CN104004781A - 一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法。该方法是将草甘膦抗性基因通过表达载体转化农杆菌，利用该农杆菌侵染水稻愈伤组织，将愈伤组织转移到含草甘膦的选择培养基上进行筛选，挑选抗性愈伤，经分化、生根、炼苗、移栽，得到对草甘膦具有抗性的转基因水稻，分子鉴定结果显示外源基因已稳定地表达。本发明得到的抗草甘膦转基因水稻除了带有抗草甘膦除草剂基因外，不含其它筛选标记基因，可作为商品化抗除草剂水稻品种，减少后期流程，加快育种步伐。本发明方法操作简便、转基因植株拷贝数低，遗传性状稳定，具有良好的市场应用前景。

Description

一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法

技术领域

本发明涉及植物转基因技术领域，具体地，涉及一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法。

背景技术

稻田杂草与水稻在水、肥、生长空间上进行竞争，直接影响水稻的产量。近年来直播和抛秧等栽培方法的使用，使得稻田的杂草危害变得日益严重；特别是新型稻田杂草--杂草稻--的出现，给稻田除草提出了难题。另外，随着农村人口往城市迁移速度的加快，水稻种植的规模化和机械化是一个可预见的趋势，这使得传统的人工除草的方法变得不现实。施用除草剂是解决这些新出现的问题的最佳方案之一，因此，抗除草剂水稻将具有非常大的实际需求和市场潜力。

草甘膦（glyphosate）别名N-(膦羧甲基)甘氨酸；农达（Roundup）；镇草宁；膦甘酸，是一种非选择性、无残留、灭生性除草剂，对多年生根杂草非常有效，广泛用于橡胶、桑、茶、果园及甘蔗地。施用草甘膦后，进入植物体内的草甘膦分子与磷酸烯醇丙酮酸竞争性地结合EPSPS（5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶）的活性位点，终止了芳香族氨基酸的合成途径，造成苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等氨基酸的缺乏，最终导致植物死亡。利用源于细菌、植物抗性细胞系的Epsps基因可以大大提高植物对草甘膦的耐受性。在转基因抗除草剂作物的研制中，最负盛名、推广面积最大、经济效益最高的是抗草甘膦作物。现已研制成功的抗草甘膦作物有：大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜、水稻、烟草、花生、番茄、马铃薯、向日葵、胡萝卜、洋葱、春小麦、苜蓿、波菜、南瓜、百脉根等20多种植物。由于抗草甘膦作物在世界各地的推广与大面积种植，影响了除草剂新品种的筛选与开发、世界除草剂销售市场以及食品工业，还引起了作物栽培方式及耕作制度的深刻变革。可以预见其耐性基因工程的市场前景广阔（Wang X J,Lang Z H,Shan A S,Huang D F.Advances in mechanism of herbicide inhibiting amino acid biosynthesis andherbicide-tolerant transgenic plants.China Biotechnology,2008,28（2）:110-116.）

目前的水稻遗传转化方法主要是用以潮霉素为筛选剂的农杆菌介导法。例如HieiY，Ohta S,Komori T.Efficient transformation of rice（Oryzasativa L.）mediated by Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries ofthe T-DNA.[J]Plant Journal，1994（6），通过潮霉素筛选，获得粳稻“越光”的转基因植株；沈革志,张建军,殷丽青,等.根癌农杆菌介导Ds转座因子的水稻遗传转化[J].上海农业学报.1998（04）；刘巧泉,等.根癌农杆菌介导的水稻高效转化系统的建立[J].植物生理学报.1998（03）获得“中花11”的转基因植株；孙建昌,马静,何玉科,等.农杆菌介导法转化宁夏水稻的研究[J].宁夏农林科技.2009（01），获得“优育28”的转基因植株。但是利用该筛选方法培育出的转基因水稻会带入多余的筛选标记基因，给未来的品种应用带来麻烦。也有少量转化方法以Bar基因作为筛选标记基因，用除草剂草丁膦作为筛选剂得到抗草丁膦的转基因水稻植株。例如文献【黎垣庆,刘刚,严文贵,等.转bar基因水稻除草剂抗性遗传研究及其应用[J].杂交水稻2000（01）、查中萍,万丙良,殷得所,等.农杆菌介导的氮高效利用转基因水稻植株的获得[J].湖北农业科学.2011（24）】。相对于草丁膦，草甘膦具有价格便宜，在土壤中易分解、无残留，对生态环境的潜在影响小等优点，从而成为了世界范围内施用面积最大的除草剂，这也为抗草甘膦除草剂作物的培育提出了更高的要求，迫切需要一种大规模商业化生产抗草甘膦水稻的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法。

