CN113331053B - 一种石斛兰纯色花的分离育种方法 - Google Patents

一种石斛兰纯色花的分离育种方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113331053B
CN113331053B CN202110577971.2A CN202110577971A CN113331053B CN 113331053 B CN113331053 B CN 113331053B CN 202110577971 A CN202110577971 A CN 202110577971A CN 113331053 B CN113331053 B CN 113331053B
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
protocorm
dark
buds
hours
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110577971.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113331053A (zh
Inventor
谢光明
李秀梅
刘进平
陈银华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hainan University
Original Assignee
Hainan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hainan University filed Critical Hainan University
Priority to CN202110577971.2A priority Critical patent/CN113331053B/zh
Publication of CN113331053A publication Critical patent/CN113331053A/zh
Priority to PCT/CN2021/141023 priority patent/WO2022247259A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113331053B publication Critical patent/CN113331053B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明提供一种石斛兰纯色花的分离育种方法，以石斛兰侧芽茎段为外植体，采用原球茎诱导培养基为1/2MS+BA 3mg/L+NAA 0.2mg/L，原球茎增殖培养基为1/2MS+BA 3mg/L+NAA 0.2mg/L+香蕉30g/L+土豆20g/L，结合液体悬浮培养和切掉新芽的处理方式，进行石斛兰纯色花的分离育种，本发明可提高原球茎增殖率，并有效地从石斛兰花色嵌合体中分离出稳定的纯色花，分离率达76.09％。

Description

一种石斛兰纯色花的分离育种方法
技术领域
本发明涉及分离育种技术领域，特别涉及一种石斛兰纯色花的分离育种方法。
背景技术
石斛兰，兰科石斛属多年生草本附生类植物，总状花序硕大，花色繁多，艳丽多彩。石斛兰有很多花色嵌合体品种，如红白花色嵌合体，这类花色嵌合体品种在繁殖过程中花色和图案不稳定，难以与母株保持一致。而纯色花或单色花品种在繁殖过程中能保持花色的稳定性，具有较高的商品性。
石斛兰常规繁殖方法为分株、分芽和扦插，但是这些方法繁殖体较大，繁殖率低。采用植物组织培养可对石斛兰进行快速繁殖，通常通过原球茎诱导、原球茎增殖、原球茎分化成苗、壮苗和生根培养等环节进行培育和繁殖。在此过程中原球茎(类似于由少数细胞起源的体细胞胚胎)会不定增殖，花色嵌合体局部的纯色区域会再生出稳定的纯色或单色个体。利用少数细胞起源体的原球茎进行不定增殖，可以有效地从花色嵌合体中分离出稳定的纯色花或单色花个体。只有成功诱导出原球茎，并采用原球茎增殖的方式，才能分离到一定数量纯色花植株。而现有技术缺少将石斛兰的花色嵌合体中分离出纯色花的分离育种方法。如，申请号CN107711508A公开一种石斛兰的组培快繁方法，对石斛兰外植体的伤害小，提供的培养基配方可显著提高石斛兰的诱导分化率、外植体增殖系数和生根率，缩短培育周期，提高石斛兰组培苗的质量。申请号CN103314861A公开一种石斛兰试管内杂交育种方法，采用无菌接种、试管开花诱导和试管杂交育种，选择杂交组合优良花形和花色进行组织培养，缩短杂交育种周期，培育出石斛兰新品种。两篇专利都未涉及到石斛兰纯色花分离育种的方法，仅是涉及提高石斛兰培育成效和培育杂交新品种的技术问题。
发明内容
鉴以此，本发明的目的在于提供一种石斛兰纯色花的分离育种方法，能够有效地从石斛兰花色嵌合体中分离出稳定的纯色花或单色花。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种石斛兰纯色花的分离育种方法，包括以下步骤：
S1外植体选择：以石斛兰侧芽茎段为外植体，自来水冲洗干净，稀释的洗洁精浸泡5～15min，自来水冲洗干净，用体积浓度70％酒精浸泡50～70s，然后无菌水冲洗4～6次，在超净台上除去叶片及膜质叶鞘，转入质量浓度0.1％HgCl2溶液消毒4～12min，无菌水冲洗4～6次，用无菌纱布或无菌滤纸吸干水。
