CN102168105A - 尾叶桉遗传转化与再生的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于一种桉树遗传转化与再生方法，特别是关于利用尾叶桉无菌苗下胚轴为外植体进行遗传转化和再生的方法。以尾叶桉幼苗下胚轴为外植体经预培养诱导愈伤组织，与携带外源基因的农杆菌共培养转化，用卡那素进行选择，经不定芽诱导、芽增殖、不定芽伸长、生根及移栽，得到拟转化植株。本方法获得的尾叶桉拟转化植株，经PCR和RT-PCR检测表明，外源基因导入了尾叶桉基因组中，并得到表达；在转萝卜抗真菌蛋白(RS-AFP2)基因的尾叶桉离体叶片的抗病性检测中发现，转化植株对疫霉菌具有较好的抗性；抗性相关酶活测定结果显示，转化植株在接种后，苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)活性增强。

Description

尾叶桉遗传转化与再生的方法

技术领域

本发明属于桉树遗传转化与再生方法，特别是关于尾叶桉的遗传转化与再生。

背景技术

桉树(Eucalyptus)属桃金娘科(Mytacea)，桉属(Eucalyptus)，原产于澳大利，现有1000多个种及亚种。桉树具有许多显著的特点：①材质坚硬，材、皮、叶、花的经济价值都很高，既是用材林、经济林、防护林、风景林，又是很好的能源树种；②繁殖容易，速生丰产，特别是幼林期生长快，大大缩短了生产周期，能获得更高的经济效益；③种类多，抗逆性强，既有耐热树种，也有耐寒树种，病虫害少，较耐瘦瘠，可在不同气候带栽植。桉树的木材是造纸、造船的良材，叶子可提油料，树皮可提树脂，残渣培养食用菌后还可当肥料，花是良好的蜜源。正因桉树有上述用途，加之生态适应性广、速生、抗逆性强、用途广泛等优点，已被世界热带、亚热带地区广泛引种栽培。目前全世界有100多个国家种植桉树，种植面积超过2000万公顷，桉树已经成为短周期原料林的主要树种。

我国最早引种是1890年，零星引种在城市公园，铁路边等四旁绿化场地。真正大规模系统地开展引种和推广栽培始于20世纪50年代的雷州半岛。80年代初，澳大利亚援助中国在广西东门林场开展桉树系统引种和育种实验，引进了174个桉树品系和种源，建立了树木园和桉树良种基因库。现在，桉树已经成为我国南方地区发展速生丰产林的战略树种。目前桉树广泛栽种于我国从东海之滨到云贵高原的广大地区。据不完全统计，我国现有桉树人工林总面积达到200万公顷，并正以每年10万公顷的速度增长。

桉树生长周期长，而且遗传性高度杂合，应用常规的育种方法育种周期长，利用基因工程手段可打破种间杂交不亲和的界限。利用基因工程进得桉树转基因育种的前提是建立桉树组织培养再生系统与遗传转化的受体系统。从20世纪60年代以来，植物细胞的全能性，在理论上和实践上都得到了充分的论证，植物组织培养进入了迅速发展时期，桉树某些品种的组织培养也于20世纪60年代逐渐开始。迄今为止，已有60多种桉树的组织培养获得成功，绝大部分是国外首先取得成功。Hatney用简单的培养基在普通家用冰箱中保存钝盖赤桉(E.camaldulensis)和巨桉(E.grandis)裸芽培养物达8个月之久；Bachelard和Stowe用一种含14％椰子汁的液体培养基保存实生苗的根系，根冠部分可以接种在同种培养基上，但没有芽的再生；Sussex由赤桉(E.camaldulenses)实生苗外植体获得了愈伤组织；Aneja等由柠檬桉(E.citriodora)木质块茎的愈伤组织诱导出小植株；Kitahara等人从白桉(E.alba)的下胚轴培养产生愈伤组织并分化形成了小植株；De Fossard等人从榕叶桉(E.ficifolia)的茎节离体培养，能繁育大量苗木；LakshmiSita发现，从柠檬桉子叶愈伤组织诱导再生芽的条件为：0.2mg/L IAA和1mg/L ZT以及光周期12小时的荧光灯光照，这些芽能在只含有生长素的培养基上形成根；P.K.Gupta等人用组织培养法无性繁殖柠檬桉，并于1981年用成年柠檬桉树嫩枝茎段诱导出了完整植株；S.Kondas将一棵20年生的桉树成功培养出芽；Adam将冈尼桉(E.gunnii)的离体根培养在不含激素的MS固体培养基上，但没有分化成芽；Qin和Kirby用葡萄桉(E.botryoides)、邓恩桉(E.dunnii)、巨桉(E.grandis)和野桉(E.rudis)幼苗的子叶、下胚轴以及成年巨桉(E.grandis)优良无性系的幼叶为材料诱导出类似胚状体的结构。此后更有不少相关报道，E.tereticornis、E.grandis、E.Urophylla、E.Globulus、E.grandis×E.uropHylla等树种已能经器官发生途径再生。E.Citriodora、E.Grandis和E.dunnii等树种已能经体细胞胚胎发生途径再生。