本发明通过以下技术方案实现：构建包含草甘膦抗性基因Epsps-1和Epsps-2的遗传转化载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法、以草甘膦作为筛选剂，成功地将草甘膦抗性基因转入到水稻愈伤组织中，并培育出抗草甘膦除草剂的转基因水稻植株，借助PCR方法分析鉴定阳性转基因植株，Southern Blot方法鉴定外源基因拷贝数，试纸条检测Epsps-1或Epsps-2蛋白表达情况，分子鉴定结果显示外源基因已稳定地表达。

本发明提供的抗草甘膦转基因水稻的制备方法，包括以下步骤：

（1）将含草甘膦抗性基因的表达载体转化入农杆菌中；

（2）将步骤（1）的农杆菌菌液侵染水稻的胚性愈伤组织；

（3）将步骤（2）的愈伤组织转移到添加了草甘膦的选择培养基上进行筛选，挑选抗性愈伤组织；

（4）将抗性愈伤组织转入分化培养基分化，将分化形成的再生小苗转入生根培养基中培养，幼苗生根后炼苗、移栽，得到抗草甘膦转基因水稻。

其中，步骤（1）所述的表达载体为pZZ00011或pZZ00013。

进一步地，所述pZZ00011载体的构建方法为：合成Epsps-1基因，序列如SEQ ID NO.1所示；将Epsps-1基因与PU130载体该载体为pCambia3300的衍生载体，其构建过程是：pCambia3300经XhoI和HindIII酶切处理，用Pubi取代P35s-Bar部分得到PU130。分别用BamHI和SacI酶切，将酶切后的Epsps-1基因与PU130载体连接，得到中间载体Pubi-Epsps-1-35spolyA，即pZZ00002；分别用Hind III和PmeI对pZZ00002和P35s-gfp-35spolyA进行双酶切，再将酶切后的二者连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到遗传转化载体pZZ00011。

进一步地，所述pZZ00013载体的构建方法为：合成Epsps-2基因，序列如SEQ ID NO.2所示；将Epsps-2基因与PU130载体分别用BamHI和SacI酶切，将酶切后的Epsps-1基因与PU130载体连接，得到中间载体Pubi-Epsps-2-35spolyA，即pZZ00003；分别用Hind III和PmeI对pZZ00003和P35s-gfp-35spolyA进行双酶切，再将酶切后的二者连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到遗传转化载体pZZ00013。

在pZZ00011和pZZ00013载体的构建方法中，所述的P35s-gfp-35spolyA是以pCambia1381载体为模板，以SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列为上、下游引物，通过PCR方法扩增得到的。

PCR扩增P35s-gfp-35spolyA的50μL反应体系为：10×La Taq Buffer5μL，2.5mM dNTP4μL，上、下游引物各1μL，pCambia1381模板1μL，LA Taq0.5μL，ddH₂O37.5μL。

反应条件为：95℃，5min；95℃，40s，55℃，40s，72℃，2min，25个循环；72℃，10min，4℃保存。1%琼脂糖凝胶回收P35s-gfp-35spolyA片段。

Hind III/PmeI酶切回收PCR片段和质粒pZZ00002(Pubi-Epsps-1-35spolyA)或pZZ00003(Pubi-Epsps-2-35spolyA)，体系为：10×NEB4，10μL；100×BSA1μL；Hind III，2μL；PmeI，2μL；PCR片段或质粒5-10μL；加灭菌ddH₂O至总体系100μL。酶切条件为37℃，3-5h。