进一步说明，质量浓度0.1％HgCl2溶液加入1-2滴吐温-80。
S2原球茎诱导：将消毒后的侧芽接种在配方为1/2MS+BA1～4mg/L+NAA0.1～0.2mg/L的诱导培养基上进行第一次固态培养；当新生腋芽长至0.8～1.2cm，叶片2～3片后，切下新芽，剥掉叶片，去掉顶芽，取腋芽，重新接入同配方为1/2MS+BA 1～4mg/L+NAA0.1～0.2mg/L的新诱导培养基，进行第二次固态培养，得原球茎；
进一步说明，第一次固态培养，培养45～55d，其中，每天光照培养10～14h，黑暗培养10～14h；光照培养条件为光照强度1300～1700Lux，温度24～28℃，黑暗培养温度为24～28℃。
进一步说明，第二次固态培养反复培养2-3次，每次第二次固态培养25～35d；每次第二次固态培养包括全黑暗培养9～11d后，每天光照培养10～14h，黑暗培养10～14h；光照培养条件为光照强度1300～1700Lux，温度24～28℃，黑暗培养温度均为24～28℃；
S3原球茎增殖：切掉原球茎的顶部芽，挑选原球茎含有5～15个原球茎颗粒接种至配方为1/2MS+BA 1～4mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+香蕉20～40g/L+土豆10～30g/L的增殖培养基中，24～28℃、100～120rpm液体悬浮培养，每3～7d，切掉原球茎新长出的芽，接入同配方为1/2MS+BA 1～4mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+香蕉20～40g/L+土豆10～30g/L的新增殖培养基培养，共培养4～6个周期，每个周期为25～35d，得原球茎成团；
S4原球茎分化：将原球茎成团接种在配方为NAA0～0.2mg/L+香蕉20～40g/L+土豆10～30g/L的分化培养基，固态培养，培养35～45d，其中，包括全黑暗培养6～8d后，每天光照培养10～14h，黑暗培养10～14h，得小苗；光照培养条件为光照强度1300～1700Lux，温度24～28℃，黑暗培养温度为24～28℃；
S5壮苗生根培养：将小苗经配方为1/2MS+香蕉20～40g/L+土豆10～30g/L+活性炭10～20g/L的壮苗培养基，培养45～55d，其中，每天光照培养10～14h，黑暗培养10～14h，得苗株，移入配方为1/2MS+香蕉20～40g/L+土豆10～30g/L+活性炭10～20g/L+IBA 0～0.4mg/L+NAA 0～0.4mg/L的生根培养基，生根培养85～95d，其中，包括全黑暗培养6～8d后，每天光照培养10～14h，黑暗培养10～14h，得生根苗；光照培养条件为光照强度1300～1700Lux，温度24～28℃，黑暗培养温度均为24～28℃；
S6优良后代单株选择：将长至5～8cm，根支4条以上，根长2cm以上的生根苗移栽，淘汰嵌合体杂色花植株，保留纯色花或单色花后代。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明利用石斛兰组织培养与快速繁殖过程中少数细胞起源体的原球茎不定增殖，可以有效地从花色嵌合体中分离产生稳定的纯色花或单色花个体，这是石斛兰常规繁殖方法(如分株、分芽和扦插)无法有效做到的。本发明采用原球茎诱导培养基，反复培养，成功诱导出原球茎，采用原球茎接种，才能分离到一定数量的纯色花植株；
(2)本发明增殖培养基加入香蕉利于原球茎的增殖，土豆利于原球茎的生长，产生的原球茎健壮饱满、颗粒较大，活力强，在原球茎增殖过程中不易分化产生小芽，减少芽出芽的不利现象；
(3)本发明采用液体悬浮培养和切掉新芽的处理方式，进一步抑制原球茎增殖阶段芽的分化，有效地提高原球茎的增殖率，使获得的开花植株数和纯色花植株数多，纯色花分离率高；
(4)本发明原球茎分化培养基在原球茎增殖培养基基础上，去除细胞分裂素BA，可使原球茎变大变绿，分化成苗的原球茎增多，分化的苗株较大、较壮；
(5)本发明生根培养基中附加香蕉30g/L和土豆20g/L可在促进生根的同时促进壮苗，不仅更易出根，且植株叶片更厚、更宽，产生的根更粗、更壮。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
S1外植体选择：以石斛兰侧芽茎段为外植体，自来水冲洗干净，稀释的洗洁精浸泡10min，自来水冲洗干净，用体积浓度70％酒精浸泡60s，然后无菌水冲洗5次，在超净台上除去叶片及膜质叶鞘，转入含有1滴吐温-80的质量浓度0.1％HgCl2溶液消毒8min，无菌水冲洗5次，用无菌纱布或无菌滤纸吸干水。
S2原球茎诱导：将消毒后的侧芽接种在配方为1/2MS+BA 1mg/L+NAA0.1mg/L的诱导培养基上进行第一次固态培养，培养45d，每天光照培养14h，黑暗培养10h，光照培养条件为光照强度1500Lux，温度26℃，黑暗培养温度为26℃；当新生腋芽长至0.8cm，叶片2片后，切下新芽，剥掉叶片，去掉顶芽，取腋芽，重新接入配方为1/2MS+BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L的新诱导培养基进行第二次固态培养，得原球茎；第二次固态培养反复培养2次，每次第二次固态培养25d，每次第二次固态培养包括全黑暗培养9d后，每天光照培养14h，黑暗培养10h；光照培养条件为光照强度1500Lux，温度26℃，黑暗培养温度均为26℃；