20世纪80年代初欧阳权首次对桉树胚状体的发生进行了研究，此后，桉树组织培养的研究工作全面展开，首先在雷林1号桉(E.leichow No.1)、巨尾桉(E.grandis×E.urophylla)等树种首先取得成功。谢丽萍等用四个产地柳窿桉(E.saligna×exserta)优良无性系的基部萌条嫩茎为外植体进行了组织培养研究，并获得了再生植株。韩美丽等以雷林一号桉及尾叶桉为材料建立了原生质体分离体系；同年，又报道了以尾叶桉、柳窿桉的胚性愈伤组织为亲本材料，采用PEG(聚乙二醇)融合法研究了影响原生质体融合的主要影响因素。2003年，蔡燕灵等用二次回归旋转设计对桉树DH3329和E3两个无性系进行组培试验，研究了其继代培养芽的叶片增大与培养基中细胞分裂素6-BA和生长素NAA浓度的关系。石大兴等研究了以巨桉(Eucalyptusgrandis)幼树带芽茎段为外植体诱导丛生芽发生以及植株再生的过程，对培养过程中新芽及丛生芽的发生类型进行了探讨，通过正交实验及单因素试验，确定了巨桉快繁体系的最适培养条件。随后，卜朝阳通过试验，获得了桉树四种再生系统。关亚丽等以无菌苗叶片为外植体进行了赤桉不定芽的诱导及植株再生。易敏等以邓恩桉无菌苗的下胚轴和半木质化的带芽茎段为外植体，诱导芽的分化及丛生芽产生，对培养基中不同生长素和细胞分裂素的浓度和配比进行了讨论，确定了邓恩桉组织培养最适培养条件。邱璐等研究了史密斯桉愈伤组织的诱导及分化，并取得了一定的结果。王以红等将邓恩桉种子在无菌环境下萌动，切割其下胚轴进行离体培养，建立不定芽发生和植株再生的微繁殖体系。刘奕清等以尾细桉M1的单芽茎段为外殖体进行离体培养和快速繁殖研究，建立了尾细桉M1离体再生体系。邱璐等对史密斯桉愈伤组织的诱导及分化进行了较为深入的研究，优化了史密斯桉愈伤组织诱导及分化系统为其无性繁殖和转基因研究奠定了基础。

Teulieres等人第一次在冈尼桉原生质体上比较了PEG法和电泳冲法控制下转化报告基因的差异以来，科研人员先后进行了柠檬桉(E.citriodora)、蓝桉(E.globules)、赤桉(E.camaldulensis)、巨桉(E.grapdis)、小套桉(E.microtheca)、黄皮桉(E.ochropHloia)及边缘桉(E.marginata)等的遗传转化的初步研究。现已获得转基因桉树的有蓝桉、赤桉和巨桉。Harcourt用农杆菌介导将抗除草剂和抗虫基因转入桉树，获得了多重抗性的转化植株。张景宁报道，柞蚕抗菌肽对桉树青枯假单胞菌有杀灭作用。邵志芳等用柞蚕抗菌肽D基因转化桉树发现转化苗对青枯病的抗性有较大提高。Virginie研究了与桉树木质素合成紧密相关的乙醇脱氢酶的启动子。Bloksberg等人从辐射松(Pinusradiata)中分离出了木质素合成途径中的酶O-甲基转移酶和cinnamoy-CoAreductase基因，通过农杆菌转入到桉树的植物中。2007年赖家业等人在建立的尾巨桉(E.urophylla×E.grandis)3226、3228无性系高频再生体系的基础上，利用GUS染色组织分析法探讨了各因素对尾巨桉茎段遗传转化的影响，转化率最高也只有2.6％。

