CN117004649B - 一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法 - Google Patents

一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117004649B
CN117004649B CN202311246503.2A CN202311246503A CN117004649B CN 117004649 B CN117004649 B CN 117004649B CN 202311246503 A CN202311246503 A CN 202311246503A CN 117004649 B CN117004649 B CN 117004649B
Authority
CN
China
Prior art keywords
agrobacterium
culture
broom corn
culture medium
corn millet
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202311246503.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN117004649A (zh
Inventor
赵辉
刘国庆
降彦苗
王根平
刘亚男
夏启玉
张丽丽
胡帅
程汝宏
郭安平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanya Research Institute Chinese Academy Of Tropical Agricultural Sciences
Grain Research Institute of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Original Assignee
Sanya Research Institute Chinese Academy Of Tropical Agricultural Sciences
Grain Research Institute of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanya Research Institute Chinese Academy Of Tropical Agricultural Sciences, Grain Research Institute of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences filed Critical Sanya Research Institute Chinese Academy Of Tropical Agricultural Sciences
Priority to CN202311246503.2A priority Critical patent/CN117004649B/zh
Publication of CN117004649A publication Critical patent/CN117004649A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117004649B publication Critical patent/CN117004649B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/002—Culture media for tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明提供一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法，属于植物生物技术领域，所述方法是以糜子成熟种子诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，通过农杆菌介导法转化含有外源基因的植物表达载体，以潮霉素抗性基因（hptII gene）作为筛选标记，用潮霉素进行抗性愈伤和再生植株的筛选，最后得到具有潮霉素抗性的再生糜子植株。本发明首次建立了农杆菌介导的糜子遗传转化方法，该方法获得的抗性再生植株PCR鉴定的阳性率为100%，平均转化效率30%以上，转化周期为12~16周，整体操作简单，转化效率高，成本低廉，且转化不受季节限制，能规模化开展，为糜子的遗传改良提供了有效的技术手段。

Description

一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，涉及植物转基因生物技术育种，具体涉及一种农杆菌介导的糜子的高效遗传转化方法。
背景技术
糜子（Panicum miliaceum L.）属禾本科黍属，起源于我国的黄河流域，是人类最早驯化成功的粮食作物之一，具有抗旱、营养丰富、生育期短等优点。历史上我国糜子年种植面积曾高达一亿亩，是传统的粮食作物。糜子有粳糯之分，糯性称为黍子，主要分布在华北和东北地区，粳性称为糜子或稷，主要分布在西北地区。2021年全国糜子种植面积760万亩。同时，糜子已传播到国外，成为世界性的作物，作为粮食和饲草作物在俄罗斯（1240万亩）、乌克兰（390万亩）、美国（306万亩）及韩国、日本等地区都有种植。糜子中蛋白质含量约为13%，高于小麦、水稻和玉米，且富含多种氨基酸、维生素和矿物质，具有保健和药食同源的功能。糜子抗旱性强、生育期短，是重要的轮作和救灾作物。然而，与水稻、玉米等作物相比，糜子长期处于较少人为干预和选择的状态，驯化水平低，具有许多野生性状，如：丛生多分蘖，茎秆细软易倒伏；光周期反应尤其对短日照反应极其敏感，适应生长区域狭窄；成熟不一致等适应其自然生存繁衍的特性。这些野生性状严重阻碍了糜子产量潜力的发挥和大范围推广及应用，成为现代糜子遗传改良的重点！因此，如何加快糜子的育种进程并突破株型和适应性等瓶颈是当今糜子遗传育种亟待解决的关键问题。
