CN102165918B - 粗皮桉组培再生的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于桉树组培再生方法，特别是关于粗皮桉无菌苗下胚轴为外植体进行组培再生的方法。以粗皮桉无菌实生苗下胚轴为外植体诱导愈伤组织，经不定芽诱导、芽增殖、不定芽伸长、生根及移栽，得到再生植株。本发明特点是以粗皮桉无性系种子萌发的幼苗下胚轴为外植体经愈伤组织培养、不定芽诱导、不定芽伸长、芽增殖以及生根培养、移栽，可以得到完整的再生植株。采用本发明的方法可得到再生植株，结果稳定，重复性良好，能应用于生产上大规模商品化育苗，也为粗皮桉转基因育种奠定了基础。

Description

粗皮桉组培再生的方法

技术领域

本发明属于桉树组培再生技术，特别是关于粗皮桉的组培再生的方法。

技术背景

桉树原产澳大利亚，是桃金娘科(Myrtaceae)桉树属(Eucalyptus)植物的统称，有1039个种、亚种和变种。由于桉树生长速度快、轮伐期短、耐干旱、耐瘦瘠、适应性广，且用途广泛，经济效益高，现已被世界近百个国家与地区引种，遍布于地中海地区、东南亚、美洲和非洲，目前已成为世界公认的三大人工林树种之一。根据FAO统计，桉树人工林占世界人工林总面积的10％。近年来，在亚洲、中南美洲和非洲的热带地区，桉树人工林占造林面积70％以上。据统计，全世界桉树人工林面积超过2000万hm²。我国引种桉树已有120年历史，在17个省(区)种植，每年新营造桉树林达10万hm²，到2010年，中国桉树人工林面积达到313万hm²，占全国人工林面积的5％左右，年生产木材近4000万立方，占国内自主生产纸浆材的50％以上，每年带来的经济效益多达几千个亿。据研究，每生产一公斤干物质，桉树消耗785升，而松树则消耗1538升，桉树单位收获量消耗水分是松树的51％，且年蒸腾量只占降水量的1/3。因此，桉树对涵养水源，改善环境方面发挥着重要的生态效益和社会效益。

随着桉树大面积种植和新品种的引入，桉树的病害流行也愈加严重，成为桉树人工林发展的重大障碍。我国桉树病害已发现33种，包括苗期病害、叶部病害、根部病害和枝干病害4大类，其中青枯病、焦枯病、灰霉病、茎腐病等细菌型和真菌型病害最为严重。其中，青枯病在流行区域，发病率达到20％～40％，而重病区则高达90％以上，每年我国实际发病面积已近40万hm²。随着林浆纸一体化进程的深入发展，华南地区对优良纸浆用材的桉树需求量将不断增大，因此，培育抗病的桉树品系，扩大栽培面积，具有巨大的社会效益和经济效益。

桉树生长周期长，而且遗传性高度杂合，应用常规的育种方法育种周期长，利用基因工程手段可打破种间杂交不亲和的界限。利用基因工程进得桉树转基因育种的前提是建立桉树组织培养再生系统与遗传转化的受体系统。从20世纪60年代以来，植物细胞的全能性，在理论上和实践上都得到了充分的论证，植物组织培养进入了迅速发展时期，桉树某些品种的组织培养也于20世纪60年代逐渐开始。迄今为止，已有60多种桉树的组织培养获得成功，绝大部分是国外首先取得成功。Hatney用简单的培养基在普通家用冰箱中保存钝盖赤桉(E.camaldulensis)和巨桉(E.grandis)裸芽培养物达8个月之久；Bachelard和Stowe用一种含14％椰子汁的液体培养基保存实生苗的根系，根冠部分可以接种在同种培养基上，但没有芽的再生；Sussex由赤桉(E.camaldulenses)实生苗外植体获得了愈伤组织；Aneja等由柠檬桉(E.citriodora)木质块茎的愈伤组织诱导出小植株；Kitahara等人从白桉(E.alba)的下胚轴培养产生愈伤组织并分化形成了小植株；De Fossard等人从榕叶桉(E.ficifolia)的茎节离体培养，能繁育大量苗木；LakshmiSits发现，从柠檬桉子叶愈伤组织诱导再生芽的条件为：0.2mg/L IAA和1mg/L ZT以及光周期12h的荧光灯光照，这些芽能在只含有生长素的培养基上形成根；P.K.Gupta等人用组织培养法无性繁殖柠檬桉，并于1981年用成年柠檬桉树嫩枝茎段诱导出了完整植株；S.Kondas将一棵20年生的桉树成功培养出芽；Adam将冈尼桉(E.gunnii)的离体根培养在不含激素的MS固体培养基上，但没有分化成芽；Qin和Kirby用葡萄桉(E.botryoides)、邓恩桉(E.dunnii)、巨桉(E.grandis)和野桉(E.rudis)幼苗的子叶、下胚轴以及成年巨桉(E.grandis)优良无性系的幼叶为材料诱导出类似胚状体的结构。此后更有不少相关报道，E.tereticornis、E.grandis、E.Urophylla、E.Globulus、E.grandis×E.uropHylla等树种已能经器官发生途径再生。E.Citriodora、E.Grandis和E.dunnii等树种已能经体细胞胚胎发生途径再生。