使用QIAGEN PCR Purifcation Kit试剂盒纯化回收目标片段。

连接上述两个酶切片段（P35s-gfp-35spolyA片段和pZZ00002或pZZ00003），体系为：10×ligase buffer，2μL；长片段1μL；短片段7μL；ligase，1μL；加ddH₂O至总体系20μL。连接条件为16℃，2-4h。

热激转化大肠杆菌感受态细胞（DH5α）得到遗传转化载体pZZ00011/pZZ00013，并将遗传转化载体转化入农杆菌中，进行测序分析，结果显示该农杆菌中含有Epsps-1基因或Epsps-2基因。

本发明方法中，所述的选择培养基以N6为基本培养基，并添加2.5mg/L的2,4-D，250mg/L羧苄青霉素和草甘膦。

进一步地，选择培养基中草甘膦的终浓度为80~300mg/L。

本发明制备抗草甘膦转基因水稻的方法中，应用的农杆菌为EHA105。

优选地，本发明方法中所述的水稻为粳稻。

更优选地，所述的粳稻为空育131和/或R187。

本发明方法利用草甘膦作为筛选剂，培育出的水稻品种除了带有抗草甘膦除草剂的基因外不含有其它的筛选标记基因，可以直接作为抗除草剂的品种进行商业化生产，极大地减少了后期的流程，加快了育种步伐。本发明方法具有效率高、操作简便、转基因植株拷贝数低、遗传性状稳定等优点，为大规模商业化生产抗草甘膦水稻提供了可能。

附图说明

图1为遗传转化载体的T-DNA区示意图，其中图1A为Epsps-1基因遗传转化载体（pZZ00011）的T-DNA区示意图；图1B为Epsps-2基因遗传转化载体（pZZ00013）的T-DNA区示意图。

图2转基因植株中外源基因（GFP）在组织中的表达图。图2A为外源基因（GFP）在转化粳稻根部的表达图；图2B为外源基因（GFP）在转化粳稻叶部的表达图。a：含Epsps-1的载体转化空育131得到的苗；b：含Epsps-2的载体转化空育131得到的苗；c：野生型空育131；d：含Epsps-1的载体转化R187得到的苗；e：含Epsps-2的载体转化R187得到的苗；f：野生型R187

图3转基因植株中外源基因（Epsps-1/Epsps-2）PCR扩增结果图。图3A：Epsps-1基因转化粳稻品种空育131所得到的部分转基因植株PCR扩增图；图3B:Epsps-2基因转化粳稻品种空育131所得到的转基因植株PCR扩增图；图3C：Epsps-1基因转化粳稻品种R187所得到的转基因植株PCR扩增图；图3D：Epsps-2基因转化粳稻品种R187所得到的转基因植株PCR扩增图。M：为2KB Marker分子量标准；1-20：本发明制备的转基因植株编号；N：阴性对照；P：阳性对照；图片左侧数字：转化实验编号。

图4转基因植株拷贝数检测图。Epsps-1和Epsps-2转化粳稻品种空育131以及Epsps-1和Epsps-2转化粳稻品种R187植株Southern-blot检测图。每个样品分别来自于独立的转化事件，图上标示出了相应的目标基因和受体品种。

图5Epsps试纸条检测转基因植株中蛋白（Epsps-1/Epsps-2）表达的结果。图5A：Epsps-1和Epsps-2转化粳稻品种空育131植株蛋白检测图；图5B：Epsps-1和Epsps-2转化粳稻品种R187植株蛋白检测图。

图6转基因植株喷施草甘膦除草剂后的表型图，草甘膦喷施浓度0.6%（V/V）。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1Epsps-1和Epsps-2基因的合成与遗传转化载体的构建