S3原球茎增殖：切掉原球茎的顶部芽，挑选原球茎含有5个原球茎颗粒接种至配方为1/2MS+BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+香蕉20g/L+土豆10g/L的增殖培养基中，26℃、100rpm液体悬浮培养，每3d，切掉原球茎新长出的芽，接入配方为1/2MS+BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+香蕉20g/L+土豆10g/L的新增殖培养基培养，共培养4个周期，每个周期为25d，得原球茎成团；
S4原球茎分化：将原球茎成团接种在配方为香蕉20g/L+土豆10g/L的分化培养基，固态培养35d，得小苗，其中，包括全黑暗培养6d后，每天光照培养14h，黑暗培养10h；光照培养条件为光照强度1500Lux，温度26℃，黑暗培养温度为26℃；
S5壮苗生根培养：将小苗经配方为1/2MS+香蕉20g/L+土豆10g/L+活性炭10g/L的壮苗培养基，培养45d，每天光照培养14h，黑暗培养10h，得苗株，移入配方为1/2MS+香蕉20g/L+土豆10g/L+活性炭10g/L+NAA 0.2mg/L的生根培养基，生根培养85d，得生根苗，其中，包括全黑暗培养6d后，每天光照培养14h，黑暗培养10h；光照培养条件均为光照强度1500Lux，温度26℃，，黑暗培养温度均为26℃；
S6优良后代单株选择：将长至4cm，根支3条以上，根长2cm以上的生根苗移栽，淘汰嵌合体杂色花植株，保留纯色花或单色花后代。
实施例2
S1外植体选择：以石斛兰侧芽茎段为外植体，自来水冲洗干净，稀释的洗洁精浸泡10min，自来水冲洗干净，用体积浓度70％酒精浸泡60s，然后无菌水冲洗5次，在超净台上除去叶片及膜质叶鞘，转入含有1滴吐温-80的质量浓度0.1％HgCl2溶液消毒8min，无菌水冲洗5次，用无菌纱布或无菌滤纸吸干水。
S2原球茎诱导：将消毒后的侧芽接种在配方为1/2MS+BA 4mg/L+NAA0.2mg/L的诱导培养基上进行第一次固态培养，培养45d，每天光照培养14h，黑暗培养10h，光照培养条件为光照强度1500Lux，温度26℃，黑暗培养温度为26℃；当新生腋芽长至0.8cm，叶片2片后，切下新芽，剥掉叶片，去掉顶芽，取腋芽，重新接入配方为1/2MS+BA 4mg/L+NAA 0.2mg/L的新诱导培养基进行第二次固态培养，得原球茎；第二次固态培养反复培养2次，每次第二次固态培养25d，每次第二次固态培养包括全黑暗培养9d后，每天光照培养14h，黑暗培养10h；光照培养条件为光照强度1500Lux，温度26℃，黑暗培养温度均为26℃；
S3原球茎增殖：切掉原球茎的顶部芽，挑选原球茎含有5个原球茎颗粒接种至配方为1/2MS+BA 4mg/L+NAA 0.2mg/L+香蕉40g/L+土豆30g/L的增殖培养基中，26℃、100rpm液体悬浮培养，每3d，切掉原球茎新长出的芽，接入配方为1/2MS+BA 4mg/L+NAA 0.2mg/L+香蕉40g/L+土豆30g/L的新增殖培养基培养，共培养4个周期，每个周期为25d，得原球茎成团；
S4原球茎分化：将原球茎成团接种在配方为NAA0.2 mg/L+香蕉40g/L+土豆30g/L的分化培养基，固态培养35d，得小苗，其中，包括全黑暗培养6d后，每天光照培养14h，黑暗培养10h；光照培养条件为光照强度1500Lux，温度26℃，黑暗培养温度为26℃；
S5壮苗生根培养：将小苗经配方为1/2MS+香蕉40g/L+土豆30g/L+活性炭10g/L的壮苗培养基，培养45d，每天光照培养14h，黑暗培养10h，得苗株，移入配方为1/2MS+香蕉20g/L+土豆10g/L+活性炭10g/L+NAA 0.2mg/L的生根培养基，生根培养85d，得生根苗，其中，包括全黑暗培养6d后，每天光照培养14h，黑暗培养10h；光照培养条件均为光照强度1500Lux，温度26℃，，黑暗培养温度均为26℃；
S6优良后代单株选择：将长至4cm，根支3条以上，根长2cm以上的生根苗移栽，淘汰嵌合体杂色花植株，保留纯色花或单色花后代。
实施例3
S1外植体选择：以石斛兰侧芽茎段为外植体，自来水冲洗干净，稀释的洗洁精浸泡10min，自来水冲洗干净，用体积浓度70％酒精浸泡60s，然后无菌水冲洗5次，在超净台上除去叶片及膜质叶鞘，转入含有1滴吐温-80的质量浓度0.1％HgCl2溶液消毒8min，无菌水冲洗5次，用无菌纱布或无菌滤纸吸干水。
S2原球茎诱导：将消毒后的侧芽接种在配方为1/2MS+BA 3mg/L+NAA0.2mg/L的诱导培养基上进行第一次固态培养，培养45d，每天光照培养14h，黑暗培养10h，光照培养条件为光照强度1500Lux，温度26℃，黑暗培养温度为26℃；当新生腋芽长至0.8cm，叶片2片后，切下新芽，剥掉叶片，去掉顶芽，取腋芽，重新接入同配方为1/2MS+BA 3mg/L+NAA 0.2mg/L的新诱导培养基进行第二次固态培养得原球茎；第二次固态培养反复培养2次，每次第二次固态培养25d，每次第二次固态培养包括全黑暗培养9d后，每天光照培养14h，黑暗培养10h；光照培养条件为光照强度1500Lux，温度26℃，黑暗培养温度均为26℃；
S3原球茎增殖：切掉原球茎的顶部芽，挑选原球茎含有5个原球茎颗粒接种至配方为1/2MS+BA 3mg/L+NAA 0.2mg/L+香蕉30g/L+土豆20g/L的增殖培养基中，26℃、100rpm液体悬浮培养，每3d，切掉原球茎新长出的芽，接入同配方为1/2MS+BA 3mg/L+NAA 0.2mg/L+香蕉30g/L+土豆20g/L的新增殖培养基培养，共培养4个周期，每个周期为25d，得原球茎成团；
