CN113826549B

CN113826549B - 一种观赏石斛兰杂交育种方法

Info

Publication number: CN113826549B
Application number: CN202111020835.XA
Authority: CN
Inventors: 谢光明; 李秀梅; 刘进平; 陈银华
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2021-09-01
Filing date: 2021-09-01
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2041-09-01
Also published as: WO2023029309A1; CN113826549A

Abstract

本发明提供一种观赏石斛兰杂交育种方法，包括(1)在开花后第4～6d进行人工授粉杂交；(2)将蒴果消毒处理，切开口子，将种子在萌发培养基上均匀涂抹成薄层，萌发培养基为1/2MS+活性炭13～17g/L+香蕉28～32g/L+土豆18～22g/L+胰蛋白胨18～22g/L+叶酸0.3～0.5mg/L；(3)种子萌发至≥0.1cm时，转入壮苗培养基；苗株长至≥0.5cm，且根头冒出时，转入生根培养基，得到生根苗；(4)将生根苗长进行移栽，得到实生苗；(5)进行杂种后代优良单株选择；本发明极大地缩短了石斛兰杂交育种时间，出苗率高且出苗整齐，实现优良单株的迅速组培快繁。

Description

一种观赏石斛兰杂交育种方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种观赏石斛兰杂交育种方法。

背景技术

石斛兰是具有高观赏价值和商业价值兰花之一，与蝴蝶兰、卡特兰、万代兰一起被列为四大观赏兰花。目前我国对于石斛的研究，大部分集中于药用石斛兰的资源分布、无菌播种、组织培养及药用成分和药理作用等方面，而在石斛兰新品种的培育方法的研究较少。近年来，石斛兰因其较高的观赏价值引起兰花育种者的注意，观赏石斛兰的育种将成为研究的重点和热点。

传统的育种方法进行兰花杂交育种往往至少需要5～10年的时间，因为开花性状往往是直观鉴定杂交后代的关键特征，而多数兰花常规栽培需要几年才能达到开花阶段。因此，目前杂交育种是石斛兰杂交育种的主要手段，而现有的组培快繁技术对杂交兰花种子的无菌萌发效率低，萌发率低，生长势差，出苗率低，生根效果差，导致成苗周期长，既影响了石斛兰的杂交育种效率，且易导致杂交后代优良单株选择的稳定性差的不足，因此，寻找一种新的观赏石斛兰杂交育种方法，以充分缩短育种时间，实现优良单株的迅速组培快繁，促进石斛兰良种的迅速上市。

发明内容

鉴以此，本发明提出一种可快速萌发成苗且生长势稳定观赏石斛兰杂交育种方法。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种观赏石斛兰杂交育种方法，包括如下步骤：

步骤1：人工授粉：在石斛兰开花后第4～6d，进行人工授粉杂交，结果成熟后，收获蒴果；

步骤2：种子无菌萌发：将蒴果采用质量浓度为70～80％酒精和质量浓度为0.05～0.15％升汞进行消毒处理后，将蒴果切开一个口子，将种子在萌发培养基上均匀地涂抹成薄层，使单粒种子之间间隔2.0～2.5mm，进行种子无菌萌发，所述萌发培养基为1/2MS+活性炭13～17g/L+香蕉28～32g/L+土豆18～22g/L+胰蛋白胨18～22g/L+叶酸0.3～0.5mg/L；

步骤3：壮苗生根培养：当种子萌发至≥0.1cm时，转入壮苗培养基中；待苗株长至≥0.5cm，且根头冒出时，转入生根培养基中，得到生根苗；

步骤4：移栽：当生根苗长至≥5cm高，根数≥4条，且根长≥2cm时，采用进口水苔进行移栽，得到实生苗；

步骤5：杂种后代优良单株选择：依据实生苗1年后开花性状，保留符合育种目标的杂种后代，选择优良的石斛兰杂交植株。

进一步说明，步骤2中，消毒处理为先采用质量浓度为75％酒精进行果实表面消毒28～32s，无菌水冲洗2～3次，用质量浓度为0.1％升汞消毒8～12min，无菌水漂洗2～3次。