目前的糜子育种方法落后，我国的糜子育成品种只有126个，其中系统选育方法和农家种认定占到了育成品种的63%。部分地区生产糜子过程中，仍以农家种占据主导地位。自2009年至2020年，来自全国9省（区）19家育种单位的89个糜子品种（系）参加了全国新品种联试，平均亩产由198.3kg提高到225.8kg，产量水平仅提升了13.9%，而同时期玉米的单产提高了20.1%，说明我国糜子总体育种水平偏低。我国糜子总体育种既缺少关键性种质的发现、创制和利用，又缺乏现代生物育种的应用和指导，难以实现精准育种。
现代基因工程技术的发展，为糜子的育种及品种改良提供了一种快速有效的途径。但与水稻、玉米、大豆、谷子等其它作物相比，糜子的遗传转化研究发展比较缓慢。目前为止，针对糜子的遗传转化方法仅有少量报道。其中，申请号为202111531566.3的中国发明专利申请公开了一种黍属植物的遗传转化方法，其采用基因枪轰击法进行转基因，获得了糜子的改性育种。但该方法可能引起突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在糜子中稳定表达的问题，同时还具有操作复杂、命中率低、转化效率低、育种成本高等缺点。
农杆菌介导转化技术是一种将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株的技术，具有外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定、整体操作简单、转化效率高、育种成本低等优点。但由于不同农杆菌的侵染能力不同、不同植株在侵染后愈伤的再生能力存在差异、脱分化能力快慢不一、转化效率和抗性植株比例不同等原因，针对不同种类的植株在进行农杆菌介导过程中选取的农杆菌菌株种类、受体系统等都存在较大差异。迄今为止，尚未见采用农杆菌介导法对糜子进行遗传转化的报道。因此，建立糜子的农杆菌介导的遗传转化方法，对糜子的育种及品种改良尤为重要。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法，所述方法是以糜子成熟种子诱导的胚性愈伤诱导组织作为受体材料，利用潮霉素抗性基因（hptII gene）作为筛选标记，采用农杆菌介导法进行遗传转化，用潮霉素进行抗性愈伤和植株筛选，经过再生过程的持续筛选，得抗性再生植株。
进一步的，所述方法包括以下步骤：
1）胚性愈伤诱导和农杆菌活化；
糜子成熟种子诱导糜子的胚性愈伤诱导组织；
取含有hptII基因筛选标记的植物表达载体的农杆菌菌株制备活化农杆菌菌液；
2）侵染和共培养
胚性愈伤诱导组织经活化农杆菌菌液侵染后，所得经侵染的糜子胚性愈伤组织倒在无菌滤纸上，吸干多余的菌液，并在超净台上适当吹干，转接到放有无菌滤纸的共培养培养基上进行暗培养，得共培养后糜子胚性愈伤组织；
3）抗性愈伤的筛选
将共培养后糜子胚性愈伤组织转移至含有抑制农杆菌的抗生素和筛选剂潮霉素的愈伤筛选培养基中，经两次继代后，得抗性愈伤组织；
4）分化和生根
抗性愈伤组织经两次分化培养，所得分化幼苗接入生根培养基中进行生根培养，待生根完成后，得抗性再生植株。
进一步的，步骤2）中，所述侵染是取胚性愈伤诱导组织，按每30mL活化农杆菌菌液中加入60~80块直径约为0.5cm胚性愈伤诱导组织的比例，添加至活化农杆菌菌液中，于19~20℃以100~120rpm轻摇振荡侵染40~60min；
在共培养培养基上暗培养的温度为19~20℃、时间为5~7d；
步骤3）中，所述两次继代的培养条件是先于24℃暗培养2周后，完成一次继代，转至光培养2周，完成第二次继代；
步骤4）中，所述生根培养是24°C采用12h/12h的光/暗培养方式进行生根培养。
进一步的，步骤4）中，所述两次分化培养是取抗性愈伤组织转移至第一阶段分化培养基中，于24°C以12h/12h的光/暗培养模式进行光培养2周，再转接至第二阶段分化培养基中，24°C以12h/12h的光/暗培养模式进行光培养2周，即得苗高约2cm的所述分化幼苗。
进一步的，所述第一阶段分化培养基是改良的MS培养基，MS微量元素和维生素加倍，并添加6-苄氨基嘌呤、kinetin、2,4-二氯苯氧乙酸、椰子水、抑制农杆菌的抗生素、筛选剂潮霉素、软骨素和植物凝胶；
具体地，所述第一阶段分化培养基中含有MS干粉4.4g/L、蔗糖30g/L、MS微量元素母液（1000x）1mL/L、MS维生素（1000x）1mL/L、6-苄氨基嘌呤0.003g/L、kinetin 0.003g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.001 g/L、椰子水5%（v/v）、抑制农杆菌的抗生素Timentin（特美汀）0.5g/L、筛选剂Hygromycin（潮霉素）0.012~0.02g/L、稀释5000倍的软骨素1mL/L和植物凝胶9.0g/L，pH值为5.8；
所述第二阶段分化培养基是MS微量元素和维生素加倍的MS培养基，并添加6-苄氨基嘌呤、kinetin、2,4-二氯苯氧乙酸、椰子水、抑制农杆菌的抗生素、筛选剂潮霉素、软骨素和植物凝胶；