1、人工合成草甘膦抗性基因Epsps-1（US_RE39247）和Epsps-2（CN88103827.X），其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2、以PU130载体为骨架（PU130载体的构建过程是：pCambia3300载体经XhoI和HindIII酶切处理，用Pubi取代P35s-Bar部分得到PU130），构建遗传转化载体，分别命名为pZZ00011和pZZ00013。两个遗传转化载体的T-DNA区域示意图见图1A，图1B。

（1）把人工合成的基因Epsps-1和Epsps-2经BamHI和SacI酶切，插入经BamHI和SacI酶切处理过的PU130，分别获得中间载体pZZ00002(Pubi-Epsps-1-35spolyA)、pZZ00003(Pubi-Epsps-2-35spolyA)。

（2）PCR扩增P35s-gfp-35spolyA。

反应体系：10×La Taq Buffer5μL,

反应条件：95℃，5min；95℃，40s，55℃，40s，72℃，2min，25个循环；72℃，10min，4℃，hold。1%琼脂糖凝胶回收。

（3）用Hind III和PmeI酶切回收PCR片段和质粒pZZ00002(Pubi-Epsps-1-35spolyA)、pZZ00003(Pubi-Epsps-2-35spolyA)，酶切体系为：

酶切条件：37℃，3-5h

目标片段纯化回收（QIAGEN PCR Purifcation Kit）。

（4）连接上述两个酶切片段

连接条件：16℃，2-4h

热激转化大肠杆菌感受态细胞DH5α分别得到遗传转化载体pZZ00011和pZZ00013。

实施例2转化农杆菌的获得与鉴定

分别将pZZ00011和pZZ00013载体通过电转化，导入农杆菌EHA105菌株中，得到转化用农杆菌，并测序。

测序步骤包括：

1、农杆菌转化

（1）将EHA105感受态放于冰上解冻，并将电转杯在冰上预冷。

（2）加入1ul实施例1制得的pZZ00011或pZZ00013载体的DNA，轻轻混匀，将混合物加入预冷的电转杯中

（3）选择agr转化档，电击，使用500ulLB将菌液吹打出

（4）复苏：28℃，200rpm，45min

（5）将复苏产物涂Rif+Kan抗性平板，28℃，40h

（6）挑取单克隆摇菌，提取质粒

（7）使用农杆菌提取的质粒，热激转化大肠杆菌

（8）挑取单克隆37℃摇菌过夜，提取大肠杆菌质粒

2、应用ABI3730测序仪进行测序，步骤如下

（1）PCR反应：10μl体系：DNA1.5ul，单引物0.16μl，Big dye0.5μl，5×Buffer1.75μl。程序为96℃2min；96℃10s，50℃10s，60℃4min，共35个循环；25℃保存。

（2）PCR产物纯化：每孔加2.5倍的（即25μl）无水乙醇+3MNaAc（PH5.2）混合液沉淀15mins；2、3,000g离心30mins；弃上清，拿在手上轻甩两下，加入70%酒精75μl/孔；5,000rpm离心10mins；弃上清，垫上面巾纸倒甩一下（<500g）吹干（约5mins）；加甲酰胺7μl/孔；94-96℃变性4mins，立即放冰上5mins。

