CN101836592B - 草地羊茅花药组织培养的方法及其专用培养基 - Google Patents
草地羊茅花药组织培养的方法及其专用培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种草地羊茅花药组织培养的方法及其专用培养基。本发明提供的草地羊茅的分化培养基是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：激动素、NAA、碳源和凝胶剂；其中激动素的终浓度是1.5-2.5mg/L，NAA的终浓度是0.4-0.6mg/L。本发明的方法，包括将草地羊茅的花药置于愈伤组织诱导培养基上培养，得到诱导的愈伤组织；再将愈伤组织转接到本发明的分化培养基上进行分化培养，得到单倍体再生植株。本发明的分化培养基可有效地将草地羊茅的花药诱导的愈伤组织进行分化得到再生植株，本发明方法是运用雄核发育技术，获得具有纯合遗传背景的后代植株，从而提高选择效率。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养和作物育种领域，特别涉及一种草地羊茅花药组织培养的方法及其专用培养基。
背景技术
草地羊茅，学名Festuca pratensis L，又叫草甸羊茅，分布于欧亚大陆及北美温带地区，我国西北、西南地区也有分布，多年生草本。须根密集，秆直立，光滑，株高70-130cm。叶片扁平成内卷，长15-20cm，叶耳披针形，镰状弯曲，边缘具睫毛。圆锥花序紧缩或稍舒展，长10-25cm，小穗长10-15cm，含6-10花，颖披针形至卵形，长3-5mm，无毛，边缘膜质，外稃长卵形，长5-8mm，顶端无芒，子房无毛，花药长达4mm。适应的土壤范围很广，在肥沃、潮湿、富含有机质的细壤中生长最好，对肥料反应明显。pH值的适应范围是4.7-8.5，最适宜pH值为5.5-7.5。在防风固沙、水土保持、环境绿化等方面也具重要的生态和观赏价值。
在杂交育种中，由于杂种后代遗传组成高度杂合，性状不断分离，要得到一个稳定的品系往往需要多年时间，耗费大量的人力物力。
单倍体培养是用植物的组织细胞进行的育种方法，多用花药离体培养法。单倍体的产生，可通过离体诱导，植物细胞具有潜在的再生性和全能性，能发育为完整植株，故应用组织培养技术对特定组织进行离体培养，可诱导产生单倍体。方法是将一定发育阶段的花药、子房或幼胚，通过无菌操作接种在培养基上，使单倍体细胞分裂形成胚状体或愈伤组织，然后由胚状体发育成小苗或诱导愈伤组织发育为植株。因为它们的二倍数染色体是由单倍数染色体本身加倍而来的，所以都是纯系，自交后代不会发生性状分离，因此进行单倍体培养在作物品种选育上，可加快纯合速度，提高选择效率。
目前，关于草地羊茅花药培养的研究在国内并没有报道，国际上虽然有报道，但只是得到了白化苗(Rose et al.，1987)，白化苗不能成活，不能用于生产当中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于草地羊茅花药愈伤组织分化培养的专用分化培养基。
本发明提供的草地羊茅的分化培养基，是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：激动素、NAA、碳源和凝胶剂；
该分化培养基中激动素的终浓度是1.5-2.5mg/L，NAA的终浓度是0.4-0.6mg/L；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如下表1所示。
表1.MS基本培养液的溶质
在本发明分化培养基中凝胶剂可以是琼脂、卡拉胶或Gelrite等，优选是Gelrite；凝胶剂的用量以能达到培养基的硬度为基础，可适当调整其用量。本发明中凝胶剂若采用Gelrite，则其在分化培养基中的终浓度可以是2.5-2.7g/L。
分化培养基中碳源可以是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖等，优选为麦芽糖；若采用麦芽糖，则麦芽糖在分化培养基中的终浓度可以是28-32g/L。
上述分化培养基中激动素的终浓度优选是2mg/L，NAA的终浓度优选是0.5mg/L。
本发明的另一目的是提供一种生产草地羊茅单倍体再生植株的方法。该方法可以固定草地羊茅优良外源基因，提高育种效率。
本发明的生产草地羊茅单倍体再生植株的方法，包括以下步骤：
1)将草地羊茅的花药置于愈伤组织诱导培养基上培养，得到诱导的愈伤组织；