综上所述，目前国内外还未见有用尾叶桉种子无菌苗下胚轴为外植体进行遗传转化并获得成功之路的例子。

发明内容

本发明的目的是为了弥补现有技术存在的不足，提供一种尾叶桉遗传转化与再生的方法。

为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案是：该尾叶桉遗传转化与再生的方法，是采用尾叶桉无性系种子萌发实生苗的下胚轴为外植体进行遗传转化与再生；愈伤组织诱导后与携带外源基因的农杆菌共培养，经不定芽诱导培养、芽增殖培养、不定芽伸长培养、选择性生根培养及移栽，得到拟转化植株。

所述尾叶桉下胚轴是由尾叶桉种子萌发生长的实生苗获得；

选取成熟的尾叶桉种子，经50～55℃温水浸泡后自然冷却，经70％乙醇灭菌1分钟，无菌水冲洗2次，加入体积比为15％NaClO(次氯酸钠)溶液，相对氯为3.75％，采用二次消毒法，消毒时间为9+9分钟，无菌水冲洗5～6次，播种到不加激素的1/2MS(Mnrashige and Skoog)培养基上，25±2℃暗培养7天后，在光照12小时/天、光照强度2000～2500lx条件下培养5～7天，得到实生苗。

所述1/2MS培养基是大量元素为MS的一半，其它不变；添加0.7％琼脂、3％蔗糖，pH为5.8～6.0。

所述尾叶桉遗传转化利用下胚轴为外植体，下胚轴是指实生无菌苗苗龄为12～14天的下胚轴。

所述农杆菌介导的转化，农杆菌菌液浓度OD₆₀₀(在波长为600纳米时光密度值)为0.4～0.6，MS液体培养基重悬菌落，再将重悬的菌液用MS液体培养基稀释20倍，浸染液pH为5.6。

所述共培养是指尾叶桉无菌苗下胚轴经农杆菌介导转化后，转入共培养基暗培养6天，培养温度为25±2℃；所述共培养基为MS+N-取代苯基N‘-(6-苯并噻唑基)脲类化合物(LC)2mg/L+吲哚乙酸(IAA)0.05mg/L+维生素C(Vc)100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9。

所述不定芽诱导培养是指经共培养基上培养的下胚轴转入选择性不定芽诱导培养基上，在25±2℃、光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周；所述选择性不定芽诱导培养基为SDM(Schneider‘s Drosophila培养基)+N⁶-苄基腺嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.05mg/L+腐胺500μmol/L+亚精胺50μmol/L+维生素C(Vc)100mg/L+卡那霉素(Kan)45mg/L+头孢霉素(Cef)200mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9。

所述下胚轴经2～3周的不定芽诱导培养后，在两端切口外周膨大成哑呤状的愈伤处长出再生芽点。

所述芽增殖培养是指经选择性不定芽诱导培养基培养的下胚轴转入芽增殖培养基上，在25±2℃、光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周；所述芽增殖培养基为SDM+N⁶-苄基腺嘌呤(6-BA)0.5mg/L+萘乙酸(NAA)0.05mg/L+卡那霉素(Kan)45mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9。

所述不定芽伸长培养是指经芽增殖培养基培养的下胚轴转入不定芽伸长培养基上，在25±2℃、光照强度2000～2500lx条件下培养，促进芽伸长；所述不定芽伸长培养基为1/2MS+萘乙酸(NAA)0.05mg/L+N-取代苯基N‘-(6-苯并噻唑基)脲类化合物(LC)0.8mg/L+维生素C(Vc)100mg/L+卡那霉素(Kan)45mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9。

再生芽在不定芽伸长培养基上再培养，芽可以继续生长伸长，待芽伸长至约3～4cm并有3～4个节时，伸长芽最适宜生根。

所述选择性生根培养是指不定芽伸长后转入选择性生根培养基上培养，以促其生根；所述选择性生根培养基为1/2MS+吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L+卡那霉素(Kan)75mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9。

所述移栽是指将生根良好的生根苗从恒温光照培养箱移至室外自然环境中炼苗10～15天，用灭菌的黄心土与腐殖质土，比例为2∶1，进行移栽，得到完整的尾叶桉植株。

本发明特点是以尾叶桉U6无性系种子萌发的幼苗下胚轴为外植体经农杆菌介导进行遗传转化好再生。本发明所用的农杆菌GV3101，含诱导性植物表达载体pBPR-2(携带有真菌诱导性启动子prp1-1、RS-AFP2基因及抗卡那霉素的NPT II基因)。通过诱导尾叶桉下胚轴愈伤组织与携带外源基因的农杆菌共培养转化、不定芽诱导、不定芽伸长、芽增殖以及生根培养、移栽，可以得到完整的拟转化植株。PCR和RT-PCR分析表明，RS-AFP2基因最终导入了尾叶桉基因组中，并且在prp1-1启动子的启动下得到表达；在转RS-AFP2尾叶桉离体叶片的抗病性检测中发现，转化植株对疫霉菌具有较好的抗性；酶活测定结果显示，转化植株在接种后，PAL、POD、PPO活性增强。