（3）上机测序

1）PZZ00011

测序引物序列

CSP-28Q   CEPSP-R1  CCTGAACTCCTCCAACCT  （1502-1519bp）

CSP-29Q   CEPSP-L1  CCACCAAGTCGCCAATC    （924-940bp）

CSP-30    QCEPSP-R2  CGATTGGCGACTTGGT    （926-941bp）

CSP-31    QCEPSP-L2  GACTGTGACGCTGTTCTC    （418-435bp）

CSP-32    QCEPSP-L3  AACAGCGTCACAGTCAAG    （415-432bp）

CSP-45    QCEPSP-L0 TTGGAGCCGAAGAAGAGA  （1448-1465bp）

测序结果：用AlignX分析，测序峰图与原序列100%匹配，表明本实施例转化的农杆菌质粒中含有完整的正确的Epsps-1基因。

2）pZZ00013

测序引物序列

csp-46    CTTCGTGAGACTCGCATC    （589bp-606bp）

csp-47    GGCGAAGATGTGATTAACAC    （382bp-401bp）

csp-48    TGCGACAGCCAGAATAGG    （1210bp-1227bp）

csp-49    GTGCTCATGAATCCGACC    （1027bp-1044bp）

测序结果：用AlignX分析，测序峰图与原序列100%匹配，表明本实施例转化的农杆菌质粒中含有完整的正确的Epsps-2基因。

实施例3抗草甘膦转基因空育131水稻的制备

1、愈伤组织的诱导

（1）取空育131水稻成熟种子（购自黑龙江省农垦局建三江分局），去壳后用75%的乙醇消毒1分钟；

（2）40%（V/V）的次氯酸钠溶液（NaClO）消毒10-15分钟；

（3）灭菌水冲洗3次；

（4）将消毒好的种子接种于诱导培养基上

（5）28℃暗培养30天。

2、愈伤组织的继代

挑选外表嫩黄色、表面干燥、质地紧实的愈伤放置于继代培养基上，28℃暗培养，每2周为一个周期进行继代。

3、农杆菌的准备。

1）于无菌工作台上，将-70℃冰箱中保存的实施例2制得的已转化pZZ00011和pZZ00013载体质粒的农杆菌菌株取出，分别用冷却后的经酒精灯灼烧灭菌的金属接种环蘸取少量农杆菌在LB（含Kana50mg/L+Rif20mg/L）平板培养基上划线；

2）将划线平板培养基用Parafilm封口膜封好，置于28℃培养箱中培养两天；

3）取出农杆菌已生长好的LB划线平板，用已灭菌的接种环蘸取少量农杆菌，接种于LB（含Kana50mg/L+Rif20mg/L）液体培养基，置无菌的50ml离心管中，放入28℃摇床震荡培养20小时；

4）将菌液离心，去除上清液；

5）用移液器吸取悬浮培养基至去除了上清液的上述50ml离心管中，调整OD600值至0.4-0.5用于侵染。

4.农杆菌侵染

1）将上述悬浮培养菌液（含pZZ00011和pZZ00013载体的农杆菌菌液分别放置），将上述含不同载体的农杆菌分别倒入装有愈伤组织的三角瓶至完全浸没愈伤，浸泡20分钟；

2）倒掉农杆菌悬浮液，将侵染后的愈伤组织转移至装有灭菌滤纸的培养皿中，吸干愈伤组织表面多余的菌液；

3）将吸干的愈伤组织转移到共培养基上，放置于23℃的培养箱中暗培养3天。

5.水洗

1）将共培养后的愈伤组织转移至无菌三角瓶中；

2）倒入灭菌水至完全浸没愈伤组织，摇晃2-3分钟，倒掉洗涤水；

3）重复上述2）步骤2-3次直至洗涤水呈澄清状态，倒掉洗涤水；

4）加入含500mg/L羧苄青霉素的灭菌水浸泡愈伤，轻微晃动后静置30分钟；

5）倒掉浸泡液体，将愈伤转入装有灭菌滤纸的培养皿中，吸干水分。

6.筛选

将吸干水分的愈伤转移到筛选培养基上，28℃暗培养2-3个周期,每个周期为2周。以空育131转化Epsps-1筛选为例，比较不同草甘膦浓度筛选效果（如表1所示）。当草甘膦浓度为60mg/L时，PCR检测阳性率为16.13%；当草甘膦浓度提高到80mg/L时，PCR检测阳性率达70.27%；当草甘膦浓度达到300mg/L时，PCR检测阳性率达100%。因此，本发明所述的选择培养基中草甘膦的添加量为终浓度范围在80-300mg/L之间。

