的选择与消毒，在春季或者秋季 取香柚块茎在室内发芽，芽长大后定期喷洒杀菌剂，两周后，再次取芽，芽经过35-40℃热 处理后放在5％的次氯酸钠溶液处理8-10min，然后在超净台上的解剖镜8-40倍下进行茎尖剥 离，选取顶芽的茎尖或珠心组织作为备用；(2)初代培养，将选取的茎尖或珠心组织再次放 入5％的次氯酸钠溶液处理3-5min后，放入初代培养基中快速繁殖长大；(3)次代培养，将 长大后的茎尖或珠心组织接种在次代培养基上培养，诱导分化为愈伤组织或者不定芽；(4) 基本培养，将愈伤组织或者不定芽接种在基本培养基上培养，发育成完整的试管苗；(5)试 管苗的脱毒检测。
优选的，步骤(1)中的杀菌剂为0.1％多菌灵和0.1％链霉素的混合液。
优选的，茎尖或珠心组织为顶芽的前端0.4mm的部分；茎尖或珠心组织带有1-2个叶原 基。
优选的，初代培养的初期的光照强度为1000lx，4周后增加到2000lx，6周后增加到4000lx，培养温度为25℃，光照时间为16h/d。
表2
成活率(50例)
外植体杀菌 90％
外植体不杀菌 45％
由上表可知，外植体在组培前需要进行杀菌，以免病毒感染，大大提高了成活率。
(三)香柚试管苗的病毒检测
1)香柚RNA的制备：选取侵染了香柚无症病毒、黄瓜花叶病毒、黄龙病毒的叶片为材料， 采用Omega E.Z.N.A植物RNA提取试剂盒提取基因组RNA，保存于-20℃，备用。
2)cDNA合成：根据香柚病毒基因序列设计出香柚无症病毒、黄瓜花叶病毒、黄龙病毒 的特异性引物对；cDNA合成每个反应总体积为20ul，反应试剂包括总RNA 2ul，10umolOligo(dT)151ul，ddH2O 7.5ul，70℃水浴5min，冰浴5min；添加2.5mM/l dNTP 4ul，5×buffer 4ul，40U/ul RNA酶抑制剂0.5ul，200U/ul M-MLV反转录酶1ul，反应程序为42℃ 反转录60min，70℃灭活15min。
3)PCR扩增：PCR反应总体积为25ul，取1ul反转录合成的cDNA作为PCR模板，PCR 反应体系包括：10×buffer 2.5ul，25mM/l Mg2+2ul，2.5mM/l dNTP 2ul，10uM/l正反向 引物各1ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.2ul，15.3ul ddH2O；扩增程序为：94℃预变性5min； 94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃终止反应。
4)观察电泳条带：以电泳条带对照，确立香柚试管苗是否仍感染相应病毒。
(四)香柚的微芽嫁接
(1)将病毒检验合格的试管苗嫁接在砧木上，形成嫁接苗；(2)炼苗，对嫁接苗进行光、 温锻炼；(3)移栽定植，采用单芽茎段或双芽茎段扦插式移栽，边剪取边扦插，扦插基质可 采用灭过菌的珍珠岩或疏松土壤；(4)看护培养，扦插成活后每隔2-3d喷1次营养液，后期 每隔10d喷一次，以促进扦插苗健壮和顺利成长；(5)无毒种苗，将扦插苗移植于田间，大规模种植。
优选的，移植前7d左右，将长有3～5片叶、高2～3cm的嫁接苗摆放在温室内的驯化畦 内，畦内浇上水，畦上方半遮阳进行驯化，以防止强光、高温灼伤嫁接苗和维持嫁接苗周围 的温度。移至温室的嫁接苗，由于湿度下降，使嫁接苗的茎叶变硬，加上光照增强，茎秆变 粗，叶片肥厚浓绿，有效地抑制了徒长和真菌的侵染，从而提高了嫁接苗的抗逆性和对环境 条件变化的适应能力，提高了移栽成活率。炼苗期温室内的温度一般要求白天23～27℃，夜 间不低于10℃。
表3
嫁接苗 愈伤组织分化 不定芽增值 外植体茎尖
周期 90d 101d 120d
成活率(50例) 85％ 85％ 86％
