CN102337295A - 一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，步骤如下：(1)甜瓜无菌苗的生成；(2)含有目的基因农杆菌的活化与重悬；(3)转化：对适宜大小的甜瓜幼苗进行剪切，去其子叶，暴露或损伤顶端生长点(附图1)，然后将含有目的基因的农杆菌菌液涂抹至幼苗切口处；(4)筛选：从生长点长出幼苗(附图2)，剪下并将其转移至选择培养基上进行选择培养；(5)使经过选择培养的幼苗生根，并进行移栽，得转基因植株，进行子代鉴定。该方法可以避免诱导愈伤组织以及愈伤组织培养中引起的不利变异，操作相对简单，整个工作周期短，可以在较短时间内获得转基因植株。可以在一定程度上克服基因型的限制。

Description

一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法

技术领域

本发明涉及一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，属于农业生物技术领域和植物基因工程领域。

背景技术

目前甜瓜的遗传转化方法主要有农杆菌介导的组织培养法，以及不需要组织培养的基因枪法、花粉管通道法和子房注射法等，简介如下：

基因枪法：利用基因枪，将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。与农杆菌转化相比，基因枪法转化的一个主要优点是不受受体植物范围的限制。而且其载体质粒的构建也相对简单，因此也是目前转基因研究中应用较为广泛的一种方法，但是其转化效率相对较低。

花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握，和基因枪法类似，其转化效率较低。

子房注射法：子房注射法是对整体植株的早期胚细胞转化DNA。直接将质粒DNA注射到植物的子房，此法更适用于子房较大的植物，如西瓜、黄瓜、西瓜等。采用这种方法，无需进行细胞或原生质体的组织培养，可以在田间或温室进行，比花粉管通道或农杆菌介导的遗传转化等方法导入外缘DNA更简单，但是假阳性率较高。

在甜瓜再生体系中，农杆菌介导的组织培养法主要是利用根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有的Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染甜瓜伤口细胞后，可将T-DNA插入到甜瓜基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物转化体系，人们将目的基因插入到改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

但是由于甜瓜的再生体系建立起来相对比较困难，特别是由于甜瓜组培苗的玻璃化现象比较严重，造成了成苗及其困难的情况，大多数情况下，难以获得真正的转基因植株。这一关键技术的限制因素在于获得转化细胞之后，难以从转化的阳性细胞获得植株。所以说，尽管该方法理论基础相对清楚，技术方法最成熟，但是相对于一些组织培养再生能力较差的植物来说，该方法的应用却存在着一定的局限性。

发明内容

针对上述现有技术，本发明要解决的问题是：提供一种改良的通过农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，以获得高频率的转基因植株，进行甜瓜的基因工程改良。该方法可以避免诱导愈伤组织以及愈伤组织培养中引起的不利变异，操作相对简单，整个工作周期短，可以在较短时间内获得转基因植株。可以在一定程度上克服基因型的限制。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，步骤如下：(1)甜瓜无菌苗的生成；(2)含有目的基因农杆菌的活化与重悬；(3)转化：对适宜大小的甜瓜幼苗进行剪切，去其子叶，暴露或损伤顶端生长点，然后将含有目的基因的农杆菌菌液涂抹至幼苗切口处；(4)筛选：从生长点长出幼苗，剪下并将其转移至选择培养基上进行选择培养；(5)使经过选择培养的幼苗生根，并进行移栽，得转基因植株，进行子代鉴定。

所述步骤(1)具体如下：甜瓜无菌苗的生成：甜瓜种子去壳后，用70％乙醇(体积浓度)浸泡30～45s，用无菌水洗1～2次，而后用0.1％的HgCl₂溶液(质量浓度)浸泡8～10min，再用无菌水冲洗4～5次，用滤纸吸干表面残留液体后，接种于不含抗生素的MS发芽培养基上，26±1℃暗培养2～3天，待胚根长出后于3000Lx光照强度、16h/8h光周期下培养5～7天，得甜瓜无菌苗。