2)将步骤1)中得到的愈伤组织转接到上述分化培养基上进行分化培养，得到单倍体再生植株。
上述步骤1)中，愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养液中添加2，4-D、激动素(KT)、水解酪蛋白(CH)、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如上表1所示。
该愈伤组织诱导培养基中2，4-D、激动素、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸和丝氨酸的终浓度是如下a)或b)：
a)2，4-D为1.8-2.2mg/L，激动素为0.3-0.7mg/L，水解酪蛋白为180-220mg/L，谷氨酰胺为480-520mg/L，脯氨酸为18-22mg/L，丝氨酸为18-22mg/L；
b)2，4-D为2mg/L，激动素为0.5mg/L，水解酪蛋白为200mg/L，谷氨酰胺为500mg/L，脯氨酸为20mg/L，丝氨酸为20mg/L。
上述花药可根据草地羊茅的每一品种和同一品种的不同生长季，选取不同适龄期的花药，并通过镜检进行校正。在本发明的方法中花药可优选为单核中期或晚期的花药。单核中期或晚期的花药是指细胞核处于周边，也就是单核靠边期的花药。
采用单核中、晚期花药不仅诱导绿苗率高，且二倍体组织受到抑制不能成苗，从而保证了单倍体再生植株的产生。
为了提高花粉愈伤组织的产量，上述花药是经过低温预处理的，该低温预处理是将花药置于0-10℃下处理5-10天；优选为在4℃下处理7天。
上述生产草地羊茅单倍体再生植株的方法还包括将步骤1中的草地羊茅花药进行消毒处理，所述消毒处理是将经过低温预处理后的花药放入1g/L的升汞溶液中消毒9-11min分钟后，用蒸馏水冲洗至少一次；消毒的时间最好为10分钟。
本发明的生产草地羊茅单倍体再生植株的方法，还包括：将步骤2)中得到的单倍体再生植株接种到生根培养基中进行生根培养，得到已生根的单倍体植株。
上述生根培养基是在1/2MS基本培养液中添加碳源和凝胶剂得到的固体培养基；生根培养基中1/2MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表下2所示。
表2.1/2MS基本培养液的溶质
本发明中愈伤组织诱导培养基和生根培养基中的碳源均可为葡萄糖、麦芽糖或蔗糖等；在愈伤组织诱导培养基中碳源优选为麦芽糖，麦芽糖在愈伤组织诱导培养基中的终浓度可为90g/L；在生根培养基中碳源优选为蔗糖，蔗糖在生根培养基中的终浓度可为30g/L。
本发明中愈伤组织诱导培养基和生根培养基中的凝胶剂均可为琼脂、卡拉胶或Gelrite等，愈伤组织诱导培养基和生根培养基中凝胶剂均优选为Gelrite，Gelrite在愈伤组织诱导培养基和生根培养基中的终浓度均可为2.6g/L。
本发明的分化培养基可有效地将草地羊茅的花药诱导的愈伤组织进行分化得到再生植株，在本发明实施例1中，愈伤组织的诱导率平均为81.2％，分化培养基诱导草地羊茅愈伤组织分化的分化率平均可达38％，不定芽的分化率平均可达45.7％。
本发明方法是运用雄核发育技术，可以获得具有纯合遗传背景的后代植株(品系)，固定优良外源基因，固定属间杂种优势，创造丰富的变异类型，可以从中选择获得在育种目标上有重大突破的新品种、新品系，提高选择效率。本发明还首次完成了草地羊茅花药培养到绿苗再生的全部过程，得到的再生绿苗能够应用于生产中，缩短了育种时间，提高选择效率，从而大大提高了育种功效。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、“草地羊茅17号”单倍体植株的制备及统计观察
一、花药诱导愈伤组织的获得及其统计观察
1、花药的获得与低温预处理
取温室内正常生长的“草地羊茅17号”(种子购买于克劳沃草业有限公司)植株的单核中期的花药。
将采集到的草地羊茅穗子(内含花药)插入一个盛有自来水的三角瓶中，外罩塑料袋，携回实验室放入冰箱，4℃低温黑暗条件下保存处理7天。接着镜检校正花药的适龄期：将低温预处理之后的草地羊茅花序剥取其幼穗花序，依次从花序上、中、下三部位剥取花药，用0.1％I-KI溶液染色后镜检，细胞核处于周边即单核靠边期的花药就是单核中期的花药。
2、花药消毒处理
将上述步骤1中低温预处理后的穗子自袋内取出后，立即放入预先开机15分钟的超净工作台内，在超净工作台内剥出穗子，按序号放入50ml的大试管中，随即注入1g/L的升汞溶液消毒10分钟，然后用无菌水冲洗3次。
3、花药诱导愈伤组织的获得