具体地，所述第二阶段分化培养基中含有MS干粉4.4g/L、蔗糖20g/L、MS微量元素母液（1000x）1mL/L、MS维生素（1000x）1mL/L、6-苄氨基嘌呤0.001g/L、kinetin 0.001g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.0005g/L、椰子水5%（v/v）、抑制农杆菌的抗生素Timentin（特美汀）0.5g/L、筛选剂Hygromycin（潮霉素）0.012~0.02g/L、稀释5000倍的软骨素1mL/L和植物凝胶9.0 g/L，pH值为5.8。
进一步的，糜子成熟种子诱导糜子的胚性愈伤诱导组织的过程包括以下步骤：
选取经休眠处理的糜子干燥成熟种子，去除种皮，用有效浓度为1~3wt%的次氯酸钠溶液和吐温20溶液消毒灭菌处理20~30min，无菌水清洗，将种子接种于胚性愈伤诱导培养基上，接种时注意种子芽点朝上，芽点不直接接触培养基，先在24℃恒温的环境中以12h/12h的光/暗培养模式进行光照发芽，湿度为50~60%，发芽后转为在24℃恒温的环境中暗培养，湿度为50~60%，暗培养20~30d后从芽点处挑取诱导的胚性愈伤组织，转接于新的胚性愈伤诱导培养基，继续培养7d后，即得所述胚性愈伤诱导组织；
所述胚性愈伤诱导培养基是改良的MS培养基，添加微量元素ZnSO4･7H2O、CuSO4･5H2O、kinetin、2,4-二氯苯氧乙酸和植物凝胶；
具体地，所述胚性愈伤诱导培养基中含有MS干粉4.4g/L、蔗糖30g/L、ZnSO4･7H2O0.035g/L、CuSO4･5H2O 0.0006g/L、kinetin 0.0005g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.002g/L和植物凝胶9.0g/L，pH值为5.8。
进一步的，步骤2）中，所述共培养培养基是大量元素减半的MS培养基，并添加蔗糖、吗啉乙磺酸、2,4-二氯苯氧乙酸、kinetin、乙酰丁香酮和植物凝胶；
具体地，所述共培养培养基中MS干粉2.2g/L、蔗糖30g/L、吗啉乙磺酸1.0g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.002g/L、kinetin 0.0005 g/L、Ace（乙酰丁香酮）0.04 g/L和Gelzan（植物凝胶）4.0 g/L，pH值为5.4；
步骤3）中，所述愈伤筛选培养基是MS培养基，并添加微量元素ZnSO4･7H2O、CuSO4･5H2O、kinetin、2,4-二氯苯氧乙酸、蔗糖、植物凝胶、抑制农杆菌的抗生素和筛选剂潮霉素；
具体地，所述愈伤筛选培养基中含有MS干粉4.4g/L、蔗糖30g/L、ZnSO4･7H2O0.035g/L、CuSO4･5H2O 0.0006g/L、kinetin 0.0005g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.002g/L、植物凝胶9.0g/L、抑制农杆菌的抗生素Timentin（特美汀）0.5 g/L和筛选剂Hygromycin（潮霉素）0.02~0.03g/L，pH值为5.8；
步骤4）中，所述生根培养基是大量元素减半的MS培养基，MS微量元素和维生素加倍，并添加蔗糖、3-吲哚丁酸、抑制农杆菌的抗生素、筛选剂潮霉素和植物凝胶；
具体地，所述生根培养基中含有MS干粉2.2g/L、蔗糖15~20g/L、MS微量元素母液（1000x）1mL/L、MS维生素（1000x）1mL/L、3-吲哚丁酸0.0005g/L、抑制农杆菌的抗生素Timentin（特美汀）0.5g/L、筛选剂Hygromycin（潮霉素）0.012~0.02g/L和植物凝胶9.0g/L，pH值为5.8。
进一步的，所述抗性再生植株经PCR鉴定，检测结果为阳性，即为抗性转基因苗；
具体PCR鉴定过程包括：
所述抗性再生植株经栽培，剪取叶片提取DNA，利用潮霉素抗性基因引物（HPT）和载体特异引物（M1）进行PCR检测；
潮霉素抗性基因引物（HPT）的引物序列为：
HPT-F：5'-GAAGTGCTTGACATTGGGGAGT-3'，
HPT-R：5'-AGATGTTGGCGACCTCGTATT-3'，产物大小为472 bp；
载体特异引物（M1）的引物序列为：
M1-F：5'-GAAGTGCAGGTCAAACCTTGAC-3'，
M1-R：5'-CTCTCTCGTAGTTCCTCTGATC-3'，产物大小为216 bp；
优选的，PCR检测使用的酶为普通Taq Mix，反应体系为：无菌水9.5 μL，引物（10 μM）各1 μL，Taq Mix 12.5 μL，DNA模板 1 μL；
PCR扩增程序为：95°C预变性5 min；95°C变性30 s，60°C 退火30 s，72°C延伸30s，进行35个循环；最后72°C延伸7 min。
进一步的，步骤1）中，所述活化农杆菌菌液的具体制备方法如下：
取含有hptII基因筛选标记的植物表达载体的农杆菌菌株，置于含有羧苄西林和载体相应的抗生素的农杆菌培养基中，24℃暗培养，长出单菌落；或者，取含有hptII基因筛选标记的植物表达载体的农杆菌菌株，置于含有羧苄西林和载体相应的抗生素的培养液中，24℃振荡培养，长出单菌落；
挑取多个单菌落同时置于含有羧苄西林和载体相应的抗生素的培养液中，19~20℃振荡培养16~24h，得农杆菌菌液；或者，挑取多个单菌落同时置于含有羧苄西林和载体相应的抗生素的农杆菌培养基上，19~20℃暗培养3~5d，得农杆菌菌块；
取农杆菌菌液或者农杆菌菌块加至侵染液中，悬浮处理，得到农杆菌菌悬液，再用侵染液将所得农杆菌菌悬液的浓度调整到OD600值为0.5~0.7，然后经活化，即得所述活化农杆菌菌液。
进一步的，所述农杆菌为AGL1农杆菌；
所述农杆菌培养基中含有羧苄西林和载体相应的抗生素；
所述培养液中含有羧苄西林和载体相应的抗生素；
所述侵染液是大量元素减半的MS培养基，并添加蔗糖、吗啉乙磺酸、乙酰丁香酮和表面活性剂；