更优选的，所述萌发培养基为1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L+土豆20g/L+胰蛋白胨20g/L+叶酸0.5mg/L。

进一步说明，步骤2中，将切开口子的蒴果采用含有0.01～0.03％叶酸和0.05％核黄素的混合水溶液浸泡10～20min，于30～40℃风干后，将种子在萌发培养基上均匀地涂抹成薄层。

进一步说明，步骤3中，所述壮苗培养基为1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L+土豆20g/L。

进一步说明，步骤3中，所述生根培养基为1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L+土豆20g/L+IBA 0.1mg/L+NAA 0.1mg/L。

进一步说明，步骤4中，生根苗移栽前进行瓶苗炼苗处理10d，并筛选含有2～4个芽，高度≥5cm，且最高有4片叶的生根苗，采用多菌灵1000倍液浸泡整株小苗10min，捞出后沥干，移栽到进口水苔基质中。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明提出一种观赏石斛兰杂交育种方法，主要通过控制人工杂交授粉的时间的基础上，采用涂层法播种进行种子的无菌萌发，将人工杂交与组织培养相结合，不仅可以对大量杂交种子后代进行选择，而且极大地缩短了育种时间。

(2)本发明通过优化种子萌发培养基配方，使之结合涂层法播种方法，不仅大大提高了种子的萌发率和显著缩短了萌发时间，而且有效改善芽球的生长势。

(3)本发明在控制一定的壮苗生根培养和移栽条件下，有效促进幼苗的生长速度，改善苗基部粗度，即加速苗的生长，又可大幅提高生根效果，出苗率高且出苗整齐。

(4)本发明实现优良单株的迅速组培快繁，开花后根据据育种目标选择，符合育种目标且性状稳定的杂交后代的单株，并且可取芽进行组培快繁，移栽开花后，与杂交后代母株性状一致，促进良种的迅速上市。

附图说明

图1为本发明实施例中的人工授粉图与果荚收获；A：石斛兰人工授粉；B：给杂交株挂标签；C：成熟的杂交果荚；D：杂交果荚的收获与处理；

图2为本发明实施例中的石斛兰杂交种子无菌萌发与实生苗培养；A：杂交种子撒播到培养基上；B：杂交种子无菌萌发；C：实生苗壮苗培养；D：实生苗生根培养。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种观赏石斛兰杂交育种方法，包括如下步骤：

(1)人工授粉：在石斛兰开花后第4d，进行人工授粉杂交，结果成熟后，收获蒴果；

(2)种子无菌萌发：将蒴果先采用质量浓度为70％酒精进行果实表面消毒28s，无菌水冲洗2次，用质量浓度为0.05％升汞消毒8min，无菌水漂洗2次，将果实切开一个口子，将种子在萌发培养基上均匀地涂抹成薄层，使单粒种子之间隔2.0～2.5mm，进行种子无菌萌发，所述萌发培养基为1/2MS+活性炭13g/L+香蕉28g/L+土豆18g/L+胰蛋白胨18g/L+叶酸0.3mg/L；

(3)壮苗生根培养：当种子萌发至0.1cm以上时，转入壮苗培养基中培养；壮苗培养基为1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L+土豆20g/L；待苗株长至0.5cm以上，且根头冒出时，转入生根培养基中培养，生根培养基为1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L+土豆20g/L+IBA0.1mg/L+NAA 0.1mg/L，得到生根苗；

(4)移栽：当生根苗长至5cm以上高，根数4条以上，且根长2cm以上时，采用进口水苔进行移栽，得到实生苗；

(5)杂种后代优良单株选择：依据实生苗1年后开花性状，保留符合育种目标的杂种后代，选择优良的石斛兰杂交植株。

实施例2

一种观赏石斛兰杂交育种方法，包括如下步骤：

(1)人工授粉：在石斛兰开花后第6d，进行人工授粉杂交，结果成熟后，收获蒴果；

(2)种子无菌萌发：将蒴果先采用质量浓度为80％酒精进行果实表面消毒32s，无菌水冲洗3次，用质量浓度为0.15％升汞消毒12min，无菌水漂洗3次，将果实切开一个口子，先采用含有0.01％叶酸和0.05％核黄素的混合水溶液浸泡10min，于30℃风干后，将种子在萌发培养基上均匀地涂抹成薄层，使单粒种子之间隔2.0～2.5mm，进行种子无菌萌发，所述萌发培养基为1/2MS+活性炭17g/L+香蕉32g/L+土豆22g/L+胰蛋白胨22g/L+叶酸0.5mg/L；