S4原球茎分化：将原球茎成团接种在配方为NAA0.1 mg/L+香蕉30g/L+土豆20g/L的分化培养基，固态培养35d，得小苗，其中，包括全黑暗培养6d后，每天光照培养14h，黑暗培养10h；光照培养条件为光照强度1500Lux，温度26℃，黑暗培养温度为26℃；
S5壮苗生根培养：将小苗经配方为1/2MS+香蕉30g/L+土豆20g/L+活性炭15g/L的壮苗培养基，培养45d，每天光照培养14h，黑暗培养10h，得苗株，移入配方为1/2MS+香蕉30g/L+土豆20g/L+活性炭15g/L+IBA 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L的生根培养基，生根培养85d，得生根苗，其中，包括全黑暗培养6d后，每天光照培养14h，黑暗培养10h；光照培养条件为光照强度1500Lux，温度26℃，黑暗培养温度均为26℃；
S6优良后代单株选择：将长至4cm，根支3条以上，根长2cm以上的生根苗移栽，淘汰嵌合体杂色花植株，保留纯色花或单色花后代。
对比例1
本对比例与实施例3的区别在于，所述的S3步骤中，增殖培养基配方为1/2MS+BA3mg/L+NAA0.2mg/L，培养基添加9g/L的卡拉胶制备成固体培养基，采用固体培养替代液体悬浮培养。
对比例2
本对比例与实施例3的区别在于，所述的S3步骤中，培养基添加9g/L的卡拉胶制备成固体培养基，采用固体培养替代液体悬浮培养。
对比例3
本对比例与实施例3的区别在于，所述的S2步骤中，当新生腋芽长至0.8cm，叶片2片后，将新生腋芽接种至配方为1/2MS+BA 3mg/L+NAA 0.2mg/L+香蕉30g/L+土豆20g/L的增殖培养基中；其余步骤同实施例3。
1、石斛花纯色花株分离测定
测定实施例1～3和对比例1～3不同培养条件对石斛兰纯色花株分离的影响，其中，增殖率＝增殖产生的原球茎数÷接种的原球茎数，纯色花分离率(％)＝纯色花植株数÷开花植株数×100％，测定结果如表1。
表1
Figure BDA0003085011160000081
经本发明提供的石斛兰纯色花的分离育种方法，实施例1～3的石斛兰纯色花分离率在60％以上，有效地从石斛兰花色嵌合体中分离得到纯色花，实现石斛兰纯色花快速、稳定、有效的分离。
对比例1在原球茎增殖阶段，采用不含香蕉和土豆的培养基，进行固态培养，纯色花的分离率仅有10.92％；对比例2在原球茎增殖阶段，采用固态培养替代液体悬浮培养，原球茎增殖率为2.30，纯色花分离率为51.69％，植物组织培养过程中，组织培养物的极性作用会促进芽的分化，降低组织培养物的增殖率，液体悬浮培养具有破坏组织培养物发育极性的作用，可以最大程度地抑制增殖培养阶段芽的分化，进而提高原球茎增殖率，进一步提高纯色花的分离率；对比例3接种至增殖培养基的是腋芽而不是原球茎，则最后产生的植株几乎全部都是杂色花植株，只有采用原球茎接种，才能分离到一定数量纯色花植株，同时，随着原球茎增殖率的提高，这种纯色花分离的有效性也在提高。
实施例4
S1外植体选择：以石斛兰侧芽茎段为外植体，自来水冲洗干净，稀释的洗洁精浸泡10min，自来水冲洗干净，用体积浓度70％酒精浸泡60s，然后无菌水冲洗5次，在超净台上除去叶片及膜质叶鞘，转入含有1滴吐温-80的质量浓度0.1％HgCl2溶液消毒10min，无菌水冲洗5次，用无菌纱布或无菌滤纸吸干水。
S2原球茎诱导：将消毒后的侧芽接种在配方为1/2MS+BA 3mg/L+NAA0.2mg/L的诱导培养基上进行第一次固态培养，培养55d，每天光照培养12h，黑暗培养12h，光照培养条件为光照强度1500Lux，温度26℃，黑暗培养温度为26℃；当新生腋芽长至1.2cm，叶片2片后，切下新芽，剥掉叶片，去掉顶芽，取腋芽，重新接入同配方为1/2MS+BA 3mg/L+NAA 0.2mg/L的新诱导培养基进行第二次固态培养，得原球茎；第二次固态培养反复培养2次，每次第二次固态培养35d，每次第二次固态培养包括全黑暗培养11d后，每天光照培养12h，黑暗培养12h；光照培养条件均为光照强度1500Lux，温度26℃，黑暗培养温度均为26℃；
S3原球茎增殖：切掉原球茎的顶部芽，挑选原球茎含有15个原球茎颗粒接种至配方为1/2MS+BA 3mg/L+NAA 0.2mg/L+香蕉30g/L+土豆20g/L的增殖培养基中，26℃、120rpm液体悬浮培养30d，每7d，切掉原球茎新长出的芽，接入同配方为1/2MS+BA 3mg/L+NAA0.2mg/L+香蕉30g/L+土豆20g/L的新增殖培养基培养，共培养5个周期，每个周期为35d，得原球茎成团；
S4原球茎分化：将原球茎成团接种在配方为NAA0.1 mg/L+香蕉30g/L+土豆20g/L的分化培养基，固态培养45d，得小苗，其中，包括全黑暗培养8d后，每天光照培养12h，黑暗培养12h；光照培养条件为光照强度1500Lux，温度26℃，黑暗培养温度为26℃；
S5壮苗生根培养：将小苗经配方为1/2MS+香蕉30g/L+土豆20g/L+活性炭15g/L的壮苗培养基，培养55d，每天光照培养12h，黑暗培养12h，得苗株，移入配方为1/2MS+香蕉30g/L+土豆20g/L+活性炭15g/L+IBA 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L的生根培养基，生根培养95d，得生根苗，其中，包括全黑暗培养8d后，每天光照培养12h，黑暗培养12h；光照培养条件为光照强度1500Lux，温度26℃，黑暗培养温度均为26℃；