具体地，所述侵染液中含有MS干粉2.2g/L、蔗糖30g/L、吗啉乙磺酸0.5~1.0g/L、Ace（乙酰丁香酮）0.02~0.06g/L和质量体积比为0.1%的表面活性剂Synperonic（泊洛沙姆），pH值为5.4；
所述活化是于19~20℃以100~120rpm的低速进行轻摇振荡培养2~5h。
本发明的一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法的有益效果为：
本发明在国内外首次成功建立了糜子的农杆菌介导的遗传转化方法，以糜子的成熟种子作为外植体，诱导胚性愈伤诱导组织，然后利用潮霉素抗性基因hpt II筛选抗性愈伤组织和抗性再生植株，经过再生过程的持续筛选（抗性愈伤的筛选、分化培养筛选和生根培养筛选）后，获得转基因植株（即抗性再生植株），PCR鉴定的阳性率为100%，平均转化效率30%以上；
本发明的糜子的遗传转化效率高，育种成本低，且遗传转化工作不受季节限制，只要有种子就能开展，转化周期短，只需要12~16周，节约了糜子的育种时间，有效提高了糜子的生物技术育种效率。
附图说明
图1为本发明实施例1中的遗传转化过程图，其中A图为冀黍5号种子诱导发芽，B图为冀黍5号种子诱导胚性愈伤前期，C图为冀黍5号种子诱导胚性愈伤后期，D为冀黍5号胚性愈伤的筛选后期，E为冀黍5号抗性胚性愈伤的分化生根。
图2为本发明实施例1中植物表达载体pRLG103终载体结构图；
图3为本发明实施例1中的冀黍5号的部分抗性再生植株；
图4为本发明实施例1中的部分抗性再生植株的PCR鉴定图，A为HPT，B为M1，1-19分别为19株冀黍5号转基因所得抗性再生植株，K-为阴性对照，K+为质粒阳性对照，K1为DNA提取对照，K2为空白对照，M为DL5000 DNA Marker，条带从下往上依次为100、250、500、750、1000、1500、2000、3000和5000 bp。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
另，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂未注明生产厂商者，均为常规可购买产品。
实施例1 一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法
本实施例为一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法，具体方法包括依次进行的以下步骤：
1）胚性愈伤诱导和农杆菌活化；
11）糜子的胚性愈伤诱导组织的制备
胚性愈伤诱导培养基中含有MS干粉4.4g/L、蔗糖30 g/L、ZnSO4･7H2O 0.035g/L、CuSO4･5H2O 0.0006g/L、kinetin 0.0005 g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.002g/L和植物凝胶9.0g/L，pH值为5.8。
选取经休眠处理的糜子（冀黍5号）的干燥成熟种子，去除种皮，将约2g种子装入50mL无菌离心管中，用20mL有效浓度为3%的次氯酸钠溶液和50μL吐温20溶液，消毒灭菌处理20min，然后用无菌水清洗多次后，将种子接种于胚性愈伤诱导培养基上，接种时注意种子芽点朝上，芽点不直接接触培养基，每皿培养基接种子约20个，培养温度为24℃恒温培养，湿度55%，培养过程中先以12h/12h的光/暗培养模式进行光照发芽，发芽后转为暗培养，暗培养28d后从芽点处挑取诱导的胚性愈伤组织，糜子的胚性愈伤组织致密，非水渍状，转接于新的胚性愈伤诱导培养基，继续暗培养7d后转化，得糜子的胚性愈伤诱导组织，见图1中的A图、B图和C图，其中图1中的A图为冀黍5号种子诱导发芽，B图为冀黍5号种子诱导胚性愈伤前期，C图为冀黍5号种子诱导胚性愈伤后期。
12）活化农杆菌的制备
121）农杆菌菌液的制备
LB培养基中含有蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L和NaCl 10.0g/L。
取LB培养基，每升加入AGL1农杆菌特异的Carbenicillin（羧苄西林）50mg和载体相应的抗生素Kanamycin（卡那霉素）50mg，得农杆菌培养基。
本实施例中，从-80℃冰箱取出携带含hptII基因筛选标记的植物表达载体pRLG103终载体（如图2所示，来自Daniel Voytas实验室）的AGL1农杆菌菌株，置于农杆菌培养基上涂板活化，24℃暗培养3d，长出单菌落；
挑取3个以上单菌落，同时置于含0.05g/L的Carbenicillin和0.05 g/LKanamycin的LB培养液中，于20℃以200rpm进行振荡培养24h，离心，得新鲜的农杆菌菌液。
或者也可以采用摇菌的方式进行培养单菌落，具体是：从-80℃冰箱取出携带含hptII基因筛选标记的植物表达载体pRLG103终载体（如图2所示，来自Daniel Voytas实验室）的AGL1农杆菌菌株，置于含0.05g/L的Carbenicillin和0.05 g/L Kanamycin的LB培养液中活化，24℃振荡培养（暗培养），长出单菌落；
同时也可以采用划板的方式进行农杆菌菌块培养代替新鲜农杆菌菌液的培养，具体是：挑取3个以上单菌落，在农杆菌培养基上涂板，于20℃暗培养，得新鲜的农杆菌菌块。
122）农杆菌菌液的活化
侵染液中含有MS干粉2.2g/L、蔗糖30g/L、吗啉乙磺酸1.0g/L、Ace（乙酰丁香酮）0.04g/L和质量体积比为0.1%的表面活性剂Synperonic（泊洛沙姆），pH值为5.4。
选取新鲜的农杆菌菌液或者新鲜的农杆菌菌块加至侵染液中，摇晃进行悬浮处理，得农杆菌菌悬液，并用侵染液将农杆菌菌悬液的浓度调整到OD600值为0.6，然后于20℃以100rpm轻摇低速振荡培养3h进行活化，得活化农杆菌菌液。