(4)移栽：当生根苗长至5cm以上，根数4条以上，且根长2cm以上时，进行瓶苗炼苗处理10d，并筛选含有2～4个芽，高度5cm以上，且最高有4片叶的生根苗，采用多菌灵1000倍液浸泡整株小苗10min，捞出后沥干，移栽到进口水苔基质中，得到实生苗；

实施例3

一种观赏石斛兰杂交育种方法，包括如下步骤：

(1)人工授粉：在石斛兰开花后第5d，进行人工授粉杂交，结果成熟后，收获蒴果；

(2)种子无菌萌发：将蒴果先采用质量浓度为75％酒精进行果实表面消毒30s，无菌水冲洗3次，用质量浓度为0.1％升汞消毒10min，无菌水漂洗3次；将果实切开一个口子，将切开口子的蒴果采用含有0.03％叶酸和0.05％核黄素的混合水溶液浸泡20min，于40℃风干后，将种子在萌发培养基上均匀地涂抹成薄层，使单粒种子之间隔2.0～2.5mm，进行种子无菌萌发，所述萌发培养基为1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L+土豆20g/L+胰蛋白胨20g/L+叶酸0.4mg/L；

本发明以水晶(Dendrobium Pattaya Fairy×Dendrobium compactum)为母本，粉黛(Dendrobium Cherry Song)纯色‘变异种03’为父本，进行杂交授粉、种子无菌萌发、实生苗壮苗生根培养、移栽和优良单株选择的关键技术环节进行研究实验。

母本石斛兰水晶：假球茎矮，在25～35cm；花枝多，可以达到3～5个；花箭比较短，每个箭上的花苞数量在5～6个；花不耐高温，在30℃以上，花粉粒比较容易脱落导致谢花；花瓣薄；叶片脆，容易折断；花瓣颜色比较浅。

父本‘变异种03’：假球茎在45～55cm；花枝数量可以达到3～5个；花箭长，花苞数在8～15个；耐高温；颜色深。

实施例4-对不同授粉时间杂交结果的影响的研究

对石斛兰花开放后的不同天数进行试验，上午时间用牙签挑去药帽，露出黄色的花粉粒，用牙签蘸取花粉粒，将蘸住花粉粒的牙签尖轻轻接触母本雌蕊的柱头凹陷处，使其蘸上花粉粒，以不损坏合生蕊柱为原则(图1A)。用标签写明自交和杂交时间以及杂交组合名称,挂在母本植株上(图1B)。4～5个月后种子成熟，收获果荚(图1C)。每株收获3～4个果荚进行处理(图1D)。

结果表明，从石斛兰开花(花苞打开)到开花后第4d，杂交座果率不断提高，花粉的活力不断提高的，开花后第4～6d，杂交座果率最高，达到100％，之后，杂交座果率就开始下降，开花后第8天时，杂交座果率减少到50％(表1)。表明开花后第4～6d花粉的活力一直处于最佳状态，是石斛兰最佳授粉时间。

表1不同授粉时间对石斛兰水晶(母本)与‘变异种03’(父本)杂交结果的影响

实施例5-不同萌发培养基和播种方法对石斛兰种子无菌萌发的影响

(1)不同萌发培养基和播种方法对石斛兰种子无菌萌发的影响

将实施例4收获得的蒴果进行消毒处理，蒴果用75％酒精进行果实表面消毒30s，无菌水冲洗3次，用0.1％升汞消毒10min，无菌水漂洗3次。在无菌条件下分别采用涂层法播种和散播法，其中，涂层法播种为：将处理过的果实切开一个口子，用接种工具将种子在萌发培养基上均匀地涂抹成薄层，使单粒种子之间隔2.0～2.5mm，进行种子无菌萌发培养。散播法为，将果实切开后，种子撒播到萌发培养基上，进行种子无菌萌发培养，并设定不同的萌发培养基配方，观察并统计石斛兰种子无菌萌发情况。