表1不同草甘膦浓度对空育131转化Epsps-1的筛选效果

7.分化

将筛选阶段生成的抗性愈伤转入分化培养基上，28℃、16小时光/8小时暗的光周期条件培养。

8.生根

将分化形成的再生小苗转入含生根培养基的培养盒中，16小时光/8小时暗的光周期条件培养至长出白色的新根。

9.炼苗及移栽

1）幼苗生根长成后，打开生根培养盒，置室内光线充足处炼苗2-3天；

2）将苗取出，洗净根部的残留培养基，移栽至穴盘置温室中，待长出新叶后移栽到盆钵中栽培。

转化过程中所用到的培养基配方如下：

诱导：N6基本培养基+2,4-D2.5mg/L+脯氨酸300mg/L+水解酪蛋白600mg/L+3%蔗糖+Phytagel3g/L（pH5.8）

继代：N6基本培养基+2,4-D2.0mg/L+脯氨酸500mg/L+水解酪蛋白600mg/L+3%蔗糖+Phytagel3g/L（pH5.9）

侵染：1/2N6大量（2024.2mg/L）+1/2N6微量（2mg/L）+1/2N6铁盐（13.9mg/L）+N6维生素（4mg/L）+2,4-D2mg/L+2%蔗糖+1%葡萄糖+AS100uM（pH5.2）

共培养：1/2N6大量（2024.2mg/L）+1/2N6微量（2mg/L）+1/2N6铁盐（13.9mg/L）+N6维生素（4mg/L）+2,4-D3.0mg/L+2%蔗糖+1%葡萄糖+AS100uM+Agar7g/L（pH5.2）

筛选：N6基本培养基+2,4-D2.5mg/L+250mg/L羧苄青霉素+3%蔗糖+Agar7g/L（pH5.8），草甘膦浓度梯度为60-300mg/L

分化：MS基本培养基+6-BA2.0mg/L+KT2.0mg/L+NAA0.2mg/L+IAA0.2mg/L+250mg/L羧苄青霉素+3%蔗糖+Phytagel3g/L（pH6.0）

生根：1/2MS大量+1/2MS微量+MS铁盐+MS维生素+2%蔗糖+Phytagel3g/L（pH5.8）

实施例4转基因空育131水稻的鉴定与抗性验证

1、转基因水稻中外源基因GFP在组织中的表达观察

取实施例3的转基因空育131水稻植株根和叶片进行外源基因（GFP）在组织中的表达观察，在荧光下成绿色，说明外源基因成功表达，否则为阴性材料，阴性材料与阳性材料相比，在荧光下较暗淡，根为黄色、叶为红色(此处详细介绍表达图效果，是为了弥补黑白图片不能直观的呈现颜色对比效果的缺陷，若条件允许，申请人可以提供未变换为黑白色调的原版荧光图供参考)。结果见图2A，图2B。

2、转基因植株中外源基因阳性检测

取实施例1的转基因植株叶片，在DNA水平上做外源基因的阳性检测。步骤如下：叶片抽提总DNA，DNA抽提方法为CTAB法（Murray etal,Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.Nucleic AcidsRes,1980,8:4321-4325.）。将得到的DNA作为模板做普通PCR。

用PCR方法加入Epsps-1引物（检测引物序列如SEQ ID NO.8、9所示）或Epsps-2引物（检测引物序列如SEQ ID NO.10、11所示）进行阳性检测。PCR反应总体积为20μl，具体配法是：模板100ng，10×PCR buffer2μl，10mM dNTP1.6μl，2.5mM Mg2+1.5μl，正向引物、反向引物各0.4μl，TAQ酶0.2μl加水到20μl。PCR反应条件如下：①94℃预变性4分钟，②94℃变性1分钟，③56℃退火1分钟，④72℃延伸2.5分钟，⑤从②－④循环32次，⑥72℃延伸10分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测。因为Epsps-1或Epsps-2基因为本发明遗传转化载体所特有，这样能扩增出Epsps-1或Epsps-2基因特异带的转基因植株即为阳性植株，否则即为阴性材料。实施例3制得的转基因水稻的基因检测结果如图3A，图3B所示。