所述步骤(2)具体如下：含有目的基因农杆菌的活化与重悬：用无菌牙签从平板上挑取含有目的基因的农杆菌单菌落接种至20ml附加抗生素的pH为7.0的LB液体培养基上，28℃，180r/min培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8；取菌液加至相同培养基上，28℃，180r/min继续培养5～6小时，培养至菌液浓度OD₆₀₀＝0.5～0.6；5000r/min，4℃离心5min，收集菌体，去上清，用液体MS培养基重悬菌体，而后5000r/min，4℃离心5min，收集菌体，再次用液体MS培养基重悬菌体，而后5000r/min，4℃离心5min，收集菌体，用MS培养基重悬菌体后，即可以用于转化，备用。

所述附加的抗生素为：50mg/L的利福平。

所述菌液培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8时，取200ul菌液加至20ml附加抗生素的pH为7.0的LB液体培养基上。

所述步骤(3)具体如下：转化：待步骤(1)得到的甜瓜无菌苗的子叶将要展开时，从子叶的基部将子叶剪切掉，然后用牙签粘取少量经步骤(2)活化了的农杆菌菌液轻轻地涂抹在切口处，26±1℃暗培养2～3天，再在3000Lx光照强度、16h/8h光周期下培养。

所述步骤(4)具体如下：筛选：当切口处长出的再生芽长到1cm以上时，剪切，移到筛选培养基上筛选培养，得幼苗。若底部叶片变黄可继续剪切顶端新芽继续选择培养，直至成苗。

所述筛选培养基的配方为：MS+含有选择标记抗性的抗生素+羧苄青霉素300mg/L

所述步骤(5)具体如下：生根及移栽：将幼苗从选择培养基上转移至含有选择压的生根培养基上进行生根培养，待长出不定根后(约两周后)，打开瓶口，室内炼苗3天左右，然后从培养基中取出，洗净培养基后在水中浸泡至长出新根，而后移栽至大田。

所述含有选择压的生根培养基的配方为：1/2MS+0.05mg/L 6-BA+1mg/L NAA+琼脂7g/L，PH5.8。

本发明的农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，克服了基因型对甜瓜再生的限制，并可以避免诱导愈伤组织以及愈伤组织培养中引起的不利变异，操作相对简单，整个工作周期短，可以在较短时间内获得转基因植株。

附图说明

图1为甜瓜子叶被剪切后照片。

图2涂抹农杆菌后甜瓜生长点再生情况。

图3为PCR反应程序示意图。

图4为荧光定量标准曲线。

图5为转基因植株的PCR鉴定电泳图，泳道1、2为转化植株，泳道3为野生型植株P为质粒对照。

图6为转基因植株、野生植株和PFGC008-CmMlo2质粒的扩增曲线和熔点曲线示意图，其中，A：转化植株1扩增曲线；B：转化植株1熔点曲线；C：转化植株2扩增曲线；D：转化植株2熔点曲线；E：野生型植株扩增曲线；F：野生型植株熔点曲线；G：PFGC1008-CmMlo2质粒扩增曲线；H：PFGC1008-CmMlo2质粒熔点曲线。

图7为转化植株和野生型植株的表观差异示意图，其中A：WT-1为甜瓜野生型，C5-6为获得的阳性转化植株。B：左，接种后的WT-1，感白粉病。右：接种后的转化植株C5-6，表现为抗白粉病。C：左，感病的WT-1后期生长情况。右，转化植株后期生长情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1利用农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法转化CmMlo2基因，获得抗白粉病甜瓜种质，步骤如下：

一、甜瓜CmMlo2基因的克隆：

1、cDNA第一链的合成

Trizol法提取叶片总RNA。Smart^TM RACE cDNA Amplification Kit合成cDNA。

2、甜瓜CmMlo2基因的克隆

根据拟南芥，大麦等作物Mlo的保守序列，设计如下引物

上游引物：CA[C/T]CAGCTGCA[C/T/G]AT[A/C/T]TTCATCTT，

下游引物：CCCATCTGAGT[A/T/G]AC[A/T/G]AG[T/A/C/G]GC[A/G/C]TA。

以甜瓜叶片cDNA为模板扩增中间片段，反应体系为25ul，反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s、56℃复性30s、72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸10min。12％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京天根)回收PCR产物。回收的PCR产物与PGEM-T easy vector(Promega)连接，转化大肠杆菌TOP10，菌落在含有X-gal和IPTG的平板上进行蓝白斑筛选，分别挑选若干白斑菌落提取质粒，通过质粒DNA酶切和PCR鉴定后克隆的PCR产物由北京博尚生物技术有限公司测序。