附图说明

图1本发明不定芽的选择性诱导；

图2～3转化后3周左右，在选择性不定芽诱导培养基上愈伤处长出不定芽；

图4在选择性芽增殖培养基上长出丛生芽；

图5～7不定芽在选择性芽伸长培养基中伸长；

图8幼芽在选择性生根培养基中生根培养；

图9伸长的幼芽在选择性生根培养中10天左右长出正常白色根，再生成完整植株；

图10再生的完整植株移栽到含灭菌土壤的小盆中；

图11拟转基因尾叶桉PCR检测结果M：100bp Marker；0：阳性质粒对照；1～42：拟转化植株；

图12接种疫霉菌后，RS-AFP2基因的RT-PCR检测结果M：100bp DNAMarker；1：非转基因尾叶桉；2～4：转基因尾叶桉；

图13疫霉菌接种6天后，尾叶桉叶片病情调查(左图为正面，右图为反面)；

图14转RS-AFP2尾叶桉接种疫霉菌前后PAL活性比较；

图15转RS-AFP2尾叶桉接种疫霉菌前后PPO活性比较；

图16转RS-AFP2尾叶桉接种疫霉菌前后POD活性比较。

具体实施方式

本发明采用尾叶桉无菌苗下胚轴为外植体进行遗传转化和再生的具体方法如下：

选择成熟较大的尾叶桉种子，50～55℃温水浸泡后自然冷却，4～6小时后在超净工作台上用无菌水冲洗2次，70％乙醇灭菌1min，无菌水冲洗2次后，加入15％(体积比)NaClO(相对氯为3.75％)溶液，采用二次消毒法，消毒时间为9+9min，无菌水冲洗5～6次后接种到不加激素的1/2MS培养基(添加0.7％琼脂、3％蔗糖，pH 5.8～6.0)。培养温度为25±2℃，光照12h·d^-1，光照强度为2000～2500lx。

当种子萌发成长约3～5cm，仅含1对子叶的幼苗时，去掉顶芽与根部，将下胚轴切成0.5～1.0cm长的小段，将此接种于愈伤诱导培养基(MS+LC2mg/L+IAA 0.05mg/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)，暗培养6天。培养温度25±2℃。经预培养6天的外植体是用于遗传转化的最好材料。

转化实验两天前按常规方法划平板上培养农杆菌，然后从平板上挑取单菌落接种于LB液体培养基【含Km 50mg/L、链酶素(Str)25mg/L和Rif 25mg/L】10mL中，28℃振荡培养过夜。当菌液浓度至OD₆₀₀约为1.0时，吸取菌液200μL，用不加抗生素的LB液体培养基稀释20～30倍，28℃、200rpm震荡培养3～5小时；待菌液浓度至OD₆₀₀为0.4～0.6时，吸取菌液注入1.5mL的离心管中，5000rpm离心2min；弃上清液，用MS 1mL悬浮培养基重悬菌落，再将重悬的菌液用悬浮培养基稀释20倍，即为转化备用的浸染液。

将预培养6天后的外植体放入锥形瓶中，加入浸染液30mL，摇动锥形瓶，使菌液充分接触外植体两端，3小时后将外植体转移到铺干滤纸的培养皿中，当于滤纸吸掉外植体上剩余的菌液后速将外植体转移到共培养基(MS+LC 2mg/L+IAA 0.05mg/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)暗培养6天，培养温度25±2℃。

共培养6天后，将外植体转移到选择性不定芽诱导培养基(SDM+6-BA1mg/L+NAA 0.05mg/L+腐胺500μmol/L+亚精胺50μmol/L+Vc 100mg/L+Kan 45mg/L+Cef 200mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)上，在25±2℃、光照强度2000～2500lx条件下，培养2～3周。

不定芽诱导培养2～3周后，外植体转移到选择性芽增殖培养基(SDM+6-BA0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+Kan 45mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)上，在25±2℃、光照12小时/天、光照强度2000～2500lx条件下，培养2～3周。