S6优良后代单株选择：将长至8cm，根支4条以上，根长2cm以上的生根苗移栽，淘汰嵌合体杂色花植株，保留纯色花或单色花后代。
经试验结果表明，原球茎的增殖率为3.26，开花植株数为4592株，纯色花植株数为3297株，纯色花分离率为71.80％。
实施例5
S1外植体选择：以石斛兰侧芽茎段为外植体，自来水冲洗干净，稀释的洗洁精浸泡10min，自来水冲洗干净，用体积浓度70％酒精浸泡60s，然后无菌水冲洗5次，在超净台上除去叶片及膜质叶鞘，转入含有1滴吐温-80的质量浓度0.1％HgCl2溶液消毒10min，无菌水冲洗5次，用无菌纱布或无菌滤纸吸干水。
S2原球茎诱导：将消毒后的侧芽接种在配方为1/2MS+BA 3mg/L+NAA0.2mg/L的诱导培养基上进行第一次固态培养，培养50d，每天光照培养12h，黑暗培养12h，光照培养条件为光照强度1500Lux，温度26℃，黑暗培养温度为26℃；当新生腋芽长至1cm，叶片3片后，切下新芽，剥掉叶片，去掉顶芽，取腋芽，重新接入同配方为1/2MS+BA 3mg/L+NAA 0.2mg/L的新诱导培养基进行第二次固态培养，得原球茎；第二次固态培养反复培养3次，每次第二次固态培养30d，每次第二次固态培养包括全黑暗培养10d后，每天光照培养12h，黑暗培养12h；光照培养条件均为光照强度1500Lux，温度26℃，黑暗培养温度均为26℃；
S3原球茎增殖：切掉原球茎的顶部芽，挑选原球茎含有10个原球茎颗粒接种至配方为1/2MS+BA 3mg/L+NAA 0.2mg/L+香蕉30g/L+土豆20g/L增殖培养基中，26℃、110rpm液体悬浮培养30d，每5d，切掉原球茎新长出的芽，接入同配方为1/2MS+BA 3mg/L+NAA 0.2mg/L+香蕉30g/L+土豆20g/L的新增殖培养基培养，共培养5个周期，每个周期为30d，，得原球茎成团；
S4原球茎分化：将原球茎成团接种在配方为NAA0.1 mg/L+香蕉30g/L+土豆20g/L的分化培养基，固态培养40d，得小苗，其中，包括全黑暗培养7d后，每天光照培养12h，黑暗培养12h；光照培养条件为光照强度1500Lux，温度26℃，黑暗培养温度为26℃；
S5壮苗生根培养：将小苗经配方为1/2MS+香蕉30g/L+土豆20g/L+活性炭15g/L的壮苗培养基，培养50d，每天光照培养12h，黑暗培养12h，得苗株，移入配方为1/2MS+香蕉30g/L+土豆20g/L+活性炭15g/L+IBA 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L的生根培养基，生根培养90d，得生根苗，其中，包括全黑暗培养7d后，每天光照培养12h，黑暗培养12h；光照培养条件为光照强度1500Lux，温度26℃，黑暗培养温度均为26℃；
S6优良后代单株选择：将长至7cm，根支4条以上，根长2cm以上的生根苗移栽，淘汰嵌合体杂色花植株，保留纯色花或单色花后代。
经试验结果表明，原球茎的增殖率为增殖率3.48，开花植株数为5237株，纯色花植株数为3985株，纯色花分离率为76.09％。
对比例4
本对比例与实施例5的区别在于，所述的S3步骤中，培养基添加9g/L的卡拉胶制备成固体培养基，采用固体培养替代液体悬浮培养；每5d，直接将原球茎接入同配方为1/2MS+BA3mg/L+NAA0.2mg/L+香蕉30g/L+土豆20g/L的新增殖培养基培养，接入前未切掉原球茎新长出的芽。
经试验结果表明，原球茎的增殖率为增殖率1.62，开花植株数为1219株，纯色花植株数为482株，纯色花分离率为39.54％。
2、本发明的单一实验
(1)侧芽消毒：对石斛兰侧芽用0.1％HgCl2采用不同时间进行消毒，消毒效果如表2。
表2
Figure BDA0003085011160000111
不同消毒时间效果不同，处理时间越长，污染率越低，但褐化率(消毒死亡率)增加。最好的处理是0.1％HgCl2溶液(加1滴吐温80)消毒10min，污染率仅为6％，褐化率(消毒死亡率)为10％。
(2)原球茎诱导：原球茎诱导培养基采用1/2MS附加不同浓度组合的BA和NAA，对原球茎诱导的影响，结果如表3。
表3
Figure BDA0003085011160000121
诱导结果表明，不同组合的BA和NAA均可诱导成芽，但产芽数和产芽率不同。其中，1/2MS+BA3mg/L+NAA0.2mg/L原球茎诱导效果最好，产芽率为2.72％，几乎所有接种的侧芽都能诱导出2～3个新芽。
(3)原球茎增殖：原球茎增殖培养基采用与原球茎诱导培养基相同的激素组合(BA3mg/L+NAA0.2mg/L)，并试验有机附加物香蕉和土豆对原球茎增殖的影响，结果如表4。
表4
Figure BDA0003085011160000131
结果表明，加入香蕉利于原球茎的增殖，土豆利于原球茎的生长，产生的原球茎健壮饱满。1/2MS+BA 3mg/L+NAA 0.2mg/L+香蕉30g/L+土豆20g/L增殖效果最好，原球茎增殖较多，原球茎颗粒较大、饱满，活力非常强，增殖过程中不易分化产生小芽，原球茎和新产生的小芽为浅绿色。
(4)原球茎分化：研究不同浓度的BA对石斛兰原球茎分化的影响，结果如表5。