根据中间片段测序结果分别设计5′RACE和3′RACE的特异引物：

M3′GSP：GATAACCCAGCTGGCTCATGAGG；

M5′GSP：GCAACCAACCAAGAAGAGCTGAATC。

采用Clontech的SMATR技术，通过RACE方法分别获得5′RACE和3′RACE的序列，拼接后得到cDNA全长序列。设计引物：

上游引物：GAGAAGAACACGGAGCCGAAATG，

下游引物：TTTCTCCTACGGAACGGGGTAAG。

以cDNA第一链为模板，PCR扩增获得全长cDNA。

二、构建反义干扰表达载体

结合Invitrogen公司的在线设计软件，确定CmMlo2的+324到+690共367bp为最终靶标。

通过PCR方法在目标片段的5’端和3’端分别加上酶切位点SpeI-AscI和Swal-BamH I，引物序列如下：

上游引物：TA

GGCGCGCCAACAGTCGTCTTAGACTTC；

下游引物：GC

ATTTAAATAACAAACAATCCAGAGGG。

三、利用苗端转化法转化甜瓜感病种质

1、甜瓜无菌苗的生成：甜瓜种子去壳后，用70％乙醇(体积浓度)浸泡30s，用无菌水洗2次，而后用0.1％的HgCl₂溶液(质量浓度)浸泡8min，再用无菌水冲洗4次，用滤纸吸干表面残留液体后，接种于不含抗生素的MS发芽培养基上，26±1℃暗培养2天，待培根长出后于3000Lx光照强度、16h/8h光周期下培养5天，得甜瓜无菌苗。

2、含有目的基因农杆菌的活化与重悬：用无菌牙签从平板上挑取含有目的基因的农杆菌单菌落接种至20ml附加抗生素(50mg/L的氯霉素和50mg/L的利福平)的pH为7.0的LB液体培养基上，28℃，180r/min培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8；取200ul菌液加至20ml附加抗生素的pH为7.0的LB液体培养基上，28℃，180r/min继续培养5小时，培养至菌液浓度OD₆₀₀＝0.5～0.6；5000r/min，4℃离心5min，收集菌体，去上清，用液体MS培养基重悬菌体，而后5000r/min，4℃离心5min，收集菌体，再次用液体MS培养基重悬菌体，而后5000r/min，4℃离心5min，收集菌体，用MS培养基重悬菌体后，即可以用于转化，备用。

3、转化：待步骤(1)得到的甜瓜无菌苗的子叶将要展开时，从基部将子叶剪切掉(图1)，然后用牙签粘取少量经步骤(2)活化了的农杆菌菌液轻轻地涂抹在切口处，26±1℃暗培养3天，再在3000Lx光照强度、16h/8h光周期下培养。

4、筛选：当切口处长出的不定芽长到1cm以上时，剪切，移到筛选培养基上筛选培养，得幼苗。若底部叶片变黄可继续剪切顶端新芽继续选择培养，直至成苗(图2)。筛选培养基的配方为：MS+潮霉素10mg/L+羧苄青霉素300mg/L。

5、生根及移栽：将幼苗从选择培养基上转移至含有选择压的生根培养基上进行生根培养，待长出不定根后(约两周后)，打开瓶口，室内炼苗3天左右，然后从培养基中取出，洗净培养基后在水中浸泡至长出新根，而后移栽至大田。

所述含有选择压的生根培养基的配方为：生根培养基：1/2MS、0.05mg/L 6-BA、1mg/LNAA、琼脂7g/L、PH5.8。

四、转化植株的抗白粉病检测

1、植株的PCR检测

将通过筛选压选择，经不定芽伸长、诱导生根后的T0代植株提取叶片DNA，PCR检测利用载体pFGC100835S启动子上的一段序列作为上游引物，下游引物为CmMlo2RNAi片段的下游引物。

