CN101233824B - 马铃薯微型薯的遗传转化方法 - Google Patents
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Abstract
一种马铃薯微型薯的高效遗传转化方法，它包括以下步骤：(1)马铃薯微型薯的准备、(2)菌株的活化及菌种的准备、(3)侵染和共培养、(4)转基因植株再生和(5)转基因植株的检测，建立了一个适合多种马铃薯品种的微型薯遗传转化体系，该体系以微型薯为外植体，经农杆菌侵染后通过体细胞胚胎发生途径直接分化出抗性芽，经生根诱导后获得完整再生植株，转化频率均为50％以上，达到用马铃薯微型薯为转化受体，建立一个高效及适应性广的马铃薯遗传转化体系的目的。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特指一种马铃薯微型薯的高效遗传转化方法。
背景技术
在全世界所有的粮食作物中，马铃薯的总产量排名第四，仅次于玉米、水稻和小麦，具有生育期短、产量高、适应性强、营养全面、产业链长等特点，因此越来越受到全世界的广泛重视。由于马铃薯普通栽培种是同源四倍体，遗传组成的复杂性及遗传背景的狭窄是制约马铃薯育种发展的主要因素，常规育种进展缓慢。
由于转基因技术可以打破不同种属，甚至不同生物之间基因交流的障碍，突破了远缘杂交不亲和的阻碍，丰富了抗源基因，且有可控性强，育种周期短，生产成本低，不污染环境等优点，从而为马铃薯育种开辟了新途径。
在马铃薯转基因操作中，目前较常用且转化效率较高的是农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法。自从1983年第一例农杆菌介导的转基因马铃薯问世以来(Ooma G.等)，已有许多实验表明用农杆菌侵染法可以获得正常的马铃薯转基因植株。
农杆菌介导的马铃薯遗传转化技术已日趋成熟，但还没有完全程序化。
目前使用多种马铃薯外植体进行的农杆菌遗传转化包括茎段、叶片、薯块、下胚轴、子叶、愈伤组织、试管薯、原生质体等，均已获得成功(Kawchu等，1991；Lawson等，1992；Filho等，1994；Gulina等，1994；Farran等，2002)。
但仍存在诸多问题亟待解决。很多研究显示，针对不同的基因型、不同的外植体，马铃薯遗传转化效率有显著差异(Herman等，1989；De Block等，1988；Dale等，1995；王春林，1990)。
多数遗传转化由于程序复杂，先经过愈伤组织诱导，再进行分化诱导出抗性芽，最后进行生根培养得到完整植株，周期较长，一般为5-8周，且转化频率多低于20％(Visser等，1989；Trugillo，2001；Beaujean A.等，1998)。
发明内容
本发明的目的是提供一种马铃薯微型薯的高效遗传转化方法，通过建立一个适合多种马铃薯品种的微型薯转基因体系，该体系经体细胞胚胎发生途径直接分化出抗性芽，经生根诱导后获得完整再生植株，转化频率均为50％以上，达到利用马铃薯微型薯为转化受体，建立一个高效适应性广的马铃薯遗传转化系统的目的。
本发明的目的是这样实现的：一种马铃薯微型薯的遗传转化方法，它包括以下步骤：
(1)马铃薯微型薯的诱导
取脱毒试管苗，经过炼苗后，从培养基中连根拔出，移栽于温室，经过60-80d的生长，微型薯达到2-5g重，即可收获，晾干后保存；
(2)菌株的活化及菌种的准备
取低温甘油保存的农杆菌，涂布于固体Yeast Extract Peptone培养基上，28℃下倒置暗培养，使其活化；3d后挑取单菌落接种于5ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L链霉素的Yeast Extract Peptone液体培养基中，28℃下160rpm/min振荡培养过夜；取700μl该菌液接种于70ml相同的Yeast Extract Peptone液体培养基中，振荡培养14-18h后，将达到对数生长期的菌液置于离心管，4000rpm离心5min，弃去上清，重悬于Murashige和Skoog液体培养基，稀释至OD值0.5-0.8；
(3)侵染和共培养
取收获后打破休眠的脱毒微型薯，在无菌条件下用70％的酒精浸泡30s、0.1％的升汞浸泡10min、无菌水清洗5次后，去皮切成厚度为1mm的薄片，用制备好的农杆菌菌液侵染薯块5min，然后用无菌滤纸将多余菌液吸去，接种于含有3.0mg/L玉米素和1.0mg/L吲哚乙酸的Murashige和Skoog培养基上，共培养2d，培养条件为温度24℃，黑暗；
(4)转基因植株再生培养
将共培养后的微型薯薯块用无菌水清洗2-3次，接种于含有玉米素、吲哚乙酸、进口头孢噻肟钠和卡那霉素的Murashige和Skoog培养基中进行植株再生培 养，培养条件为24℃，光照强度1500Lux，每天16h光照，8h黑暗；在再生培养基中经过45d的培养后，将产生的健壮绿色丛生芽切下，转移至添加头孢噻肟钠和卡那霉素的Murashige和Skoog培养基中进行生根诱导，使其形成完整的马铃薯转基因植株，培养条件为温度24℃，光照强度1500Lux，每天16h光照，8h黑暗；
(5)转基因植株的检测
采用PCR、Southern杂交及生物学方法鉴别再生植株，最终获得马铃薯转基因植株。
该步骤(1)的脱毒试管苗生长15～20d进行移栽。该步骤(2)农杆菌选用LBA4404或EHA101。该步骤(3)要求使用的马铃薯微型薯打破休眠时间为3个月。该步骤(4)添加的进口头孢噻肟钠的浓度为150mg/L，卡那霉素的浓度为50mg/L，玉米素的浓度为3.0mg/L，I从的浓度为1.0mg/L。
本发明相对于现有的技术而言所具有的有益效果：
1.转化效率高。
到目前为止的所有报道，其遗传转化率低于20％，而本发明的转化频率为50％以上，比现有技术提高了2.5倍以上。(转化频率＝再生芽的外植体数/转化的薯块外植体总数×100％)
2.适应范围广。
本发明的马铃薯微型薯遗传转化系统适用于多种马铃薯品种，而现有的遗传转化体系只适用于少量马铃薯品种。
3.操作比较简便。
本发明的马铃薯微型薯遗传转化系统操作简便，生产效率高，成本低廉。
4.本发明易于掌握，重复性高。
本发明使用微型薯外植体，容易获得，一次可生产大量转基因植株，适于工厂化生产。
具体实施方式
本发明的方法主要包括以下几个方面：
1、马铃薯微型薯的诱导
取生长15-20d的脱毒试管苗，经过炼苗后，从培养基中连根拔出，移栽于温室，经过60-80d的生长，微型薯达到2-5g重，即可收获，晾干后保存。
2、菌株的活化及菌种的准备
取低温甘油保存的农杆菌，涂布于固体Yeast Extract Peptone培养基上，28℃下倒置暗培养，使其活化。3d后挑取单菌落接种于5ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L链霉素的Yeast Extract Peptone液体培养基中，28℃下160rpm/min振荡培养过夜。取700μl该菌液接种于70ml相同的Yeast Extract Peptone液体培养基中，振荡培养14-18h后，将达到对数生长期的菌液置于离心管，4000rpm离心5min，弃去上清，重悬于Murashige和Skoog液体培养基，稀释至OD值0.5-0.8。
3、侵染和共培养
取收获后90d打破休眠的脱毒微型薯，在无菌条件下用70％的酒精浸泡30s、0.1％的升汞浸泡10min、无菌水清洗5次后，去皮切成厚度为1mm的薄片，用制备好的农杆菌菌液侵染薯块5min，然后用无菌滤纸将多余菌液吸去，接种于含有3.0mg/L玉米素和1.0mg/L吲哚乙酸的Murashige和Skoog培养基上，共培养2d，培养条件为温度24℃，黑暗。
4、转基因植株再生培养
将共培养后的微型薯薯块用无菌水清洗2-3次，接种于含有3.0mg/L玉米素、1.0mg/L吲哚乙酸、150mg/L的进口头孢噻肟钠和50mg/L卡那霉素的Murashige和Skoog培养基中进行植株再生培养，培养条件为24℃，光照强度1500Lux，每天16h光照，8h黑暗。在再生培养基中经过45d的培养后，将产生的健壮绿色丛生芽切下，转移至添加150mg/L的进口头孢噻肟钠和50mg/L卡那霉素的Murashige和Skoog培养基中进行生根诱导，使其形成完整的马铃薯转基因植株，培养条件为温度24℃，光照强度1500Lux，每天16h光照，8h黑暗。
5、转基因植株的检测。
采用PCR、Southern杂交及生物学方法鉴别再生植株，最终获得马铃薯转基因植株。
实施例1
1.几丁质酶基因的遗传转化
用携带几丁质酶基因的农杆菌菌株EHA105(质粒pBch)和马铃薯品种东农303微型薯的薯块共培养2d，培养条件为温度24℃，黑暗。
将共培养的薯块用无菌水清洗2-3次，接种于含有3.0mg/L玉米素、1.0mg/L吲哚乙酸、150mg/L的进口头孢噻肟钠和50mg/L卡那霉素的Murashige和Skoog培养基中进行植株再生培养，培养条件为24℃，光照强度1500Lux，每天16h光照，8h黑暗。
在再生培养基中经过45d的培养后，获得一批健壮绿色丛生芽。转化频率平均为57.3％(转化频率＝再生芽的外植体数/转化的薯块外植体总数×100％)。将丛生芽切下，转移至添加150mg/L的进口头孢噻肟钠和50mg/L卡那霉素的Murashige和Skoog培养基中进行生根诱导，获得了115株完整植株。培养条件为温度24℃，光照强度1500Lux，每天16h光照，8h黑暗。
对得到的115株抗性植株进行PCR检测、Southern杂交等常规分子检测，结果表明，75株再生植株是转基因植株，抗性植株转化率为65.2％(抗性植株转化率＝转基因植株数/抗性植株数×100％)。详见表1。
表1 几丁质酶基因抗性植株转化率
实施例2
2.CpTI(豇豆胰蛋白酶抑制剂)和Bt(苏云金杆菌杀虫结晶蛋白)双价基因的遗传转化
用携带CpTI和Bt双价基因的农杆菌菌株LBA4404(含pGBI121S4ABC质粒)和马铃薯品种克新13微型薯的薯块共培养2d，培养条件为温度24℃，黑暗。
将共培养的薯块用无菌水清洗2-3次。接种于含有3.0mg/L玉米素、1.0mg/L吲哚乙酸、150mg/L的进口头孢噻肟钠和50mg/L卡那霉素的Murashige和Skoog培养基中进行植株再生培养，培养条件为24℃，光照强度1500Lux，每天16h光照，8h黑暗。
在再生培养基中经过45d的培养后，获得一批健壮绿色丛生芽。将丛生芽切下，转移至添加150mg/L的进口头孢噻肟钠和50mg/L卡那霉素的Murashige和Skoog培养基中进行生根诱导，获得了完整再生植株。培养条件为温度24℃，光照强度1500Lux，每天16h光照，8h黑暗。
对得到的76株抗性植株进行PCR检测、Southern杂交等常规分子检测，结果表明，45株再生植株是转基因植株。对部分转CpTI和Bt双价基因的植株进行生物学鉴定，证明转基因植株对桃蚜的生长发育有一定的抑制作用，不但延长各龄期时间，还使蚜虫产蚜能力保持在较低水平。
详见表2。
表2 CpTI和Bt双价基因抗性植株转化率
本发明通过与上述相同的方法，测得多种马铃薯品种遗传转化的转化频率(转化频率＝再生芽的外植体数/转化的薯块外植体总数×100％)，如表3所示。
表3 不同马铃薯品种微型薯遗传转化的转化频率
综上所述，本发明的方法是本发明人通过长期创造性的劳动，建立的一种适合多种马铃薯品种的高效遗传转化体系，以微型薯为外植体，通过胚状体发生途径直接分化出抗性芽，转化频率均在50％以上。
本发明使用的两种常用MS(Murashige和Skoog)培养基和YEB(Yeast Extract Peptone)的组分，详见表4和表5。
表4 MS(Murashige和Skoog)培养基组分
表5 YEB(Yeast Extract Peptone)培养基组分
Claims (5)
1.一种利用马铃薯微型薯的遗传转化方法，其特征是：
(1)马铃薯微型薯的诱导
取脱毒试管苗，经过炼苗后，从培养基中连根拔出，移栽于温室，经过60-80d的生长，微型薯达到2-5g重，即可收获，晾干后保存；
(2)菌株的活化及菌种的准备
取低温甘油保存的农杆菌，涂布于固体Yeast Ext ract Peptone培养基上，28℃下倒置暗培养，使其活化；3d后挑取单菌落接种于5ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L链霉素的Yeast Extract Peptone液体培养基中，28℃下160rpm/min振荡培养过夜；取700μl该菌液接种于70ml相同的Yeast Extract Peptone液体培养基中，振荡培养14-18h后，将达到对数生长期的菌液置于离心管，4000rpm离心5min，弃去上清，重悬于Murashige和Skoog液体培养基，稀释至OD值0.5-0.8；
(3)侵染和共培养
取收获后打破休眠的脱毒微型薯，在无菌条件下用70％的酒精浸泡30s、0.1％的升汞浸泡10min、无菌水清洗5次后，去皮切成厚度为1mm的薄片，用制备好的农杆菌菌液侵染薯块5min，然后用无菌滤纸将多余菌液吸去，接种于含有3.0mg/L玉米素和1.0mg/L吲哚乙酸的Murashige和Skoog培养基上，共培养2d，培养条件为温度24℃，黑暗；
(4)转基因植株再生培养
将共培养后的微型薯薯块用无菌水清洗2-3次，接种于含有3.0mg/L玉米素、1.0mg/L吲哚乙酸、150mg/L的头孢噻肟钠和50mg/L卡那霉素的Mura shi ge和Skoog培养基中进行植株再生培养，培养条件为24℃，光照强度1500Lux，每天16h光照，8h黑暗；在再生培养基中经过45d的培养后，将产生的健壮绿色丛生芽切下，转移至添加150mg/L的头孢噻肟钠和50mg/L卡那霉素的Mura shige和Skoog培养基中进行生根诱导，使其形成完整的马铃薯转基因植株，培养条件为温度24℃，光照强度1500Lux，每天16h光照，8h黑暗；
(5)转基因植株的检测
采用PCR、Southern杂交及生物学方法鉴别再生植株，最终获得马铃薯转基因植株。
2.根据权利要求1所述的一种利用马铃薯微型薯的遗传转化的方法，其特征在于：该步骤(1)的脱毒试管苗生长15-20d时进行移栽。
3.根据权利要求1所述的一种利用马铃薯微型薯的遗传转化的方法，其特征在于：该步骤(2)的农杆菌选用LBA4404或EHA101。
4.根据权利要求1所述的一种利用马铃薯微型薯的遗传转化的方法，其特征在于：该步骤(3)要求使用的马铃薯微型薯打破休眠时间为3个月。
5.根据权利要求1所述的一种利用马铃薯微型薯的遗传转化的方法，其特征在于：在根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化中，利用微型薯为转化受体，通过体细胞胚胎发生途径直接分化抗性芽。
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