20世纪80年代初欧阳权首次对桉树胚状体的发生进行了研究，此后，桉树组织培养的研究工作全面展开，首先在雷林1号桉(E.leichow No.1)、巨尾桉(E.grandis×E.urophylla)等树种首先取得成功。谢丽萍等用四个产地柳窿桉(E.saligna×E.exserta)优良无性系的基部萌条嫩茎为外植体进行了组织培养研究，并获得了再生植株。韩美丽等以雷林一号桉及尾叶桉为材料建立了原生质体分离体系；同年，又报道了以尾叶桉、柳窿桉的胚性愈伤组织为亲本材料，采用PEG(聚乙二醇)融合法研究了影响原生质体融合的主要影响因素。2003年，蔡燕灵等用二次回归旋转设计对桉树DH3329和E3两个无性系进行组培试验，研究了其继代培养芽的叶片增大与培养基中细胞分裂素6-BA和生长素NAA浓度的关系。石大兴等研究了以巨桉(Eucalyptusgrandis)幼树带芽茎段为外植体诱导丛生芽发生以及植株再生的过程，对培养过程中新芽及丛生芽的发生类型进行了探讨，通过正交实验及单因素试验，确定了巨桉快繁体系的最适培养条件。随后，卜朝阳通过试验，获得了桉树四种再生系统。关亚丽等以无菌苗叶片为外植体进行了赤桉不定芽的诱导及植株再生。易敏等以邓恩桉无菌苗的下胚轴和半木质化的带芽茎段为外植体，诱导芽的分化及丛生芽产生，对培养基中不同生长素和细胞分裂素的浓度和配比进行了讨论，确定了邓恩桉组织培养最适培养条件。邱璐等研究了史密斯桉愈伤组织的诱导及分化，并取得了一定的结果。王以红等将邓恩桉种子在无菌环境下萌动，切割其下胚轴进行离体培养，建立不定芽发生和植株再生的微繁殖体系。刘奕清等以尾细桉M1的单芽茎段为外殖体进行离体培养和快速繁殖研究，建立了尾细桉M1离体再生体系。邱璐等对史密斯桉愈伤组织的诱导及分化进行了较为深入的研究，优化了史密斯桉愈伤组织诱导及分化系统为其无性繁殖和转基因研究奠定了基础。

综上所述，目前国内外还未见有用粗皮桉种子无菌苗下胚轴为外植体进行组织培养再生获得成功的例子。

发明内容

本发明的目的是为了弥补现有技术存在的不足，提供一种要得到再生植株，结果稳定，重复性良好的粗皮桉组培再生的方法。

为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案是：该粗皮桉组培再生的方法是采用粗皮桉无性系种子萌发的无菌苗下胚轴为外植体诱导愈伤组织，经不定芽诱导、芽增殖、不定芽伸长、生根及移栽，得到再生植株；该方法按以下步骤：

(1)选取成熟的粗皮桉种子，经50～55℃温水浸泡后自然冷却，用浓度为70％乙醇消毒50秒，无菌水冲洗2次，加入体积比为15％次氯酸钠，相对氯为3.75％，采用二次消毒法，消毒时间为9+9分钟，无菌水冲洗5～6次，播种到不加激素的1/2MS培养基上，25±2℃暗培养7天后，在光照12小时/天、光照强度2000～2500lx条件下培养5～7天，得到实生无菌苗；

(2)下胚轴切成0.5～0.8cm长的小段，接种在愈伤诱导培养基上，暗培养6～14天后，在温度25±2℃、光照12h·d^-1、光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周；

(3)经愈伤诱导培养基上培养的下胚轴转入不定芽诱导培养基上，在25±2℃、光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周；

(4)经不定芽诱导培养基培养的下胚轴转入芽增殖培养基上，在25±2℃、光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周；