2）侵染和共培养
共培养培养基中含有MS干粉2.2g/L、蔗糖30g/L、吗啉乙磺酸1.0g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.002g/L、kinetin 0.0005 g/L、Ace（乙酰丁香酮）0.04 g/L和Gelzan（植物凝胶）4.0 g/L，pH值为5.4。
将糜子的胚性愈伤诱导组织加至活化农杆菌菌液中，按每30mL活化农杆菌菌液中加入60~80块直径约为0.5cm糜子的胚性愈伤诱导组织的比例添加，于20℃以120rpm轻摇振荡侵染60min（振荡侵染采用暗培养），侵染完成后，倒掉菌液，得经侵染的糜子胚性愈伤组织。
将经侵染的糜子胚性愈伤组织倒在无菌滤纸上，吸干多余的菌液，并在超净台上适当吹干，约半小时，然后转接到放有无菌滤纸的共培养培养基上，20℃暗培养6d，得共培养后糜子胚性愈伤组织（即转hpt II筛选标记基因的胚性愈伤组织）。
3）抗性愈伤的筛选
愈伤筛选培养基中含有MS干粉4.4g/L、蔗糖30g/L、ZnSO4･7H2O 0.035g/L、CuSO4･5H2O 0.0006g/L、kinetin 0.0005g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.002g/L、植物凝胶9.0g/L、抑制农杆菌的抗生素Timentin（特美汀）0.5 g/L和筛选剂Hygromycin（潮霉素）0.025g/L，pH值为5.8。
将共培养后糜子胚性愈伤组织转移至愈伤筛选培养基上，每皿约20~30粒共培养后糜子胚性愈伤组织，24°C暗培养2周，完成一次继代，转至光照培养2周（光照培养是于24℃采用12h/12h光/暗培养），完成第二次继代，整个共培养筛选过程继代两次，每2周继代一次，共培养筛选总用时1个月，得抗性愈伤组织（如图1中的D图所示）。
4）分化和生根
第一阶段分化培养基中含有MS干粉4.4g/L、蔗糖30g/L、MS微量元素母液（1000x）1mL/L、MS维生素（1000x）1mL/L、6-苄氨基嘌呤0.003g/L、kinetin 0.003g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.001 g/L、椰子水5%（v/v）、抑制农杆菌的抗生素Timentin（特美汀）0.5g/L、筛选剂Hygromycin（潮霉素）0.015g/L、稀释5000倍的软骨素1mL/L和植物凝胶9.0g/L，pH值为5.8。
第二阶段分化培养基中含有MS干粉4.4g/L、蔗糖20g/L、MS微量元素母液（1000x）1mL/L、MS维生素（1000x）1mL/L、6-苄氨基嘌呤0.001g/L、kinetin 0.001g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.0005g/L、椰子水5%（v/v）、抑制农杆菌的抗生素Timentin（特美汀）0.5g/L、筛选剂Hygromycin（潮霉素）0.015 g/L、稀释5000倍的软骨素1mL/L和植物凝胶9.0 g/L，pH值为5.8。
其中，本实施例中的软骨素为北京璞棠生物科技有限公司生产的硫酸软骨素钠。
生根培养基中含有MS干粉2.2g/L、蔗糖15g/L、MS微量元素母液（1000x）1mL/L、MS维生素（1000x）1mL/L、3-吲哚丁酸0.0005g/L、抑制农杆菌的抗生素Timentin（特美汀）0.5g/L、筛选剂Hygromycin（潮霉素）0.015g/L和植物凝胶9.0g/L，pH值为5.8。
先从愈伤筛选培养基中将抗性愈伤组织转移至第一阶段分化培养基中，于24°C采用12h/12h的光/暗培养方式进行光培养2周，再转接至第二阶段分化培养基中，24°C采用12h/12h的光/暗培养方式进行光培养2周，得苗高约2cm的分化幼苗。
将分化幼苗接入生根培养基中，于24°C采用12h/12h的光/暗培养方式进行生根培养1~2周，具体生根培养时间根据幼苗大小决定，待生根完成后，得糜子的抗性再生植株，即为抗性苗（如图1中E图所示），整个转化周期约为12~16周。
5）抗性再生植株的PCR鉴定
糜子的抗性再生植株用水洗掉培养基，移栽到植物培养箱中利用营养土进行栽培（如图3所示），栽培过程中待转基因植株长到20cm高后，剪取叶片提取DNA，用潮霉素抗性基因hptII的标准引物进行PCR检测，检测结果为阳性，即为抗性转基因苗。
将抗性转基因苗进行栽培，收获种子后播种到添加筛选剂Hygromycin（潮霉素）0.015g/L的1/2MS培养基上，后代种子大部分能在抗性培养基上正常发芽生根长出植株。
具体PCR检测过程如下：
在糜子的抗性再生植株培养过程中，糜子的抗性再生植株长到20cm高时，剪取叶片，用植物基因组DNA提取试剂盒（天根DP305）提取其基因组DNA。
以上述DNA为模板，对抗性再生植株进行了潮霉素抗性基因引物（HPT）和载体特异引物（M1）的PCR检测，设4个对照，包括以野生型冀黍5号的基因组DNA为模板的阴性对照K-、以质粒pRLG103终载体为模板的阳性对照K+、以无菌水代替植株提取的溶液为模板的DNA提取对照K1和以无菌水为模板的空白对照K2。使用的检测引物见表1。PCR检测使用的酶为普通Taq Mix，反应体系为：无菌水9.5μL、引物（10μM）各1μL、Taq Mix 12.5μL、DNA模板1μL。PCR扩增程序为：95°C预变性5min；95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，进行35个循环；最后72°C延伸7min。PCR扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳分离检测。