结果表明，涂层法比撒播法不仅可提高萌发率0.5～1倍，而且可将萌发时间缩短接近100d。与撒播法相比，涂层法出苗整齐，有效苗的数量也大幅提高。

而且，在涂层法播种(图2A)的基础上，以1/2MS为基本培养基，附加活性炭15g/L虽然不能使萌发时间缩短，但可提高萌发率；当在1/2MS+活性炭15g/L基础上添加香蕉30g/L、香蕉30g/L和土豆20g/L都能提高萌发率和缩短萌发时间，并能改善生长势；而同时添加香蕉、土豆和胰蛋白胨萌发率最高，萌发时间明显缩短，分别达到87％和26d，且芽球翠绿，颗粒饱满透明(表2，图2B)。以1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L+土豆20g/L+胰蛋白胨20g/L+叶酸0.5mg/L为无菌萌发培养基，涂层播种时，其萌发率达100％，萌发时间缩短至21d，且芽球翠绿，颗粒饱满透明，而撒播法播种时，其萌发时间无明显变化。

表2不同萌发培养基和播种方法对石斛兰种子无菌萌发的影响

(2)不同浓度叶酸对石斛兰种子无菌萌发的影响

以1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L+土豆20g/L+胰蛋白胨20g/L为萌发培养基的基础配方，分别添加不同的叶酸浓度叶酸，得到不同的无菌萌发培养基，并在涂层法播种下，研究不同浓度叶酸对石斛兰种子无菌萌发的影响。

结果表明，随着叶酸浓度的提高，石斛兰种子的萌发率和缩短萌发时间进一步改善，当附加0.5mg/L叶酸浓度时，萌发率可达100％，缩短萌发时间为21d，而继续提高叶酸浓度时，并不能进一步提高石斛兰种子的萌发率和缩短萌发时间(表3)。因此，本发明在以涂层法播种下，最佳无菌萌发培养基为1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L+土豆20g/L+胰蛋白胨20g/L+叶酸0.5mg/L。

表3叶酸对石斛兰种子无菌萌发的影响

(3)不同蒴果种子处理对石斛兰种子无菌萌发的影响

将切开口子的蒴果采用不同的营养液进行浸泡处理15min，于35℃风干后，并采用涂层法播种下，以1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L+土豆20g/L+胰蛋白胨20g/L+叶酸0.5mg/L为萌发培养基，观察石斛兰种子无菌萌发的情况。

结果表明，单独采用0.03％叶酸或核黄素浸泡处理，种子无菌萌发时间缩短；尤其是两者组合，其萌发时间明显缩短，但随着叶酸的浓度增加时，其萌发时间逐渐延长，表明采用低浓度的叶酸和核黄素混合液对蒴浸泡处理，可进一步缩短种子的萌发时间。

表4不同蒴果种子处理对石斛兰种子无菌萌发的影响

实施例6-不同壮苗培养基和生根培养基对石斛兰无菌实生苗培养的影响

基于上述涂层法播种和由1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L+土豆20g/L+胰蛋白胨20g/L+叶酸0.5mg/L的无菌萌发培养基培养而得实生苗，当实生苗长到0.1cm时(刚冒出叶尖)，移入壮苗培养基中培养，待苗株长到0.5cm，有根头冒出，转到生根培养基中培养。设定不同的壮苗培养基配方和不同的生根培养基配方，观察并统计不同壮苗培养基和生根培养基下的石斛兰无菌实生苗培养的情况。