(5)经芽增殖培养基培养的下胚轴转入不定芽伸长培养基上，在25±2℃、光照强度2000～2500lx条件下培养，促进芽伸长；

(6)当芽伸长到3～4cm并有3～4个节时，将不定芽转入生根培养基上培养，以促其生根；

(7)生根良好的生根苗从恒温光照培养箱移至室外自然环境中炼苗10～15天，移栽至灭菌的黄心土与腐殖质土中生长，黄心土与腐殖土的比例为2∶1，得到再生植株。

所述粗皮按诱导愈伤组织采用下胚轴为外植体，下胚轴是指实生无菌苗苗龄为12～14天的下胚轴。

所述不加激素的1/2MS(Murashige and Skoog)培养基为：大量元素为MS的一半，其它不变，添加0.7％琼脂、3％蔗糖，pH为5.8～6.0。

所述愈伤诱导培养基为：MS+N-取代苯基N′-(6-苯并噻唑基)脲类化合物(LC)2.0mg/L+吲哚乙酸(IAA)0.05mg/L+维生素C(Vc)100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～6.0。

所述不定芽诱导培养基为：MS+N⁶苄基腺嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.05mg/L+腐胺500μmol/L+亚精胺50μmol/L+维生素C(Vc)100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9。

所述芽增殖培养基为：1/2MS+6-BA 0.5mg/L+萘乙酸(NAA)0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9。

所述不定芽伸长培养基为：1/2MS+萘乙酸(NAA)0.05mg/L+N-取代苯基N′-(6-苯并噻唑基)脲类化合物(LC)0.8mg/L+维生素C(Vc)100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9。

所述生根培养基为：1/2MS+吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9。

本发明特点是以粗皮桉无性系种子萌发的幼苗下胚轴为外植体经愈伤组织培养、不定芽诱导、不定芽伸长、芽增殖以及生根培养、移栽，可以得到完整的再生植株。采用本发明的方法可得到再生植株，结果稳定，重复性良好，能应用于生产上大规模商品化育苗，也为粗皮桉转基因育种奠定了基础。

具体实施方式

本发明采用粗皮桉无菌苗下胚轴为外植体进行组培再生的具体方法如下：

选择成熟较大的粗皮桉种子，50～55℃温水浸泡后自然冷却，4～6天后在超净工作台上用无菌水冲洗2次，用浓度为70％乙醇灭菌50秒，无菌水冲洗2次后，加入15％(体积比)NaClO(相对氯为3.75％)，采用二次消毒法，消毒时间为9+9分钟，无菌水冲洗5～6次后接种到不加激素的1/2MS(Murashige and Skoog)培养基(添加0.7％琼脂、3％蔗糖，pH 5.8～6.0)上。培养温度为25±2℃，光照12小时/天(h·d^-1)，光照强度为2000～2500lx。

当种子萌发成长约3～5cm，仅含1对子叶的幼苗时，去掉顶芽与根部，将下胚轴切成0.5～0.8cm长的小段，将此接种于愈伤诱导培养基(MS+LC2mg/L+IAA 0.05mg/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)，暗培养6d。培养温度25±2℃。后转入光照12h·d^-1，光照强度为2000～500lx，温度25±2℃条件培养2-3周。

愈伤培养后，将外植体转移到不定芽诱导培养基(MS+6-BA 1mg/L+NAA0.05mg/L+腐胺500μmol/L+亚精胺50μmol/L+Vc 100mg/L+Kan 45mg/L+Cef 200mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)上，在25±2℃、光照强度2000～2500lx条件下，培养2～3周。

不定芽诱导培养2～3周后，外植体转移到芽增殖培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+Kan 45mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)上，在25±2℃、光照12h·d^-1、光照强度2000～2500lx条件下，培养2～3周。

将芽增殖培养得到的芽丛切成单株，转移到芽伸长培养基(1/2MS+NAA0.05mg/L+LC 0.8mg/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8～5.9)上，在25±2℃、光照12h·d^-1、光照强度2000～2500lx条件下，培养2～3周。

将3～5cm高的无菌苗转入生根培养基(1/2MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)上，在25±2℃、光照12h·d^-1、光照强度2000～2500lx条件下，培养2～3周。

将生根良好的幼苗从恒温光照培养箱移至室外自然环境中炼苗10～15d，移栽到灭菌的黄心土与腐殖质土(2∶1)上生长，得到粗皮桉的再生植株。

实施案例

选择1g成熟饱满的粗皮桉种子，50～55℃温水浸泡后自然冷却4～6天，在超净工作台上用无菌水冲洗2次，用浓度为70％乙醇灭菌50秒，无菌水冲洗2次后，加入15％(体积比)NaClO(相对氯为3.75％)溶液，采用二次消毒法，消毒时间为9+9min，无菌水冲洗5～6次，接种到不加激素的灭菌1/2MS培养基(附加0.7％琼脂、3％蔗糖，pH为5.8～6.0)。25℃暗培养7天后，转入温度为25±2℃、光照12h·d^-1、光照强度为2000～2500lx条件下培养6天，即为13天苗龄的粗皮桉无菌实生苗。