表1 糜子抗性再生植株的检测引物序列
PCR产物电泳结果如图4所示，其中A为HPT，B为M1，1-19分别为19株冀黍5号转基因所得抗性再生植株，K-为阴性对照，K+为质粒阳性对照，K1为DNA提取对照，K2为空白对照，M为DL5000 DNA Marker，条带从下往上依次为100、250、500、750、1000、1500、2000、3000和5000 bp。可以看出，糜子的抗性再生植株都能扩增出目的基因HPT和M1，而阴性对照K-、DNA提取对照K1和空白对照K2均未扩增出目的条带，说明本发明抗性再生植株具有潮霉素抗性。
根据多个批次的糜子转化实验统计糜子的抗性再生植株的筛选效率和转化效率。
其中，筛选效率（%）=PCR阳性的抗性再生植株数量/抗性再生植株数量×100%；
转化效率（%）=PCR阳性的抗性再生植株数量/胚性愈伤诱导组织数量×100%；
具体统计结果如表2所示。
表2 糜子转化的筛选效率及转化效率统计结果一览表
由表2可以看出，本发明的方法培育的糜子的抗性再生植株的筛选效率为100%、平均转化效率约为30.4%。
实施例2~4 一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法
实施例2~4分别为一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法，它们的步骤、工艺参数及培养基中成分种类和含量与实施例1基本相同，不同之处仅在于培养基中部分成分用量及工艺参数的不同，具体不同之处详见表3：
表3 实施例2~4中工艺参数一览表
其中，实施例2~4其它部分的步骤、工艺参数及培养基中成分种类和含量，与实施例1相同。
实施例2~4中的转基因植株利用苗期分子检测方法，检测的结果也与实施例1相同，在此不再赘述。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (8)

1.一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1）胚性愈伤诱导和农杆菌活化；
糜子成熟种子诱导糜子的胚性愈伤诱导组织；
诱导过程中，先接种于胚性愈伤诱导培养基上，先光照发芽，发芽后进行暗培养20~30d，从芽点处挑取组织致密、非水渍状的胚性愈伤组织，再转接于新的胚性愈伤诱导培养基，继续培养7d后，得所述胚性愈伤诱导组织；
取含有hptII基因筛选标记的植物表达载体的农杆菌菌株制备活化农杆菌菌液；
所述农杆菌为AGL1农杆菌；
制备活化农杆菌菌液过程中，使用的侵染液是大量元素减半的MS培养基，并添加蔗糖、吗啉乙磺酸、乙酰丁香酮和表面活性剂，pH值为5.4；
2）侵染和共培养
胚性愈伤诱导组织经活化农杆菌菌液侵染后，所得经侵染的糜子胚性愈伤组织转接到共培养培养基上进行暗培养，得共培养后糜子胚性愈伤组织；
3）抗性愈伤的筛选
将共培养后糜子胚性愈伤组织转移至含有抑制农杆菌的抗生素和筛选剂潮霉素的愈伤筛选培养基中，经两次继代后，得抗性愈伤组织；
所述愈伤筛选培养基是MS培养基，并添加微量元素ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、kinetin、2,4-二氯苯氧乙酸、蔗糖、植物凝胶、抑制农杆菌的抗生素和筛选剂潮霉素；其中潮霉素的浓度为0.02~0.03g/L；
4）分化和生根
抗性愈伤组织经两次分化培养，所得分化幼苗接入生根培养基中进行生根培养，待生根完成后，得抗性再生植株；
所述两次分化培养是取抗性愈伤组织转移至第一阶段分化培养基中进行培养，再转接至第二阶段分化培养基中进行培养，即得所述分化幼苗；
所述第一阶段分化培养基是改良的MS培养基，MS微量元素和维生素加倍，并添加6-苄氨基嘌呤、kinetin、2,4-二氯苯氧乙酸、椰子水、抑制农杆菌的抗生素、筛选剂潮霉素、软骨素和植物凝胶；其中，潮霉素的浓度为0.012~0.02g/L、6-苄氨基嘌呤的浓度为0.003g/L、kinetin的浓度为0.003g/L、2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.001 g/L；
所述第二阶段分化培养基是MS微量元素和维生素加倍的MS培养基，并添加6-苄氨基嘌呤、kinetin、2,4-二氯苯氧乙酸、椰子水、抑制农杆菌的抗生素、筛选剂潮霉素、软骨素和植物凝胶；其中，潮霉素的浓度为0.012~0.02g/L、6-苄氨基嘌呤的浓度为0.001g/L、kinetin的浓度为0.001g/L、2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.0005g/L；
所述生根培养基是大量元素减半的MS培养基，MS微量元素和维生素加倍，并添加蔗糖、3-吲哚丁酸、抑制农杆菌的抗生素、筛选剂潮霉素和植物凝胶；其中潮霉素的浓度为0.012~0.02g/L。
2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法，其特征在于，
步骤2）中，所述侵染是取胚性愈伤诱导组织添加至活化农杆菌菌液中，轻摇振荡侵染；
步骤3）中，所述两次继代的培养条件是先于暗培养条件下完成一次继代后，转至光培养条件下完成第二次继代；
步骤4）中，所述生根培养是采用光/暗培养方式进行生根培养。
3.根据权利要求1或2所述的一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法，其特征在于，步骤4）中，所述两次分化培养是取抗性愈伤组织转移至第一阶段分化培养基中，光培养2周，再转接至第二阶段分化培养基中，光培养2周，即得所述分化幼苗。