表5
Figure BDA0003085011160000132
结果表明，原球茎分化培养基在原球茎增殖培养基基础上，如果只保留细胞分裂素BA，则会降低原球茎分化。
(5)原球茎分化：研究不同浓度的NAA对石斛兰原球茎分化的影响，结果如表6。
表6
Figure BDA0003085011160000141
结果表明，1/2MS基本培养基附加0～0.2mg/L NAA均可分化至少1个芽出来，1/2MS+NAA 0.1mg/L分化效果最好，分化成苗率达2.24。前期试验表明，培养基附加香蕉30g/L+土豆20g/L可使原球茎变大变绿，分化成苗的原球茎增多，分化的苗株较大、较壮。因此，分化培养基采用1/2MS+NAA 0.1mg/L+30g/L+土豆20g/L，效果最佳。
(6)壮苗生根培养：当原球茎分化出小苗，经壮苗培养50d，挑苗株在2cm以上的移入生根培养基进行生根培养，试验不同组合的IBA与NAA对生根的影响，结果如表7。
表7
Figure BDA0003085011160000142
Figure BDA0003085011160000151
结果表明，1/2MS+活性炭15g/L+IBA 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L生根最好，生根率可达100％，且生根数量适中，长短适中，有利于后期移栽成活。前期试验表明，生根培养基中附加香蕉30g/L和土豆20g/L可在促进生根的同时促进壮苗，不仅更易出根，且植株叶片更厚、更宽，产生的根更粗、更壮。因此，1/2MS+香蕉30g/L+土豆20g/L+活性炭15g/L+IBA 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L生根培养效果最好。
(7)选取壮苗(株高5～8cm，4条根以上，根长约2cm以上)进行移栽，移栽成活率可达100％。
综上所述，本发明提供的石斛兰纯色花的分离育种方法，以石斛兰侧芽茎段为外植体，通过科学配制了各个培养基成分、利用原球茎增殖阶段采用液体悬浮培养和切掉原球茎新长出的芽的处理方式，控制培养光照和培养时间，实现了石斛兰花色嵌合体中纯色花的更好地稳定快速分离。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种石斛兰纯色花的分离育种方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1外植体选择：以石斛兰侧芽茎段为外植体，侧芽消毒；
S2原球茎诱导：将消毒后的侧芽接种在配方为1/2MS+BA 1～4mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L的诱导培养基上进行第一次固态培养；当新生腋芽长至0.8～1.2cm， 叶片2～3片后，切下新芽，剥掉叶片，去掉顶芽，取腋芽，重新接入同配方为1/2MS+BA 1～4mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L的新诱导培养基上进行第二次固态培养，得原球茎；
S3原球茎增殖：切掉原球茎的顶部芽，接种至配方为1/2MS+BA1～4mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+香蕉20～40g/L+土豆10～30g/L的增殖培养基中，液体悬浮培养，每3～7d，切掉原球茎新长出的芽，接入同配方为1/2MS+BA1～4mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+香蕉20～40g/L+土豆10～30g/L的新增殖培养基培养，得原球茎成团；
S4原球茎分化：将原球茎成团接种在分化培养基中固态培养，得小苗；
S5壮苗生根培养：将小苗经壮苗培养基培养，得苗株，移入生根培养基，得生根苗；
S6优良后代单株选择：将生根苗移栽，淘汰嵌合体杂色花植株，保留纯色花或单色花后代。
2.根据权利要求1所述的石斛兰纯色花的分离育种方法，其特征在于：所述的S1步骤中，侧芽消毒方法为自来水冲洗干净，稀释的洗洁精浸泡5～15min，自来水冲洗干净，用体积浓度70％酒精浸泡50～70s，然后无菌水冲洗4～6次，在超净台上除去叶片及膜质叶鞘，转入质量浓度0.1％HgCl2溶液消毒4～12min，无菌水冲洗4～6次，用无菌纱布或无菌滤纸吸干水。
3.根据权利要求2所述的石斛兰纯色花的分离育种方法，其特征在于：所述的质量浓度0.1％HgCl2溶液加入1-2滴吐温-80。
4.根据权利要求1所述的石斛兰纯色花的分离育种方法，其特征在于：所述的S2步骤中，第一次固态培养，培养45～55d，其中，每天光照培养10～14h，黑暗培养10～14h；光照培养条件为光照强度1300～1700Lux，温度24～28℃，黑暗培养温度为24～28℃。
5.根据权利要求1所述的石斛兰纯色花的分离育种方法，其特征在于：所述的S2步骤中，第二次固态培养反复培养2-3次，每次第二次固态培养25～35d；每次第二次固态培养包括全黑暗培养9～11d后，每天光照培养10～14h，黑暗培养10～14h；光照培养条件为光照强度1300～1700Lux，温度24～28℃，黑暗培养温度为24～28℃。
6.根据权利要求1所述的石斛兰纯色花的分离育种方法，其特征在于，所述的S3步骤中，挑选原球茎含有5～15个原球茎颗粒进行接种，在24～28℃、100～120rpm液体悬浮培养，共培养4～6个周期，每个周期为25～35d。