上游引物：TCATTCAAGATCTCTCTGCCGACAGTG；

下游引物：GCGGATCCATTTAAATAACAAACAATCCAGAGGG。

混匀后，短暂离心，进行PCR反应，条件如下：

94℃3min，25个循环为：94℃50s，59℃50s，72℃1min，最后，72℃延伸10min。PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳电泳。

2、转基因植株的Real-Time PCR检测

定量分析在BIO-RAD iQ5Real-Time PCR system上进行。利用takara试剂盒DRR041

Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)，在冰上操作，保持试剂的活性；因为SYBR荧光染料的缘故，要避免中强光，照射；在移液准确的前提下，尽量缩短操作时间，减少非特异扩增；充分振荡，使成分均匀。按下列组分配制PCR反应液(表1)：

表1

采用附图3显示的程序进行PCR反应，其中Cycle1和Cycle2用来完成PCR反应。95℃10s，40个循环为：95℃5s，59℃30s，收集荧光信号，绘制扩增曲线(附图6A，图6C，图6E，图6G)。Cycle3、Cycle4、Cycle5用来完成热学过程，然后以0.5℃为梯度，从55-95℃缓慢升温，产生熔点曲线(附图6B，图6D，图6F，图6H)，反应结束后，利用iQ5内置软件进行统计分析作图。

3、目的基因标准曲线的制作

本试验中DNA浓度的测定采用BioPhotometer分光光度计(Eppendorf)，定量PCR结果采用Bio iQ5内置软件分析，目的基因标准曲线的制作是将带有pFGC1008-CmMlo2基因的质粒DNA做10⁰、10¹、10²、10³、10⁴倍稀释，并以这些稀释的DNA为模板进行PCR反应，得到各自的Ct值，通过Ct值与起始模板数的对数值之间存在的线性关系，获得标准曲线(附图4)。

4、转化植株功能的初步鉴定

4.1白粉病菌接种鉴定

甜瓜白粉病菌培养和接种材料准备：甜瓜白粉病菌接种采用离体叶盘接种法，每10d继代培养一次。接种前用4℃无菌水将叶片上的孢子配制成10⁵个/mL的孢子悬浮液。用移液枪取10μL菌液接种于叶片正面。在20℃、RH＞80％、12h光暗交替的条件下培养，观测白粉病感病情况。

4.2转化植株的PCR鉴定

经过上游表达载体的设计构建，以及下游转化体系的建立、转化品系的筛选鉴定等一系列步骤后，获得T0代10株。对10株转化苗提取DNA检测，以野生型为对照，进行PCR初步筛选，经鉴定2株为阳性。

取转基因的两株进行PCR及荧光定量双重鉴定，附图5为电泳结果，泳道1、2为转化植株，泳道4为质粒，根据所用引物，扩增出672bp大小产物，扩增片段大小和预期相符。泳道3为野生型对照，未有扩增产物。

参照Ingham和王育花的方法，选取两株阳性植株和1株非转基因植株为对照，每个样品做1次重复，进行荧光定量PCR反应，获得扩增曲线，标准曲线的相关系数R＝0.996，该基因的Ct值与起始模板数之间的方程为：Y＝10^{(-2821X+21688)}。

采用SYBR Green I荧光嵌合法检测时，由于SYBR Green I可以嵌合进所有的双链DNA的小沟区域，受激发而发出荧光，因此必需做PCR反应的特异性检测，一般通过熔解曲线来分析其扩增特异性。理想的熔解曲线应该是单峰型曲线，在本实验中，通过对目的基因的熔解曲线分析可以看出，熔点曲线都是单峰型(附图6B，图6D，图6F，图6H)，说明在PCR扩增过程中，没有出现非特异性扩增，由此推断定量PCR扩增所获得的数据是可靠的。