由表3可知，三种嫁接苗的成活率相差不大，但是由愈伤组织分化培养的嫁接苗的培养 周期最短，为90d；其次是诱导不定芽增值的嫁接苗，为101d；外植体茎尖培养的嫁接苗周 期最长，为120d。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非用以对其限制；尽管 参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的技术人员应当理解，其依然可以对前 述实施例记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或 替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神与范围。

Claims (10)

1.一种香柚微芽嫁接的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)外植体的选择与消毒，在春季或者秋季取香柚块茎在室内发芽，芽长大后定期喷洒杀菌剂，两周后，再次取芽，芽经过35-40℃热处理后放在5％的次氯酸钠溶液处理8-10min，然后在超净台上的解剖镜8-40倍下进行茎尖剥离，选取顶芽的茎尖或珠心组织作为备用；(2)初代培养，将选取的茎尖或珠心组织再次放入5％的次氯酸钠溶液处理3-5min后，放入初代培养基中快速繁殖长大；(3)次代培养，将长大后的茎尖或珠心组织接种在次代培养基上培养，诱导分化为愈伤组织或者不定芽；(4)基本培养，将愈伤组织或者不定芽接种在基本培养基上培养，发育成完整的试管苗；(5)试管苗的脱毒检测；(6)试管苗的嫁接，将步骤(4)培养的试管苗嫁接在砧木上，形成嫁接苗；(7)炼苗，对嫁接苗进行光、温锻炼；(8)移栽定植，采用单芽茎段或双芽茎段扦插式移栽，边剪取边扦插，扦插基质可采用灭过菌的珍珠岩或疏松土壤；(9)看护培养，扦插成活后每隔2-3d喷1次营养液，后期每隔10d喷一次，以促进扦插苗健壮和顺利成长；(10)无毒种苗，将扦插苗移植于田间，大规模种植。
2.根据权利要求1所述的一种香柚微芽嫁接的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的杀菌剂为0.1％多菌灵和0.1％链霉素的混合液。
3.根据权利要求1所述的一种香柚微芽嫁接的方法，其特征在于，所述茎尖或珠心组织为顶芽的前端0.3-0.5mm的部分，所述茎尖或珠心组织带有1-2个叶原基。
4.根据权利要求1所述的一种香柚微芽嫁接的方法，其特征在于，所述初代培养基的组成为：MS培养基+0.1-0.5mg/L的NAA和/或0.1-0.5mg/L的BA，PH为5.6-6.0。
5.根据权利要求1所述的一种香柚微芽嫁接的方法，其特征在于，所述初代培养的初期的光照强度为1000lx，4周后增加到2000lx，6周后增加到4000lx，培养温度为21-25℃，光照时间为14-18h/d。
6.根据权利要求1所述的一种香柚微芽嫁接的方法，其特征在于，所述次代培养基的组成为：MS培养基+0.1-0.5mg/L的NAA和/或0.1-0.5mg/L的BA+0.6-1.0mg/L的GA，PH为5.6-6.0。
7.根据权利要求1所述的一种香柚微芽嫁接的方法，其特征在于，所述基本培养基的组成为：MS培养基+6-BA 0.2-0.5mg/L+NAA 0.2-0.5mg/L+蔗糖28-32g/L+琼脂6-8g/L，PH5.6-7.0。
8.根据权利要求1所述的一种香柚微芽嫁接的方法，其特征在于，所述初代培养基、次代培养基和所述基本培养基均是经过巴氏杀毒冷却后再使用的。
9.根据权利要求1所述的一种香柚微芽嫁接的方法，其特征在于，所述试管苗通过PCR病毒检测方法确定是否含有香柚病毒的。
10.根据权利要求1所述的一种香柚微芽嫁接的方法，其特征在于，所述步骤(7)炼苗的具体做法是：移植前7d左右，将长有3～5片叶、高2～3cm的嫁接苗摆放在温室内的驯化畦内，畦内浇上水，畦上方半遮阳进行驯化，以防止强光、高温灼伤嫁接苗和维持嫁接苗周围的温度，炼苗期温室内的温度要求白天23～27℃，夜间不低于10℃。
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