4.根据权利要求1或2所述的一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法，其特征在于，糜子成熟种子诱导糜子的胚性愈伤诱导组织的过程包括以下步骤：
选取糜子成熟种子，去除种皮，消毒灭菌处理，无菌水清洗，将种子接种于胚性愈伤诱导培养基上，光照发芽，发芽后转为暗培养，从芽点处挑取诱导的胚性愈伤组织，转接于新的胚性愈伤诱导培养基，继续培养，即得所述胚性愈伤诱导组织；
所述胚性愈伤诱导培养基是改良的MS培养基，添加微量元素ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、kinetin、2,4-二氯苯氧乙酸和植物凝胶。
5.根据权利要求1或2所述的一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法，其特征在于，
步骤2）中，所述共培养培养基是大量元素减半的MS培养基，并添加蔗糖、吗啉乙磺酸、2,4-二氯苯氧乙酸、kinetin、乙酰丁香酮和植物凝胶。
6.根据权利要求1或2所述的一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法，其特征在于，所述抗性再生植株经PCR鉴定，检测结果为阳性，即为抗性转基因苗；
具体PCR鉴定过程包括：
所述抗性再生植株经栽培，剪取叶片提取DNA，利用潮霉素抗性基因引物和载体特异引物进行PCR检测。
7.根据权利要求1或2所述的一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法，其特征在于，
步骤1）中，所述活化农杆菌菌液的具体制备方法如下：
取含有hptII基因筛选标记的植物表达载体的农杆菌菌株，置于含有羧苄西林和载体相应的抗生素的农杆菌培养基中，暗培养，长出单菌落；或者，取含有hptII基因筛选标记的植物表达载体的农杆菌菌株，置于含有羧苄西林和载体相应的抗生素的培养液中，振荡培养，长出单菌落；
挑取多个单菌落同时置于含有羧苄西林和载体相应的抗生素的培养液中，振荡培养，得农杆菌菌液；或者，挑取多个单菌落同时置于含有羧苄西林和载体相应的抗生素的农杆菌培养基上，暗培养，得农杆菌菌块；
取农杆菌菌液或者农杆菌菌块加至侵染液中，悬浮处理，得到农杆菌菌悬液，再用侵染液将所得农杆菌菌悬液调整至合适的浓度，然后经活化，即得所述活化农杆菌菌液。
8.根据权利要求7所述的一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法，其特征在于，
所述农杆菌培养基中含有羧苄西林和载体相应的抗生素；
所述培养液中含有羧苄西林和载体相应的抗生素；
所述活化是采用轻摇振荡培养。
CN202311246503.2A 2023-09-26 2023-09-26 一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法 Active CN117004649B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311246503.2A CN117004649B (zh) 2023-09-26 2023-09-26 一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311246503.2A CN117004649B (zh) 2023-09-26 2023-09-26 一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117004649A CN117004649A (zh) 2023-11-07
CN117004649B true CN117004649B (zh) 2024-01-23

Family

ID=88563937

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311246503.2A Active CN117004649B (zh) 2023-09-26 2023-09-26 一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117004649B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117965620B (zh) * 2024-04-01 2024-07-09 中国热带农业科学院三亚研究院 一种农杆菌介导的棕榈科植物愈伤组织瞬时转化方法
CN118703692B (zh) * 2024-08-27 2025-02-11 中国热带农业科学院三亚研究院 单拷贝的糜子基因及利用其检测糜子中外源基因插入拷贝数的方法
CN119220563B (zh) * 2024-12-04 2025-03-18 中国热带农业科学院三亚研究院 一种调控糜子香味的badh2基因、应用及方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104004784A (zh) * 2014-05-23 2014-08-27 刘颖慧 一种利用谷子成熟种子进行快速遗传转化的方法
CN108588002A (zh) * 2018-05-03 2018-09-28 中国农业科学院作物科学研究所 获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织和遗传转化的方法
CN110699379A (zh) * 2019-12-02 2020-01-17 山西省农业科学院生物技术研究中心 一种农杆菌介导的以高粱成熟胚为外植体诱导愈伤组织的遗传转化方法