4.3转基因植株外源基因拷贝数的确定

iQ5内置软件可以自动生成线性标准曲线，通过与标准曲线的比对，确定甜瓜样品中的转基因拷贝数，甜瓜基因组大约为450Mb，与模板量相当的标准质粒DNA的用量就是根据这一基因组的复杂度计算出来的，本研究中所有的转基因植物都来源于用一亲本，因而理论上应该具有相同的基因组复杂度。每个样品重复一次，取平均值。

对照标准曲线，两株阳性植株C5-6和D5-6的转化拷贝数均为1，而对照野生型E5-6的拷贝数为0。两株转化植株均为单拷贝插入。

4.4转化植株T0代的表型观察

转化植株和野生型组培苗在玻璃瓶中驯化1周后，同时移栽到人工气候室，转化植株很快抽生卷须，生长势较野生型植株弱。雄花出现较早。叶色叶型没有明显差异。接种后的转化植株C5-6表现为抗白粉病(图7B右，图7C右)。而接种后的WT-1表现为感白粉病(图7B左，图7C左)。

Claims (10)

1.一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于，步骤如下：(1)甜瓜无菌苗的生成；(2)含有目的基因农杆菌的活化与重悬；(3)转化：对甜瓜幼苗进行剪切，去其子叶，暴露或损伤顶端生长点，然后将含有目的基因的农杆菌菌液涂抹至幼苗切口处；(4)筛选：从生长点长出幼苗，剪下并将其转移至选择培养基上进行选择培养；(5)使经过选择培养的幼苗生根，并进行移栽，得转基因植株。

2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于：所述步骤(1)具体如下：甜瓜无菌苗的生成：甜瓜种子去壳后，用70％乙醇浸泡30～45s，用无菌水洗1～2次，而后用0.1％的HgCl₂溶液浸泡8～10min，再用无菌水冲洗4～5次，用滤纸吸干表面残留液体后，接种于不含抗生素的MS发芽培养基上，26±1℃暗培养2～3天，待培根长出后于3000Lx光照强度、16h/8h光周期下培养5～7天，得甜瓜无菌苗。

3.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于：所述步骤(2)具体如下：含有目的基因农杆菌的活化与重悬：用无菌牙签从平板上挑取含有目的基因的农杆菌单菌落接种至附加抗生素的pH为7.0的LB液体培养基上，28℃，180r/min培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8；取菌液加至相同培养基上，28℃，180r/min继续培养5～6小时，培养至菌液浓度OD₆₀₀＝0.5～0.6；5000r/min，4℃离心5min，收集菌体，去上清，用液体MS培养基重悬菌体，而后5000r/min，4℃离心5min，收集菌体，再次用液体MS培养基重悬菌体，而后5000r/min，4℃离心5min，收集菌体，用MS培养基重悬菌体，备用。

4.根据权利要求3所述的一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于：所述附加的抗生素为：50mg/L的利福平。

5.根据权利要求3所述的一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于：所述菌液培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8时，取200ul菌液加至20ml附加抗生素的pH为7.0的LB液体培养基上。

6.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于：所述步骤(3)具体如下：转化：待步骤(1)得到的甜瓜无菌苗的子叶将要展开时，从基部将子叶剪切掉，然后取经步骤(2)活化了的农杆菌菌液涂抹在切口处，26±1℃暗培养2～3天，再在3000Lx光照强度、16h/8h光周期下培养。

7.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于：所述步骤(4)具体如下：筛选：当切口处长出的不定芽长到1cm以上时，剪切，移到筛选培养基上筛选培养，得幼苗。

8.根据权利要求7所述的一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于：所述筛选培养基的配方为：MS+含有选择标记抗性的抗生素+羧苄青霉素300mg/L。

9.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于：所述步骤(5)具体如下：生根及移栽：将幼苗从选择培养基上转移至含有选择压的生根培养基上进行生根培养，待长出不定根后，打开瓶口，室内炼苗3天，然后从培养基中取出，洗净培养基后在水中浸泡至长出新根，而后移栽至大田。

10.根据权利要求9所述的一种农杆菌介导的甜瓜苗端转化方法，其特征在于：所述含有选择压的生根培养基的配方为：1/2MS+0.05mg/L 6-BA+1mg/L NAA+琼脂7g/L，PH5.8。

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