表2空育131转化抗草甘膦基因（Epsps-1）出苗统计

表3空育131转化抗草甘膦基因（Epsps-2）出苗统计

3、转基因植株拷贝数检测

为了检测转基因植株中的拷贝数，选取经Real time-PCR检测为单拷贝的样本，采用Southern Blot方法对转基因植株进行更精确的分析。Southern杂交方法参照（Lu et al.Localization of pms3,a gene forphotoperiod-sensitive genic male sterility,to a28.4-kb DNA fragment.MolGenet Genomics,2005,273:507-511.）所述的方法。总DNA在37℃条件下，用适当的核酸内切酶消化过夜，然后在1％（w/v）的琼脂糖凝胶上分离并转移到硝酸纤维膜上。探针标记和杂交使用Roche公司的地高辛标记和检测试剂盒（DIG High Primer DNA Labeling and Detection StarterKit I），具体操作参照说明书。结果显示，除了第二条泳道的样品为3个拷贝外，其余检测的植株都是单拷贝。这表明了外源基因已经稳定地整合到了植物基因组上。转基因植株Southern-blot检测结果如图4所示。

4、Epsps-1和Epsps-2蛋白表达检测

取实施例3的转基因植株叶片磨碎后，用Epsps试纸条（EnviroLogix公司）分别检测外源Epsps-1和Epsps-2蛋白表达情况。如图5A所示，PCR检测呈阳性的转基因植株全部可以检测出条带来，而野生型对照材料没有检测出条带。表明外源的Epsps-1或Epsps-2基因可以在转基因水稻细胞内表达出蛋白。

5、草甘膦除草剂抗性实验

为了检测转基因水稻对草甘膦除草剂的抗性，于两叶期以0.6%（V/V）浓度的草甘膦喷施，一周后观察植株表型。结果显示喷施除草剂后转基因植株可以正常生长而野生型材料逐渐干枯、死亡（如图6所示，照片拍摄于喷施除草剂两周后）。这表明了用本发明方法生产的转基因空育131水稻对草甘膦除草剂具有抗性，可以用大面积喷洒的方法去除杂草，提高工作效率。

实施例5抗草甘膦转基因R187水稻的制备与鉴定

1、制备含Epsps-1或Epsps-2基因的转基因R187水稻

R187成熟水稻种子（购自安徽省农科院）愈伤组织的诱导和继代同实施例3的相应方法。将实施例2获得的含pZZ00011或pZZ00013遗传转化载体的农杆菌按照实施例3的方法处理，然后将农杆菌菌液侵染愈伤组织，侵染、水洗、筛选、分化、生根，以及进一步的炼苗及移栽的方法均同实施例3的方法。最终获得含Epsps-1或Epsps-2基因的抗草甘膦转基因R187水稻。

2、转基因植株中外源基因（GFP）在组织中的表达观察

取本实施例制得的转基因R187水稻植株根和叶片进行外源基因（GFP）在组织中的表达观察，在荧光下成绿色，说明外源基因成功表达，否则为阴性材料。结果见图2A，图2B。

3、转基因植株中外源基因阳性检测

取本实施例制得的转基因R187水稻植株叶片，在DNA水平上做外源基因的阳性检测。步骤如下：叶片抽提总DNA，DNA抽提方法为CTAB法（Murray et al,Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.Nucleic Acids Res,1980,8:4321-4325.）。将得到的DNA作为模板做普通PCR。

用PCR方法加入Epsps-1或Epsps-2引物进行阳性检测，检测引物序列分别如SEQ ID NO.8、9或SEQ ID NO.10、11所示。PCR反应总体积为20μl，具体配法是：模板100ng，10×PCR buffer2μl，10mM dNTP1.6μl，2.5mM Mg2+1.5μl，正向引物、反向引物各0.4μl，TAQ酶0.2μl加水到20μl。PCR反应条件如下：①94℃预变性4分钟，②94℃变性1分钟，③56℃退火1分钟，④72℃延伸2.5分钟，⑤从②－④循环32次，⑥72℃延伸10分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测。因为Epsps-1或Epsps-2基因为转化载体所特有，这样能扩增出Epsps-1或Epsps-2基因特异带的转基因植株即为阳性植株，否则即为阴性材料。转基因水稻的基因检测结果如图3C，图3D所示。