取13天苗龄(仅含1对子叶)的幼苗，去掉项芽与根部，将下胚轴切成0.5～0.8cm长的小段，将此接种于愈伤诱导培养基(MS+LC 2mg/L+IAA 0.05mg/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)上，在25±2℃下暗培养14天，90mm培养皿中放入30个外植体，用封口膜封口)后转到光下培养，培养条件为：温度25±2℃，光照12h·d^-1，光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周。

经愈伤诱导培养后，将外植体转移到不定芽诱导培养基(MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.05mg/L+腐胺500μmol/L+亚精胺50μmol/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)上，在25±2℃、光照12h·d^-1、光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周，在外植体膨大的黄绿色愈伤处长出数个不定芽。

将不定芽转移到芽增殖培养基(1/2MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)中，在25±2℃、光照12h·d^-1、光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周(每个150mL锥形瓶中放入1～4个不定芽)。

从芽增殖培养基得到的芽丛切成单株，转移到芽伸长培养基(1/2MS+NAA0.05mg/L+LC 0.8mg/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8～5.9)上，在25±2℃、光照12h·d^-1、光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周(每个150mL锥形瓶中放入1～4个单株)。

将3～5cm高的无菌苗转入生根培养基(1/2MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)中，在25±2℃、光照12h·d^-1、光照强度2000～2500lx条件下培养(每个150mL锥形瓶中放入1～4个单株)。

将生根良好的幼苗从恒温光照培养箱移至室外，打开瓶盖，在自然环境中炼苗10～15天，从瓶中小心取出完整植株，放入装有无菌水的烧杯中洗净根部培养基，将生根苗移栽在盛有用灭菌黄心土与腐殖质土(2∶1)基质的塑料盆内，立即给花盆套上塑料袋，边缘用橡皮筋扎紧，保持湿度。把花盆放在光照适宜的地方，可得到完整的粗皮桉再生植株。

Claims (2)

1.一种粗皮桉组培再生的方法，其特征在于：采用粗皮桉无性系种子萌发的无菌苗下胚轴为外植体诱导愈伤组织，经不定芽诱导、芽增殖、不定芽伸长、生根及移栽，得到再生植株；

具体方法按以下步骤：

(1)选取成熟的粗皮桉种子，经50～55℃温水浸泡后自然冷却，用浓度为70％乙醇消毒50秒，无菌水冲洗2次，。加入体积比为15％次氯酸钠，相对氯为3.75％，采用二次消毒法，消毒时间为9+9分钟，无菌水冲洗5～6次，播种到不加激素的1/2MS培养基上，25±2℃暗培养7天后，在光照12小时/天、光照强度2000～2500lx条件下培养5～7天，得到实生无菌苗；

(2)下胚轴切成0.5～0.8cm长的小段，接种在愈伤诱导培养基上，暗培养6～14天后，在温度25±2℃、光照12小时/天、光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周；

(3)经愈伤诱导培养基上培养的下胚轴转入不定芽诱导培养基上，在25±2℃、光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周；

(4)经不定芽诱导培养基培养的下胚轴转入芽增殖培养基上，在25±2℃、光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周；

(5)经芽增殖培养基培养的下胚轴转入不定芽伸长培养基上，在25±2℃、光照强度2000～2500lx条件下培养，促进芽伸长；

(6)当芽伸长到3～4cm并有3～4个节时，将不定芽转入生根培养基上培养，以促其生根；

(7)生根良好的生根苗从恒温光照培养箱移至室外自然环境中炼苗10～15天，移栽至灭菌的黄心土与腐殖质土中生长，黄心土与腐殖土的比例为2∶1，得到再生植株；

所述不加激素的1/2MS培养基为：大量元素为MS的一半，其它不变，添加0.7％琼脂、3％蔗糖，pH为5.8～6.0；

所述愈伤诱导培养基为：MS+N-取代苯基N′-(6-苯并噻唑基)脲类化合物2.0mg/L+吲哚乙酸0.05mg/L+维生素C100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8～6.0；

所述不定芽诱导培养基为：MS+6-BA 1mg/L+萘乙酸0.05mg/L+腐胺500μmol/L+亚精胺50μmol/L+维生素C100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9；

所述芽增殖培养基为：1/2MS+6-BA 0.5mg/L+萘乙酸0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9；

所述不定芽伸长培养基为：1/2MS+萘乙酸0.05mg/L+N-取代苯基N′-(6-苯并噻唑基)脲类化合物0.8mg/L+维生素C 100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8～5.9；

所述生根培养基为：1/2MS+吲哚丁酸0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8～5.9。

2.根据权利要求1所述粗皮桉组培再生的方法，其特征在于：粗皮桉诱导愈伤组织采用下胚轴为外植体，下胚轴是指实生无菌苗苗龄为12～14天的下胚轴。