将上述步骤2中消毒后的穗子放入无菌培养皿内，用无菌不锈钢镊子将花药从颖壳内取出，平放入装有愈伤组织诱导培养基的无菌培养皿内，用双层封口膜封闭，放于25℃恒温培养箱中暗培养，30-40天，得到愈伤组织，之后可每28天继代到相同培养基上(即愈伤组织诱导培养基)。
本实施例采用直径为9厘米培养皿，该培养皿内可接种约25枚花药。
上述愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养液中添加2，4-D、激动素(KT)、水解酪蛋白(CH)、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、麦芽糖和凝胶剂得到的固体培养基；其中2，4-D的终浓度为2mg/L，激动素的终浓度为0.5mg/L，水解酪蛋白的终浓度为200mg/L，谷氨酰胺的终浓度为500mg/L，脯氨酸的终浓度为20mg/L，丝氨酸的终浓度为20mg/L，麦芽糖的终浓度为90g/L；凝胶剂为Gelrite，Gelrite的终浓度为2.6g/L；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示，培养基的pH为5.8。
4、愈伤组织的统计观察
上述步骤3中接种的花药培养4-6周之后，可以观察到愈伤组织分化。实验重复3次，培养35天时进行统计观察上述步骤3中愈伤组织的诱导情况，实验结果见下表3，三次重复愈伤组织的诱导率分别为86.4％、77.4％和79.8％。
表3.愈伤组织的诱导率
二、单倍体再生植株的获得及统计观察
1、单倍体再生植株的获得
将上述步骤一中步骤3培养6-8周后的愈伤组织转接到分化培养基上进行分化培养，分化培养期间的温度为24-25℃，并保持16小时25-30μmol/m2·s的光照，分化培养30-50天后得到单倍体再生植株。
上述分化培养基是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：激动素、NAA、碳源和凝胶剂；其中激动素的终浓度是2mg/L，NAA的终浓度是0.5mg/L，碳源是麦芽糖，麦芽糖的终浓度是30g/L，凝胶剂是Gelrite，Gelrite的终浓度为2.6g/L；MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示，培养基的pH为5.8。
2、统计观察
实验重复3次，统计观察上述步骤二中步骤1的愈伤组织的分化情况，培养50天时进行统计，实验结果见下表4，从表4可以看出，愈伤组织的分化率平均可达到38％，不定芽的分化率平均可达45.7％。
表4.再生分化培养的分化率
三、生根培养与统计观察
1、生根培养
将上述步骤二中步骤1得到的长出2-3片真叶的幼苗，转接入含有生根培养基的三角瓶中，在22℃-25℃，光照强度为25-30μmol/m2·s，光照时间为16小时下培养诱导生根，培养约10-15天，得到已生根的单倍体再生植株。
上述生根培养基是在1/2MS基本培养液中添加蔗糖和凝胶剂得到的固体培养基；其中蔗糖的终浓度为30g/L；凝胶剂是Gelrite，Gelrite的终浓度为2.6g/L；1/2MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表2所示，生根培养基的pH为5.8。
2、生根情况的统计观察
实验重复3次，统计观察上述步骤三中步骤1的生根培养情况，实验结果见下表5，从表5可以看出：生根率达平均为92％，每株单倍体植株平均生根4.3根。
表5.生根培养的生根率
四、炼苗移栽及检测分析
1、炼苗移栽
将上述步骤三中步骤1生根良好的试管苗(即再生植株)在自然条件下炼苗7天，然后洗净琼脂，移栽于苗床上生长。移栽的成活率为95％。
2、检测分析
将上述步骤四中步骤1的再生植株生长到处于分蘖盛期时，用流式细胞仪方法确定再生植株的倍性。
采用流式细胞仪测定植株倍性步骤如下：
用流式细胞仪进行倍性分析时，常用DNA的绝对含量或相对含量来进行分析。通常用已知细胞核DNA含量的鸡血红细胞核作测量标准。也可以用DNA的相对含量进行比较分析，在测量待分析样品时，选择一个已知倍性的同类材料作对照，所有待检测的样品均与其作比较，即可换算出待检样品的DNA相对含量，并对其进行倍性分析。
1)取植物幼叶，用清水清洗，将1cm×1cm洗净的新叶置于塑料培养皿中，加入0.5ml裂解液，用双面刀将叶片切碎；
2)将切好的样品经350目尼龙筛网过滤到离心管中；对所得滤液1000r/min的条件下离心5min；