CN116262931A (zh) * 2021-12-14 2023-06-16 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一种黍属植物的遗传转化方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150113681A1 (en) * 2013-10-23 2015-04-23 Syngenta Participations Ag Composition and method for enhancing plant transformation

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104004784A (zh) * 2014-05-23 2014-08-27 刘颖慧 一种利用谷子成熟种子进行快速遗传转化的方法
CN108588002A (zh) * 2018-05-03 2018-09-28 中国农业科学院作物科学研究所 获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织和遗传转化的方法
CN110699379A (zh) * 2019-12-02 2020-01-17 山西省农业科学院生物技术研究中心 一种农杆菌介导的以高粱成熟胚为外植体诱导愈伤组织的遗传转化方法
CN116262931A (zh) * 2021-12-14 2023-06-16 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一种黍属植物的遗传转化方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
农杆菌介导谷子遗传转化的研究进展;李颜方;赵晋锋;王高鸿;杜艳伟;张正;余爱丽;;中国农学通报(36);第66-72页 *
李颜方 ; 赵晋锋 ; 王高鸿 ; 杜艳伟 ; 张正 ; 余爱丽 ; .农杆菌介导谷子遗传转化的研究进展.中国农学通报.2016,(36),第66-72页. *
糜子愈伤诱导及再分化最适条件研究;王春芳等;中国农学通报;第36卷(第09期);第94-99页 *
郭振飞主编.牧草生物技术.中国农业大学出版社,2011,第132-136页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN117004649A (zh) 2023-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN117004649B (zh) 一种农杆菌介导的糜子高效遗传转化方法
US20210269816A1 (en) Method of Obtaining Multileaflet Medicago Sativa Materials by Means of MsPALM1 Artificial Site-Directed Mutants
CN113388526B (zh) 一种内生真菌fo-r20及其应用
CN104004781A (zh) 一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法
CN103834684A (zh) 一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法
CN107022561B (zh) 用于培育转基因玉米的培养基及培养方法
US20220386625A1 (en) Application of endophytic falciphora oryzae fo-r20 in controlling panicle blast
CN111893133A (zh) 一种农杆菌介导的菜心遗传转化方法
CN101768604A (zh) 一种高效快速的甘蔗转基因方法
CN101006768B (zh) 农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法
CN102433356A (zh) 农杆菌介导的玉米成熟种子胚的转基因方法
CN101857875B (zh) 农杆菌介导对麻风树进行基因转化的方法
CN110699379B (zh) 一种农杆菌介导的以高粱成熟胚为外植体诱导愈伤组织的遗传转化方法
CN104004783B (zh) 一种提高棉花转基因效率的方法
CN101928724A (zh) 一种利用叶绿体转基因技术的机械化杂交稻制种方法
US11365423B2 (en) Method of obtaining multileaflet Medicago sativa materials by means of MsPALM1 artificial site-directed mutants
CN107475287B (zh) 一种茄子遗传转化方法
CN117965557B (zh) 一种水稻株高基因的应用及其制备方法
CN113604497A (zh) 一种禾本科植物的遗传转化方法
CN118562828A (zh) 一种生菜LsIQD16基因及其应用
CN101233824B (zh) 马铃薯微型薯的遗传转化方法
CN105941163A (zh) 一种适合作为转化受体的玉米自交系的选育方法
CN1125878C (zh) 一种建立玉米转基因受体体系的方法及受体体系的应用
CN102524064B (zh) 麻疯树遗传转化苗的复壮及生根的培养方法
CN113273458A (zh) 一种提高水稻镉耐受性和降低水稻谷粒中镉含量的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant