CN102051377B

CN102051377B - 非组织培养的玉米遗传转化方法

Info

Publication number: CN102051377B
Application number: CN201010246875.1A
Authority: CN
Inventors: 邸宏; 王振华; 刘昭军; 周羽
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2010-08-06
Filing date: 2010-08-06
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2030-08-06
Also published as: CN102051377A

Abstract

本发明涉及一种非组织培养的玉米遗传转化方法。本发明的方法包括：(1)剥取玉米幼胚；(2)制备农杆菌菌液；(3)侵染与共培养：将步骤(1)中得到的玉米幼胚浸泡于步骤(2)中制备好的农杆菌菌液中，100-150W超声波处理20min后，接种于Murashige和Skoog固体培养基，24℃条件下暗培养共培养3d；(4)转基因植株生长：将步骤(3)培养的玉米幼胚用无菌水清洗2-3次，接种于含头孢霉素150mg/L的Murashige和Skoog固体培养基，26℃条件下暗培养1周，移栽到营养基质中，在温室中培育；(5)转基因植株的检测：采用PCR或Southern杂交鉴别玉米转基因植株。本发明用于玉米遗传转化。

Description

非组织培养的玉米遗传转化方法

技术领域：

本发明涉及一种非组织培养的玉米遗传转化方法，属于基因工程技术领域。

背景技术：

玉米既是重要的饲料和粮食作物，也是极其重要的工业原料作物。目前全球玉米产量稳步增长，但随着经济的快速发展和人民生活水平的迅速提高，玉米消费总量则持续增加，供求矛盾加剧。通过常规育种进行玉米的遗传改良是现在玉米增产的主要途径之一，但有限的遗传资源和比较长的育种周期等因素往往限制了其应用的潜力。

转基因技术可以打破物种界限，对基因进行定向改造和重组，对品种的抗性、品质、产量等性状进行协调改良，在缓解资源约束、保障粮食安全和保护生态环境等方面具有重要的价值。

建立良好的遗传转化体系是基因转化能否成功的关键因素之一。目前较常用且转化效率较高的是农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法。

目前，人们已经能从多种外植体如幼胚(Armstrong等，1985；Hayashi等，1998；Danilova等，2004；潘光堂等，2006；宋芸等，2006)、成熟胚(郭丽红等，1999；Huang等，2004)、花药(Genovesi等，1982；Martin等，1992；李新华，2005)、雌雄幼穗(张玉玲，1999；付凤玲等，1999)、雄幼穗的颖片(Suprasanna等，1986)、茎节切段(Andrew等，2001)、根尖(Li等，2004；Zhang等，2002)、幼苗叶片(Ahmadabadi等，2006)等诱导出愈伤组织，有的不但能诱导出愈伤组织，而且还成功获得了再生植株。但玉米的遗传转化仍然十分困难，没有一套完整的被广泛使用的转化体系，尤其在国内。

基因型是影响遗传转化的一个重要因素(Hodges等，1986；梁竹清，1986；Gutsulyak等，1994；潘光堂等，2006；Lozovaya等，2006)。目前，玉米植株再生能力较好的基因型仍只限于模式自交系A188和B73及其衍生系、美国杂交种78599选育的后代、墨西哥甜玉米等。

发明内容：

本发明的目的是提供一种非组织培养的玉米遗传转化方法，通过建立一个适合多种玉米品种的遗传转化体系，该体系以玉米幼胚为外植体，经农杆菌侵染后直接长出抗性植株，不需组织培养过程，转化频率平均为1％以上，达到建立一个操作简便、适应性广的玉米遗传转化体系的目的。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

非组织培养的玉米遗传转化方法，该方法包括如下步骤：

(1)剥取玉米幼胚；

(2)制备农杆菌菌液；

(3)侵染与共培养：将步骤(1)中得到的玉米幼胚浸泡于步骤(2)中制备好的农杆菌菌液中，100-150W超声波处理20min后，接种于Murashige和Skoog固体培养基，24℃条件下暗培养共培养3d；

(4)转基因植株生长：将步骤(3)培养的玉米幼胚用无菌水清洗2-3次，接种于含头孢霉素150mg/L的Murashige和Skoog固体培养基，26℃条件下暗培养1周，移栽到营养基质中，在温室中培育；

(5)转基因植株的检测：采用PCR或Southern杂交鉴别玉米转基因植株。

所述的非组织培养的玉米遗传转化方法，步骤(1)所述的剥取玉米幼胚的方法是：取授粉11-13d的玉米幼穗，用75％酒精浸泡1min，0.1％HgCl₂水溶液消毒10min，无菌水冲洗5次后，剥取幼胚，幼胚长2～3mm。

所述的非组织培养的玉米遗传转化方法，步骤(2)所述的制备农杆菌菌液的方法是，取农杆菌100μL接种于5ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L链霉素的Yeast Extract Peptone液体培养基中，28℃下160rpm/min振荡培养过夜，取100μl该培养液接种于100ml同样的Yeast Extract Peptone液体培养基中，振荡培养14-18h后，将达到对数生长期的菌液置于离心管，4000rpm离心5min，弃去上清，重悬于含100uM乙酰丁香酮的Murashige和Skoog液体培养基，稀释至OD值0.6。

所述的非组织培养的玉米遗传转化方法，步骤(4)中所述的营养基质是指蛭石∶草炭土∶消毒田园土＝1∶1∶1，加入磷酸二铵2kg/m3。

有益效果：

1.适应范围广，本发明的非组织培养的玉米遗传转化方法适用于多种玉米品种，而现有的遗传转化体系只适用于少量玉米品种。

2.操作比较简便，生产效率高，成本低廉，本发明步骤简单，植株再生不需经过愈伤组织诱导步骤，遗传转化周期短，转化效率高。

3.本发明易于掌握，重复性高。本发明对玉米幼胚取材时间、长度、侵染条件、侵染时间等遗传转化条件，进行了详细的研究，确立了适宜的范围，建立了玉米遗传转化体系。本发明使用玉米幼胚外植体，容易获得，一次可生产大量转基因植株，适于工厂化生产。

附图说明：

附图1是本发明的步骤框图。

附图2是转WRKY1基因T0代玉米PCR检测结果。图中M：Marker(DL2000)；P：阳性对照；C：阴性对照；W：水对照，1-8：为转基因植株。

附图3是转BcBCP1基因T0代玉米植株的PCR检测结构。图中M：DL2000marker；1：质粒；2：阴性对照；3：空白对照；4-10：转基因样品。

附图4是转BADH株系T0代PCR检测结果。图中M：DL2000 marker；1：质粒；2：空白对照；3-11：转基因样品。

具体实施方式：

实施例1：

非组织培养的玉米遗传转化方法，该方法包括如下步骤：

(1)剥取玉米幼胚；

(2)制备农杆菌菌液；

实施例2：转录因子基因WRKY1对玉米的遗传转化

选用2份优良玉米自交系合344和东46，由东北农业大学玉米研究所提供。种植于东北农业大学香坊农场试验田，供试玉米材料催芽后，于5月1、10、20、30日及6月10日分5个时期分期播种，以保证玉米幼胚材料的长期供应。在玉米雌穗未露花丝前2-3天套袋，待花丝抽出2-5cm时取同一自交系花粉进行授粉，取授粉后11-13d的玉米雌穗。

试验用农杆菌菌株LBA4404，质粒载体p3300-Ubi-WRKYI，筛选标记为bar基因，启动子为ubi，终止子为nos，由北京大学林忠平教授提供。

在超净工作台内去果穗苞叶，每剥一层用75％酒精擦拭，剥去最后一层，用消毒的手术刀切取果穗中部子粒，然后将子粒用75％酒精消毒1min，0.1％HgCl₂消毒2min，用无菌水冲洗3遍后吸干水渍，取出幼胚。玉米幼胚浸泡于制备好的OD值为0.6的农杆菌菌液中，100-150W超声波处理20min后，接种于Murashige和Skoog固体培养基，24℃条件下暗培养共培养3d后将玉米幼胚用无菌水清洗2-3次，接种于含头孢霉素150mg/L的Murashige和Skoog固体培养基，26℃条件下暗培养1周，挑选胚芽胚根生长正常的移栽到营养基质(蛭石∶草炭土∶消毒田园土＝1∶1∶1，加入磷酸二铵2kg/m3)中，在温室中培育。出苗后在3-4叶期对T0代植株喷施1‰PPT溶液进行除草剂抗性筛选。初步计算转化率，转化率＝T0代除草剂抗性植株数/总的植株数。

对D0代除草剂抗性植株在苗期进行PCR检测。用CTAB法提取叶片总DNA作模板，以bar基因的DNA片段作引物(上游链：5′AAA CCC ACg TCA TgC CAgCTC 3′，下游链：5′CgA CAA gCA Cgg TCA ACT TC 3′)，扩增35个循环，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

结果表明，共获得东46PCR阳性植株8株，合344PCR阳性植株3株，平均遗传转化率为1.43％(见表1)。PCR结果见图2。

表1转录因子基因WRKY1对玉米的遗传转化

自交系	操作幼胚数	PCR阳性植株数	转化率(％)
				东46	450	8	1.78
合344	280	3	1.07
				平均			1.43

实施例3蓝铜类似蛋白基因BcBCP1对玉米的遗传转化

受体材料为优良玉米自交系黄早四、丹599和K10，由东北农业大学玉米研究所提供。

试验用农杆菌菌株LBA4404，质粒载体p3300-BcBCP 1，启动子为CaMV35S，终止子为nos，筛选标记为bar基因，由北京大学林忠平教授提供。

遗传转化方法同实施例1。玉米植株长到三叶期，均匀喷洒除草剂PPT水溶液行筛选。除草剂抗性植株提取总DNA，进行PCR检测。引物序列为P I：5′-ATGGGGGGACTCAAGGTTTTTGCT-3′，P II：5′-CACAGCTTTGAATGTGTTTGATTTG-3′。PCR反应程序为：95℃预变性4min，94℃变性30S，60℃退火30S，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。