7.根据权利要求1所述的石斛兰纯色花的分离育种方法，其特征在于，所述的S4步骤中，分化培养基为1/2MS+NAA0～0.2mg/L+香蕉20～40g/L+土豆10～30g/L；固态培养，培养35～45d，其中，包括全黑暗培养6～8d后，每天光照培养10～14h，黑暗培养10～14h；光照培养条件为光照强度1300～1700Lux，温度24～28℃，黑暗培养温度为24～28℃。
8.根据权利要求1所述的石斛兰纯色花的分离育种方法，其特征在于，所述的S5步骤中，壮苗培养基为1/2MS+香蕉20～40g/L+土豆10～30g/L+活性炭10～20g/L，生根培养基为1/2MS+香蕉20～40g/L+土豆10～30g/L+活性炭10～20g/L+IBA 0～0.4mg/L+NAA 0～0.4mg/L；壮苗培养45～55d，其中，每天光照培养10～14h，黑暗培养10～14h；生根培养85～95d，其中，包括全黑暗培养6～8d后，每天光照培养10～14h，黑暗培养10～14h；光照培养条件均为光照强度1300～1700Lux，温度24～28℃，黑暗培养温度均为24～28℃。
9.根据权利要求1所述的石斛兰纯色花的分离育种方法，其特征在于，所述的S6步骤中，待生根苗长至5～8cm，根支4条以上，根长2cm以上时，开始移栽。
CN202110577971.2A 2021-05-26 2021-05-26 一种石斛兰纯色花的分离育种方法 Active CN113331053B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110577971.2A CN113331053B (zh) 2021-05-26 2021-05-26 一种石斛兰纯色花的分离育种方法
PCT/CN2021/141023 WO2022247259A1 (zh) 2021-05-26 2021-12-24 一种石斛兰纯色花的分离育种方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110577971.2A CN113331053B (zh) 2021-05-26 2021-05-26 一种石斛兰纯色花的分离育种方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113331053A CN113331053A (zh) 2021-09-03
CN113331053B true CN113331053B (zh) 2022-05-24

Family

ID=77471575

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110577971.2A Active CN113331053B (zh) 2021-05-26 2021-05-26 一种石斛兰纯色花的分离育种方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN113331053B (zh)
WO (1) WO2022247259A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113331053B (zh) * 2021-05-26 2022-05-24 海南大学 一种石斛兰纯色花的分离育种方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102119655A (zh) * 2010-07-29 2011-07-13 云南红土生源药用生物科技开发有限公司 铁皮石斛自然光快繁育苗方法
CN103598101A (zh) * 2013-12-02 2014-02-26 云南省农业科学院花卉研究所 一种兜唇石斛组培快速繁殖的方法
WO2015003408A1 (zh) * 2013-07-08 2015-01-15 中国科学院华南植物园 一种石斛兰试管内杂交育种方法
CN105613291A (zh) * 2015-12-31 2016-06-01 厦门涌泉科技有限公司 一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法
CN107926702A (zh) * 2017-11-29 2018-04-20 大连市金贵缘科技开发有限公司 一种铁皮石斛原球茎快速增殖固液混合培养方法
CN110463602A (zh) * 2018-05-09 2019-11-19 曾光俊 一种铁皮石解原球茎增殖的液体静止悬浮快速培养方法
CN113826549A (zh) * 2021-09-01 2021-12-24 海南大学 一种观赏石斛兰杂交育种方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI369179B (en) * 2008-01-08 2012-08-01 Nat Univ Kaohsiung A method for producing polyploid plants of orchids
CN100586275C (zh) * 2008-01-18 2010-02-03 中国科学院昆明植物研究所 石斛属植物的快速繁殖方法