3)去上清，在准备用流式细胞仪检测样品时，再向样品中加入200μl PI染料，测试前置于低温(4℃)染色2h；
4)进行流式细胞仪检测并通过与之连接的电脑软件BD FACS Calibur SoftwarePackage分析检测结果。
倍性检测的实验结果表明，在随机检测的50株个体中，32株(64％)为二倍体植株，14株(28％)为单倍体植株，4株(8％)为非整倍体植株。
实施例2、草地羊茅1号单倍体植株的制备及统计观察
本实施例与实施例1的区别在于采用的外植体-花药为草地羊茅1号(羊茅种子购买于克劳沃草业有限公司)植株的单核晚期的花药，其余步骤与实施例1的一致。
本实施例的实验统计观察结果如下：
一、花药诱导愈伤组织统计观察
实验结果见下表6，愈伤组织的诱导率平均可达77.3％。
表6.愈伤组织的诱导率
二、再生分化培养的分化率
实验结果见下表7，从表7可以看出，愈伤组织的分化率平均可达34％，不定芽的分化率平均可达41％。
表7.再生分化培养的分化率
三、生根培养的生根率
实验结果见下表8，从表8可以看出：三次重复的生根率94％、84％和92％，每株单倍体植株平均生根4.0根。
表8.生根培养的生根率
四、炼苗移栽后的检测分析
采用流式细胞仪检测的实验结果表明：在随机检测的50株个体中，30株(60％)为二倍体植株，16株(32％)为单倍体植株，4株(8％)为非整倍体植株。
Claims (11)
1.一种草地羊茅的分化培养基，是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：激动素、NAA、碳源和凝胶剂；
所述分化培养基中激动素的终浓度是1.5-2.5mg/L，NAA的终浓度是0.4-0.6mg/L；
所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质是如下终浓度的物质：1650mg/L的NH4NO3、1900mg/L的KNO3、170mg/L的KH2PO4、370mg/L的MgSO4·7H2O、330mg/L的CaCl2、22.3mg/L的MnSO4·4H2O、8.6mg/L的ZnSO4·7H2O、6.2mg/L的H3BO3、0.83mg/L的KI、0.25mg/L的Na2MoO4·2H2O、0.025mg/L的CuSO4·5H2O、0.025mg/L的CoCl2·6H2O、27.8mg/L的FeSO4·4H2O、37.3mg/L的Na2EDTA、2.0mg/L的甘氨酸、0.4mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的盐酸吡哆素、0.5mg/L的烟酸以及100mg/L的肌醇。
2.根据权利要求1所述的分化培养基，其特征在于：所述凝胶剂是琼脂、卡拉胶或Gelrite；所述凝胶剂在所述分化培养基中的终浓度是2.5-2.7g/L；
所述碳源是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖；所述麦芽糖在所述分化培养基中的终浓度是28-32g/L。
3.根据权利要求1或2所述的分化培养基，其特征在于：所述分化培养基中激动素的终浓度是2mg/L，NAA的终浓度是0.5mg/L。
4.一种生产草地羊茅单倍体再生植株的方法，包括以下步骤：
1)将草地羊茅的花药置于愈伤组织诱导培养基上培养，得到诱导的愈伤组织；
2)将步骤1)中得到的愈伤组织转接到权利要求1-3中任一所述的分化培养基上进行分化培养，得到单倍体再生植株；所述愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养液中添加2，4-D、激动素、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；
所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质是如下终浓度的物质：1650mg/L的NH4NO3、1900mg/L的KNO3、170mg/L的KH2PO4、370mg/L的MgSO4·7H2O、330mg/L的CaCl2、22.3mg/L的MnSO4·4H2O、8.6mg/L的ZnSO4·7H2O、6.2mg/L的H3BO3、0.83mg/L的KI、0.25mg/L的Na2MoO4·2H2O、0.025mg/L的CuSO4·5H2O、0.025mg/L的CoCl2·6H2O、27.8mg/L的FeSO4·4H2O、37.3mg/L的Na2EDTA、2.0mg/L的甘氨酸、0.4mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的盐酸吡哆素、0.5mg/L的烟酸以及100mg/L的肌醇；
所述愈伤组织诱导培养基中2，4-D、激动素、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸和丝氨酸的终浓度分别是：2，4-D为1.8-2.2mg/L，激动素为0.3-0.7mg/L，水解酪蛋白为180-220mg/L，谷氨酰胺为480-520mg/L，脯氨酸为18-22mg/L，丝氨酸为18-22mg/L。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述愈伤组织诱导培养基中2，4-D、激动素、水解酪蛋白、谷氨酰胺、脯氨酸和丝氨酸的终浓度分别是：2，4-D为2mg/L，激动素为0.5mg/L，水解酪蛋白为200mg/L，谷氨酰胺为500mg/L，脯氨酸为20mg/L，丝氨酸为20mg/L。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述花药为单核中期或晚期的花药。
7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述花药是经过低温预处理的，所述低温预处理是将花药置于0-10℃下处理5-10天。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述低温预处理是将花药在4℃下处理7天。
9.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述生产草地羊茅单倍体再生植株的方法还包括：将步骤2)中得到的单倍体再生植株接种到生根培养基中进行生根培养，得到已生根的单倍体植株。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述生根培养基是在1/2MS基本培养液中添加碳源和凝胶剂得到的固体培养基；
所述1/2MS基本培养液的溶剂是水、溶质是如下终浓度的物质：825mg/L的NH4NO3、950mg/L的KNO3、85mg/L的KH2PO4、185mg/L的MgSO4·7H2O、165mg/L的CaCl2、22.3mg/L的MnSO4·4H2O、8.6mg/L的ZnSO4·7H2O、6.2mg/L的H3BO3、0.83mg/L的KI、0.25mg/L的Na2MoO4·2H2O、0.025mg/L的CuSO4·5H2O、0.025mg/L的CoCl2·6H2O、27.8mg/L的FeSO4·4H2O、37.3mg/L的Na2EDTA、2.0mg/L的甘氨酸、0.4mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的盐酸吡哆素以及0.5mg/L的烟酸。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述愈伤组织诱导培养基和生根培养基中的碳源均为葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，所述麦芽糖在所述愈伤组织诱导培养基中的终浓度为90g/L；所述蔗糖在生根培养基中的终浓度为30g/L；
所述愈伤组织诱导培养基和生根培养基中的凝胶剂均为琼脂、卡拉胶或Gelrite，Gelrite在愈伤组织诱导培养基和生根培养基中的终浓度均为2.6g/L。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Guo Yangdong Inventor after: Zhao Bing Inventor after: Li Wei Inventor after: Zheng He Inventor before: Guo Yangdong Inventor before: Zhao Bing Inventor before: Li Wei |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: GUO YANGDONG ZHAO BING LI WEI TO: GUO YANGDONG ZHAO BING LI WEI ZHENG HE |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120118 Termination date: 20130603 |