结果表明，共获得黄早四PCR阳性植株3株，丹599PCR阳性植株2株，K10PCR阳性植株2株，平均遗传转化率为1.37％(见表2)。PCR结果见图3。

表2蓝铜类似蛋白基因BcBCP1对玉米的遗传转化

基因型	侵染幼胚数	PCR阳性株数	转化率(％)
				黄早四	300	3	1.00
丹599	180	2	1.11
				K10	100	2	2.00
平均			1.37

实施例4甜菜碱醛脱氢酶基因BADH对玉米的遗传转化

受体材料为优良玉米自交系齐319、PH6WC、合344和郑58，由东北农业大学玉米研究所提供。

试验用农杆菌菌株LBA4404，质粒载体p3300-Ubi-BADH，筛选标记为bar基因，启动子为ubi，终止子为nos，由北京大学林忠平教授提供。

遗传转化方法同实施例1。玉米植株长到三叶期，均匀喷洒除草剂PPT水溶液行筛选。除草剂抗性植株提取总DNA，进行PCR检测。引物序列为primer I：5′-AGAATGGCGTTCCCAATTCCTGCTC -3′，primer II：5′-TTCAAGGAGACTTGTACCATCCCCA-3′。PCR反应程序为：95℃预变性4min，94℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。

结果表明，共获得黄早四PCR阳性植株3株，丹599PCR阳性植株2株，K10PCR阳性植株2株，平均遗传转化率为1.35％(见表3)。PCR结果见图4。

表3甜菜碱醛脱氢酶基因BADH对玉米的遗传转化

基因型	侵染幼胚数	PCR阳性株数	转化率(％)
				齐319	480	5	1.04
合344	200	2	1.00
				郑58	100	2	2.00
平均			1.35

综上所述，本发明的方法是本发明人通过长期创造性的劳动，建立的一种适合多种玉米自交系的遗传转化体系，以玉米幼胚为外植体，直接长出转化植株，转化频率均在1％以上。

本发明使用的两种常用培养基MS(Murashige和Skoog)和YEB(Yeast Extract Peptone)的组分，详见表4和表5。

表4S(Murashige和Skoog)培养基组分

表5YEB(Yeast Extract Peptone)培养基组分

Claims

1.一种非组织培养的玉米遗传转化方法，其特征是：该方法包括如下步骤：

（1）剥取玉米幼胚；

（2）制备农杆菌菌液；

（3）侵染与共培养：将步骤（1）中得到的玉米幼胚浸泡于步骤（2）中制备好的农杆菌菌液中，100-150W超声波处理20min后，接种于Murashige和Skoog固体培养基，24℃条件下暗培养共培养3d；

（4）转基因植株生长：将步骤（3）培养的玉米幼胚用无菌水清洗2-3次，接种于含头孢霉素150mg/L的Murashige和Skoog固体培养基，26℃条件下暗培养1周，移栽到营养基质中，在温室中培育；

(5)转基因植株的检测：采用PCR或Southern杂交鉴别玉米转基因植株；

步骤（1）所述的剥取玉米幼胚的方法是：取授粉11-13d的玉米幼穗，用75%酒精浸泡1min，0.1%HgCl ₂ 水溶液消毒10 min，无菌水冲洗5次后，剥取幼胚，幼胚长2～3mm；步骤（2）所述的制备农杆菌菌液的方法是，取农杆菌100μL接种于5ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L链霉素的Yeast Extract Peptone 液体培养基中，28℃下160rpm/min振荡培养过夜，取100μl该培养液接种于100ml同样的Yeast Extract Peptone液体培养基中，振荡培养14-18h后，将达到对数生长期的菌液置于离心管，4000rpm离心5min，弃去上清，重悬于含100uM乙酰丁香酮的Murashige和Skoog液体培养基，稀释至OD值0.6；

所述的Yeast Extract Peptone液体培养基的组分为：酵母提取物1g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、蔗糖5 g/L、MgSO ₄ ·7H ₂ O0.5 g/L、琼脂15 g/L，所述的琼脂为固体，所述的Yeast Extract Peptone液体培养基的PH值为7.0。

2.根据权利要求1所述的非组织培养的玉米遗传转化方法，其特征是：步骤（4）中所述的营养基质是指蛭石：草炭土：消毒田园土=1：1：1，加入磷酸二铵2kg/m3。