将选择性芽增殖培养得到的芽丛切成单株，转移到选择性芽伸长培养基(1/2MS+NAA 0.05mg/L+LC 0.8mg/L+Vc 100mg/L+Kan 45mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)上，在25±2℃、光照12小时/天、光照强度2000～2500lx条件下，培养2～3周。

将3～5cm高的无菌苗转入选择性芽生根培养基(1/2MS+IBA 0.5mg/L+Kan 75mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)上，在25±2℃、光照12小时/天、光照强度2000～2500lx条件下，培养2～3周。

将生根良好的幼苗从恒温光照培养箱移至室外自然环境中炼苗10～15天，移栽到灭菌黄心土与腐殖质土(2∶1)上生长，得到尾叶桉拟转化植株。

实施案例

选择1g成熟饱满的尾叶桉种子，50～55℃温水浸泡后自然冷却4～6小时，在超净工作台上用无菌水冲洗2次，70％乙醇灭菌1min，无菌水冲洗2次后，加入15％(体积比)NaClO(相对氯为3.75％)溶液，采用二次消毒法，消毒时间为9+9min，无菌水冲洗5～6次，接种到不加激素的灭菌1/2MS培养基(附加0.7％琼脂、3％蔗糖，pH为5.8～6.0)。25℃暗培养7天后，转入温度为25±2℃、光照12小时/天、光照强度为2000～2500lx条件下培养6天，即为13天苗龄的尾叶桉无菌实生苗。

取13天苗龄(仅含1对子叶)的幼苗，去掉顶芽与根部，将下胚轴切成0.5～1.0cm长的小段，将此接种于愈伤诱导培养基(MS+LC 2mg/L+IAA0.05mg/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)上，在25±2℃下暗培养6天(90mm培养皿中放入30个外植体，用封口膜封口)。培养6天的外植体是遗传转化的较好材料。

转化前2天，按常规方法划平板，培养农杆菌，然后从平板上挑取单菌落接种于含Km 50mg/L、Str 25mg/L和Rif 25mg/L的LB液体培养基10mL中，28℃振荡培养过夜，当菌液浓度至OD₆₀₀约为1.0时，吸取菌液200μL，用不加抗生素的LB液体培养基稀释20～30倍，28℃、200rpm震荡培养3～5小时；待菌液浓度至OD₆₀₀为0.4～0.6时，吸取菌液注入1.5mL的离心管中，5000rpm离心2min；弃上清液，用MS悬浮培养基1mL重悬菌落，再将重悬的菌液用悬浮培养基稀释20倍，即为转化备用的浸染液。

将预培养6天后的外植体放入100mL锥形瓶中，加入侵染液30mL，摇动锥形瓶，使菌液充分接触外植体两端，置暗处3小时后将外植体转移到铺有干滤纸的培养皿中，当滤纸吸掉外植体上剩余的菌液后，迅速将外植体转移到共培养基(MS+LC 2mg/L+IAA 0.05mg/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)上，在25±2℃下暗培养6天(90mm培养皿中放入30个外植体为宜，用封口膜封口)。

共培养6天后，将外植体转移到选择性不定芽诱导培养基(SDM+6-BA1mg/L+NAA 0.05mg/L+腐胺500μmol/L+亚精胺50μmol/L+Vc 100mg/L+Kan 45mg/L+Cef 200mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)上，在25±2℃、光照12小时/天、光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周，在外植体两端切口周围膨大的黄绿色愈伤处长出数个不定芽。

将不定芽转移到选择性芽增殖培养基(SDM+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+Kan 45mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)中，在25±2℃、光照12小时/天、光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周(每个150mL锥形瓶中放入1～4个不定芽)。

从选择性芽增殖培养基得到的芽丛切成单株，转移到选择性芽伸长培养基(1/2MS+NAA 0.05mg/L+LC 0.8mg/L+Vc 100mg/L+Kan 45mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)上，在25±2℃、光照12小时/天、光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周(每个150mL锥形瓶中放入1～4个单株)。

将3～5cm高的无菌苗转入选择性芽生根培养基(1/2MS+IBA 0.5mg/L+Kan 75mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9)中，在25±2℃、光照12小时/天、光照强度2000～2500lx条件下培养(每个150mL锥形瓶中放入1～4个单株)。

将生根良好的幼苗从恒温光照培养箱移至室外，打开瓶盖，在自然环境中炼苗10～15天，从瓶中小心取出完整植株，放入装有无菌水的烧杯中洗净根部培养基，将生根苗移栽在盛有用灭菌黄心土与腐殖质土(2∶1)基质的塑料盆内，立即给花盆套上塑料袋，边缘用橡皮筋扎紧，保持湿度。把花盆放在光照适宜的地方，可得到完整转基因尾叶桉拟转化植株。

Claims (11)

1.一种尾叶桉遗传转化与再生的方法，其特征在于：采用尾叶桉无性系种子萌发实生苗的下胚轴为外植体进行遗传转化与再生；愈伤组织诱导后与携带外源基因的农杆菌共培养，经不定芽诱导培养、芽增殖培养、不定芽伸长培养、选择性生根培养及移栽，得到拟转化植株。

2.根据权利要求1所述尾叶桉遗传转化与再生的方法，其特征在于：选取成熟的尾叶桉种子，经50～55℃温水浸泡后自然冷却，经70％乙醇灭菌1分钟，无菌水冲洗2次，加入体积比为15％NaClO溶液，相对氯为3.75％，采用二次消毒法，消毒时间为9+9分钟，无菌水冲洗5～6次，播种到不加激素的1/2MS培养基上，25±2℃暗培养7天后，在光照12小时/天、光照强度2000～2500lx条件下培养5～7天，得到实生苗；

所述1/2MS培养基是大量元素为MS的一半，其它不变；添加0.7％琼脂、3％蔗糖，pH为5.8～6.0。

3.根据权利要求1所述尾叶桉遗传转化与再生的方法，其特征在于：所述尾叶桉遗传转化利用下胚轴为外植体，下胚轴是指实生无菌苗苗龄为12～14天的下胚轴。

4.根据权利要求1所述的尾叶桉遗传转化与再生方法，其特征在于：所述农杆菌介导的转化，农杆菌菌液浓度OD₆₀₀为0.4～0.6，MS液体培养基重悬菌落，再将重悬的菌液用MS液体培养基稀释20倍，浸染液pH为5.6。

5.根据权利要求1所述的尾叶桉遗传转化与再生方法，其特征在于：所述共培养是指尾叶桉无菌苗下胚轴经农杆菌介导转化后，转入共培养基暗培养6天，培养温度为25±2℃；

所述共培养基为MS+LC 2mg/L+IAA 0.05mg/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9。

6.根据权利要求1所述尾叶桉遗传转化与再生的方法，其特征在于：所述不定芽诱导培养是指经共培养基上培养的下胚轴转入选择性不定芽诱导培养基上，在25±2℃、光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周，在两端切口外周膨大成哑呤状的愈伤处长出再生芽点；

所述选择性不定芽诱导培养基为SDM+6-BA 1mg/L+NAA 0.05mg/L+腐胺500μmol/L+亚精胺50μmol/L+Vc 100mg/L+Kan 45mg/L+Cef 200mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9。

7.根据权利要求1所述尾叶桉遗传转化与再生的方法，其特征在于：所述芽增殖培养是指经选择性不定芽诱导培养基培养的下胚轴转入芽增殖培养基上，在25±2℃、光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周；

所述芽增殖培养基为SDM+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+Kan 45mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9。

8.根据权利要求1所述尾叶桉遗传转化与再生的方法，其特征在于：所述不定芽伸长培养是指经芽增殖培养基培养的下胚轴转入不定芽伸长培养基上，在25±2℃、光照强度2000～2500lx条件下培养，促进芽伸长；

所述不定芽伸长培养基为1/2MS+NAA 0.05mg/L+LC 0.8mg/L+Vc100mg/L+Kan 45mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9。

9.根据权利要求8所述尾叶桉遗传转化与再生的方法，其特征在于：再生芽在不定芽伸长培养基上再培养，芽可以继续生长伸长，待芽伸长至约3～4cm并有3～4个节时，伸长芽最适宜生根。

10.根据权利要求1所述尾叶桉遗传转化与再生的方法，其特征在于：所述选择性生根培养是指不定芽伸长后转入选择性生根培养基上培养，以促其生根；

所述选择性生根培养基为1/2MS+IBA 0.5mg/L+Kan 75mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8～5.9。

11.根据权利要求1所述尾叶桉遗传转化与再生的方法，其特征在于：所述移栽是指将生根良好的生根苗从恒温光照培养箱移至室外自然环境中炼苗10～15天，用灭菌的黄心土与腐殖质土，比例为2∶1，进行移栽，得到完整的尾叶桉植株。

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