表4R187转化抗草甘膦基因（Epsps-1）出苗统计

表5R187转化抗草甘膦基因（Epsps-2）出苗统计

4、转基因植株拷贝数检测

为了检测转基因植株中的拷贝数，采用Southern Blot方法对转基因植株进行了分析。Southern杂交方法参照（Lu et al.Localization ofpms3,a gene for photoperiod-sensitive genic male sterility,to a28.4-kb DNAfragment.Mol Genet Genomics,2005,273:507-511.）所述的方法。总DNA在37℃条件下，用适当的核酸内切酶消化过夜，然后在1％（w/v）的琼脂糖凝胶上分离并转移到硝酸纤维膜上。探针标记和杂交使用Roche公司的地高辛标记和检测试剂盒（DIG High Primer DNA Labeling andDetection Starter Kit I），具体操作参照说明书。选取经Realtime-PCR检测为单拷贝的样本验证，结果显示，大部分检测的植株都是单拷贝。这表明了外源基因已经稳定地整合到了植物基因组上。结果如图4所示。

4、Epsps-1和Epsps-2蛋白表达检测

取本实施例制得的转基因植株叶片磨碎后，用Epsps试纸条（EnviroLogix公司）检测外源Epsps-1或Epsps-2蛋白表达情况。如图5B所示，PCR检测呈阳性的转基因植株全部可以检测出条带来，而野生型对照材料没有检测出条带。表明外源的Epsps-1或Epsps-2基因可以在转基因水稻细胞内表达出蛋白。

5、草甘膦除草剂抗性实验

为了检测转基因水稻对草甘膦除草剂的抗性，于两叶期以0.6%（V/V）浓度的草甘膦喷施，一周后观察植株表型。结果显示喷施除草剂后转基因植株可以正常生长而野生型材料逐渐干枯、死亡（如图6所示，照片拍摄于喷施除草剂两周后）。这表明了用本专利方法生产的转基因水稻对草甘膦除草剂具有抗性，可以用大面积喷洒的方法去除杂草，提高工作效率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法，包括以下步骤：

（1）将含草甘膦抗性基因的表达载体转化入农杆菌中；

（2）将步骤（1）的农杆菌菌液侵染水稻的胚性愈伤组织；

（3）将步骤（2）的愈伤组织转移到添加了草甘膦的选择培养基上进行筛选，挑选抗性愈伤组织；

（4）将抗性愈伤组织转入分化培养基分化，将分化形成的再生小苗转入生根培养基中培养，幼苗生根后炼苗、移栽，得到抗草甘膦转基因水稻。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的表达载体为pZZ00011或pZZ00013。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述pZZ00011载体的构建方法为：合成Epsps-1基因，序列如SEQ ID NO.1所示；将Epsps-1基因与PU130载体分别用BamHI和SacI酶切，将酶切后的Epsps-1基因与PU130载体连接，得到中间载体Pubi-Epsps-1-35spolyA，即pZZ00002；分别用Hind III和PmeI对pZZ00002和P35s-gfp-35spolyA进行双酶切，再将酶切后的二者连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到遗传转化载体pZZ00011。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述pZZ00013载体的构建方法为：合成Epsps-2基因，序列如SEQ ID NO.2所示；将Epsps-2基因与PU130载体分别用BamHI和SacI酶切，将酶切后的Epsps-1基因与PU130载体连接，得到中间载体Pubi-Epsps-2-35spolyA，即pZZ00003；分别用Hind III和PmeI对pZZ00003和P35s-gfp-35spolyA进行双酶切，再将酶切后的二者连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到遗传转化载体pZZ00013。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的P35s-gfp-35spolyA是以pCambia1381载体为模板，以SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列为上、下游引物，通过PCR方法扩增得到的。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的选择培养基以N6为基本培养基，并添加2.5mg/L的2,4-D，250mg/L羧苄青霉素和草甘膦。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，选择培养基中草甘膦的终浓度为80~300mg/L。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的农杆菌为EHA105。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水稻为粳稻。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的粳稻为空育131和/或R187。