结果表明，在壮苗培养基中，1/2MS基础培养基上加不加活性炭15g/L效果差不多，苗长到2cm均需60d，生长势也类似(苗株偏黄，苗的基部偏细，生长速度慢)，但加活性炭可防止苗的基部褐化。而1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L，可将苗长到2cm所需天数缩短至46d，苗株翠绿，苗的基部略有变粗；壮苗培养基1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L+土豆20g/L上生长的苗生长速度与1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L上的苗类似，但基部变粗十分明显，因此，最佳壮苗培养基为1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L+土豆20g/L，(表5，图2C)。

在生根培养基中，基本培养基1/2MS附加活性炭15g/L有利于生根，而在此基础上附加香蕉30g/L和土豆20g/L则可加速苗的生长，并促进假球茎出现。在1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L+土豆20g/L中附加IBA 0.1mg/L不仅可加速苗的生长，还可大幅提高生根效果，生根数较多，但是根比较短，而再加附NAA 0.1mg/L则不仅生根数较多，而且根比较长，因此，最佳生根培养基为1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L+土豆20g/L+IBA 0.1mg/L+NAA0.1mg/L(表6，图2D)。

表5不同壮苗培养基对石斛兰无菌实生苗培养的影响

备注：用＊表示生根情况

实施例7-不同移栽基质对石斛兰组培苗成活率的影响

将生根苗在生根培养基中培养至苗株长至5cm以上，根数4条以上，根长为2cm以上时，进行瓶苗炼苗处理10d，并筛选含有2～4个芽，高度5cm以上，且最高有4片叶的生根苗，采用多菌灵1000倍液浸泡整株小苗10min，捞出后沥干，移栽到不同基质中，观察并统计石斛兰组培苗成活率及生长情况。

结果表明，移栽使用的基质不同，移栽后新根出现时间、感病情况和最后的成活率也有较大差异。其中以进口水苔效果最好，移栽后24d即可观察到新生根出现，另外，不容易感染常见的疫病和软腐病，成活率最高，为97％(表7)。植株开花后根据育种目标选择优良单株，育成观赏石斛兰杂交新品种‘万泉宝石’。

表7不同移栽基质对石斛兰组培苗成活率的影响

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种观赏石斛兰杂交育种方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤2：种子无菌萌发：将蒴果采用质量浓度为70～80％酒精和质量浓度为0.05～0.15％升汞进行消毒处理后，将蒴果切开一个口子，将切开口子的蒴果采用含有0.01～0.03％叶酸和0.05％核黄素的混合水溶液浸泡10～20min，于30～40℃风干后，将种子在萌发培养基上均匀地涂抹成薄层，使单粒种子之间间隔2.0～2.5mm，进行种子无菌萌发，所述萌发培养基为1/2MS+活性炭13～17g/L+香蕉28～32g/L+土豆18～22g/L+胰蛋白胨18～22g/L+叶酸0.3～0.5mg/L；

步骤3：壮苗生根培养：当种子萌发至≥0.1cm时，转入壮苗培养基中，所述壮苗培养基为1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L+土豆20g/L；待苗株长至≥0.5cm，且根头冒出时，转入生根培养基中，所述生根培养基为1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L+土豆20g/L+IBA 0.1mg/L+NAA 0.1mg/L，得到生根苗；

2.如权利要求1所述的一种观赏石斛兰杂交育种方法，其特征在于：步骤2中，消毒处理为先采用质量浓度为75％酒精进行果实表面消毒28～32s，无菌水冲洗2～3次，用质量浓度为0.1％升汞消毒8～12min，无菌水漂洗2～3次。

3.如权利要求1所述的一种观赏石斛兰杂交育种方法，其特征在于：所述萌发培养基为1/2MS+活性炭15g/L+香蕉30g/L+土豆20g/L+胰蛋白胨20g/L+叶酸0.5mg/L。

4.如权利要求1所述的一种观赏石斛兰杂交育种方法，其特征在于：步骤4中，生根苗移栽前进行瓶苗炼苗处理10d，并筛选含有2～4个芽，高度≥5cm，且最高有4片叶的生根苗，采用多菌灵1000倍液浸泡整株小苗10min，捞出后沥干，移栽到进口水苔基质中。