CN113331053B (zh) * 2021-05-26 2022-05-24 海南大学 一种石斛兰纯色花的分离育种方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102119655A (zh) * 2010-07-29 2011-07-13 云南红土生源药用生物科技开发有限公司 铁皮石斛自然光快繁育苗方法
WO2015003408A1 (zh) * 2013-07-08 2015-01-15 中国科学院华南植物园 一种石斛兰试管内杂交育种方法
CN103598101A (zh) * 2013-12-02 2014-02-26 云南省农业科学院花卉研究所 一种兜唇石斛组培快速繁殖的方法
CN105613291A (zh) * 2015-12-31 2016-06-01 厦门涌泉科技有限公司 一种铁皮石斛原球茎组织培养快速繁殖的方法
CN107926702A (zh) * 2017-11-29 2018-04-20 大连市金贵缘科技开发有限公司 一种铁皮石斛原球茎快速增殖固液混合培养方法
CN110463602A (zh) * 2018-05-09 2019-11-19 曾光俊 一种铁皮石解原球茎增殖的液体静止悬浮快速培养方法
CN113826549A (zh) * 2021-09-01 2021-12-24 海南大学 一种观赏石斛兰杂交育种方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Use of coconut water and fertilizer for in vitro proliferation and plantlet production of Dendrobium ‘Gradita 31’;Budi Winarto等;《In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant》;20150505;第51卷(第3期);第303-314页 *
石斛兰高效再生体系的建立与抗冻蛋白（AFP）基因转化的研究;卢毕生;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）农业科技辑》;20051015(第06期);D048-152 *
铁皮石斛生物技术研究进展;张志勇等;《核农学报》;20140427;第28卷(第4期);第0605-0610页 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022247259A1 (zh) 2022-12-01
CN113331053A (zh) 2021-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Soneji et al. Somaclonal variation in micropropagated dormant axillary buds of pineapple (Ananas comosus L., Merr.)
CN102613076A (zh) 一种蝴蝶兰的无性繁殖方法
CN107155898A (zh) 一种铁皮石斛利用茎段薄片进行扩繁的方法
da Silva et al. Anthurium in vitro: a review
CN104429952A (zh) 一种培养结球甘蓝游离小孢子高效获得再生植株的方法
CN105145337B (zh) 一种油菜优异种质资源的培育方法
CN112335549A (zh) 一种通过组织离体培养获得落叶松再生植株的方法
CN104145814B (zh) 一种高盆樱桃（原变种）茎段组织培养获得再生植株的方法
CN109258469B (zh) 一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法
CN108353790A (zh) 一种花生高油品种的培育方法
CN113331053B (zh) 一种石斛兰纯色花的分离育种方法
CN109479718A (zh) 一种文冠果组培苗的生根方法
CN102613087A (zh) 生物组织培养繁育考来木的方法
CN105325302B (zh) 一种基于液体培养基的白芨种苗生产方法
CN102550404B (zh) 一种梅花叶片愈伤组织高效诱导方法
CN108967196B (zh) 一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法
CN105010123B (zh) 通过离体挽救培养获得草莓远缘杂种的方法及培养基
CN113475394B (zh) 一种明叶藓多倍体的培育方法
CN109874667A (zh) 一种香叶天竺葵多倍体的培育方法
KR101887221B1 (ko) 기내배양에 의한 대나무 대량증식 방법
CN104488709A (zh) 一种花叶紫娇花鳞茎组织培养的方法
JPH05276845A (ja) バレイショの育種方法及び種いもの生産方法
CN114027180A (zh) 一种文冠果多倍体的培育方法及其应用
CN113711906A (zh) 一种抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法
CN101836592B (zh) 草地羊茅花药组织培养的方法及其专用培养基

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant