CN104450749A - 黄瓜CsLOX1基因花特异表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个黄瓜CsLOX1基因花特异表达载体及其在花器官改造中的应用，属于生物技术领域。该载体为含有拟南芥花特异启动子AP3和黄瓜CsLOX1的植物表达载体。在拟南芥中表达CsLOX1基因，获得的CsLOX1转基因植株的花瓣呈封闭状、花瓣发育不完整或缺失、雄蕊退化，雌蕊的数目增加，不正常异位生长的胚珠和柱头明显可见，表明CsLOX1在黄瓜花器官的发育中起重要的调控作用。利用CsLOX1基因获得的花器官发生变异的新材料可用于农作物和观赏植物的育种应用。

Description

黄瓜CsLOX1基因花特异表达载体及其应用

技术领域

   本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种黄瓜CsLOX1基因花特异表达载体及其应用。

背景技术

    脂氧合酶（LOX）是一类广泛存在于动植物体中的非血红素铁蛋白，其参与脂肪酸氧化途径中的LOX 途径，专一催化含有顺，顺-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的加氧反应。脂氧合酶基因家族在植物界广泛存，是一个多基因的家族，具有9-LOX 和13-LOX 两种类型，存在着不同数量的同工酶。植物LOX基因的表达贯穿于植物生活史的整个过程，在植物生长发育的各个阶段，包括种子的萌发、块茎的形成、结节的发育、花的发育、果实的成熟以及植物体的衰老，都可以检测到LOX基因的表达。随着分子生物学技术的不断发展，已从拟南芥、水稻、番茄、马铃薯、玉米等植物器官中克隆了LOX基因。目前，脂氧合酶基因的研究重点主要是侧重于其参与衰老和胁迫的调控、果实醛类芳香物质的形成，但其在花发育中的功能报道还较少。Iván等的研究发现，玉米脂氧合酶基因TS1功能的丧失会使得雄蕊变为雌蕊状的结构，表明脂氧合酶基因在玉米花的发育中起着重要的作用。

    黄瓜(Cucum is sativus L. )是葫芦科重要的蔬菜作物之一，中国是黄瓜栽培和生产大国，且为主要的温室产品之一，广泛分布于各地，对其进行深入的研究具有重要的理论和实践意义。2008年黄瓜基因组测序的完成为从分子水平上研究黄瓜基因的相关功能提供了可能。我们通过前期的研究发现，在黄瓜基因组中共存在着23个CsLOX基因，通过表达的分析发现仅CsLOX1基因在黄瓜花蕾决定的第6时期特异表达，标明其可能在黄瓜花的发育共起着重要的调控作用。进一步通过相关实验证实CsLOX1在黄瓜花发育中的作用后，可利用基因工程的策略来改变CsLOX1在植物体内的表达量以此来改变植物的花型，或作为潜在的育种材料应用在育种上。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄瓜LOX1基因花特异表达载体及其在花器官改造中的应用，该载体含有来自黄瓜脂氧合酶CsLOX1，基因的上游连有拟南芥AP3花特异启动子。

 本发明的上述植物表达载体为1301-AP3-CsLOX1，由下述方法构建而成：

(1)设计拟南芥花特异性启动子AP3 特异性引物AP3-F: 5’-aaaGGATCCAACTTGTG ATTCCTTCTTAA-3’（含BamHI位点），AP3-R: 5’- aaaCTGCAGATTCTTCTCTCTTTGTTTAATC -3’（含PstI位点)，以拟南芥基因组为模板进行PCR扩增获得AP3启动子。回收并纯化AP3启动子，将其连接到pMD18载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-AP3。

（2）使用BamHI和PstI酶切pMD18-AP3和表达载体1301，回收后进行连接、转化感受态细胞，获得中间表达载体1301-AP3。

（3）根据NCBI上黄瓜CsLOX1的公布的序列（登录号为U25058），设计两端引物：CsLOX1-F：5’-aaaCTGCAGATGTTTGGAATTGGGAAG-3’（含PstI位点）CsLOX1-R：5’-aaaGGATCCTTAGATAGAAATACTATTAGG-3’（含BamHI位点）。以黄瓜花蕾的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得CsLOX1全长。回收CsLOX1的cDNA全长，将其连接到pMD18载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-CsLOX1。

（4）使用PstI和BamHI酶切pMD18-CsLOX1，回收CsLOX1片段，使用PstI和BglII（BamHI和BglII为同尾酶）酶切中间表达载体1301-AP3，回收大片段，将CsLOX1片段与载体1301-AP3大片段进行连接、转化感受态细胞，获得植物表达载体1301-AP3-CsLOX1。

    本发明的另一目的是公开黄瓜CsLOX1在花器官改造中的基因工程应用，该基因导入拟南芥后，转基因植株花瓣呈封闭状、花瓣发育不完整或缺失、雄蕊退化，雌蕊的数目增加，不正常异位生长的胚珠和柱头明显可见。该基因可作为目的基因导入其它植物，改变植物的花型，以进行植物品种的改良。

附图说明

 图1为本发明中AP3启动子扩增后的电泳示意图；

 图2为本发明表达载体1301-AP3的BamHI和PstI双酶切电泳检测图；

 图3为本发明中CsLOX1扩增后的电泳示意图；

 图4为本发明中质粒1301-AP3-CsLOX1的SacI酶切电泳检测图；

 图5为转基因植株的PCR鉴定；

 图6为过量表达CsLOX1的转基因拟南芥植株的表达分析；

图7为过量表达CsLOX1的转基因拟南芥植株花的表型，其中(A)为野生型，（B)-(D)为转基因植株。

具体实施方式

 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。

    实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连) 产品，质粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，TRIzoL Reagent RNA 提取试剂购自invitrogen公司，高保真酶KOD-Plus购于TOYOBO公司，DNaseⅠ购于天根生化科技（北京）有限公司，DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1：花特异表达启动子表达载体1301-AP3的构建

(1) 引物设计：参照Hill (1998)和Duan (2008)，从Genbank Data下载花特异性启动子AP3启动子及其5’端序列（GI:223046640），取转录起始位点前的726 bp，设计拟南芥花特异性启动子AP3 特异性引物:

   AP3-F：5’-aaaGGATCCAACTTGTGATTCCTTCTTAA-3’（含BamHI位点）

   AP3-R：5’- aaaCTGCAGATTCTTCTCTCTTTGTTTAATC -3’ （含PstI位点)

（2）拟南芥基因组的提取

   所用的拟南芥为Columbia野生型拟南芥，为江西农业大学作物生理生态与遗传育种重点实验室保存。在放有拟南芥种子1.5 ml 离心管中加入1 ml 75%的酒精，消毒5 分钟，上下颠倒离心管使种子与酒精充分接触。消毒完后，将离心管中的酒精吸出，用灭菌的ddH₂O漂洗3-5 遍。种子漂洗完后将适量0.1%琼脂糖加入离心管中。将种子均匀滴到1/2MS 固体培养基（PH5.8-6.2，6.5%琼脂粉）中。培养皿于4℃冰箱2-3 天，后置于组培室内，光照培养2 周进行移栽。用喷壶浇入PNS 营养液（1L 体积：1M KNO3 5ml；1M Ca(NO3)₂·4H₂O 2ml；1M MgSO4·7H₂O 2ml；20mM Fe-EDTA 2.5ml；1M 磷酸缓冲液 (pH5.5) 2.5ml；MS 微量元素1ml；水补足1L），将营养土（体积比：蛭石：珍珠岩：黑土=3：1：2）浇透。塑料钵置于托盘内，用镊子轻轻夹取拟南芥幼苗下胚轴处，慢慢将拟南芥的根从培养基中拔出，轻轻将根插入塑料钵内的营养土中，苗距2cm 以上，播完后用保鲜膜罩上，三天揭膜。以后相对湿度70%，恒温20-24℃，光照强度80-200umol/M2/S，光照周期为8 h 黑暗﹑16 h 光照培养。移栽后30 天取拟南芥叶100 mg进行DNA的提取。

（3）拟南芥花特异性启动子AP3的PCR扩增

以拟南芥基因组DNA为模板，使用引物AP3-F和AP3-R进行PCR扩增AP3的启动子片段，PCR的25μl体系为：KOD缓冲液（10×） 2.5μl、KOD 0.5μl、cDNA模板1μl、10mM dNTP 0.5μl、10μM AP3-F引物1μl、10μM AP3-R引物1μl、使用无菌水补足25μl。反应条件为：94℃5min，35个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸60s，68℃反应10min。PCR经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测发现，其长度与预期大小（726bp)一致（见图1）。

（4）AP3片段的回收

    对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，使用胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书对目的片段进行回收。

（5）AP3片段加尾

取1.5 ml灭菌的eppendorf管，依次加入回收的PCR产物14μl、10× Taq DNA聚合酶缓冲液2μl、10mM dNTP 2μl、Taq DNA聚合酶2μl；72℃处理45 min；先加0.18 mL无菌水，再加20μl 3M醋酸钠，混匀，最后加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀60 min，12,000rpm，4℃离心10min。弃上清，75%乙醇洗涤沉淀2次。DNA晾干后加入20μL无菌水溶解沉淀，溶解的DNA置于-20℃保存备用。

（6）AP3片段的T/A克隆和测序

将回收片段连接到pMD18-T载体上，其具体步骤为：向1.5 ml 离心管中分别加入：AP3片段的cDNA 5μl、pMD18-T载体0.5μl、10×T4 DNA连接酶缓冲液 1μl, T4 DNA连接酶 1μl，加无菌水至10μl，用封口膜封好；置于16℃连接4-6h。将100μl 感受态肠杆菌E.coli DH5α加入连接体系中混匀；混合液冰浴30 min，42℃热刺激90 s后，冰浴5 min；加入800μl LB液体培养基，37℃、200 rpm摇床培养45min 使菌体复苏；培养结束后，常规3,000 rpm 离心2 min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1 ml 时，使用移液枪混匀，接入带有Amp抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37℃过夜培养；挑取菌落接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中培养12h，收集菌体，采用质粒抽提试剂盒提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒pMD18-AP3，具体方法为：向0.5 ml的离心管中分别加入：质粒DNA（50ng/μl）2μl、BamH I 0.5μl、Pst I 0.5μl、10×buffer（K）1μl，使用无菌水补足20μl；37℃反应4h；经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测发现，重组质粒pMD18-AP3可酶切出预期大小，将酶切正确的重组质粒pMD18-AP3进行测序验证插入基因的正确性。

（7）表达载体1301-AP3的构建

使用BamHI和PstI对质粒pMD18-AP3和载体PCAMBIA1301（简称1301）进行双酶切，分别获得5’端带有BamHI和3’端带有PstI的AP3片段和1301载体，电泳后分别进行胶回收，16℃连接4-6h；将100μl感受态肠杆菌E.coli DH5α加入6μl连接体系中混匀；混合液冰浴30min，42℃热刺激90s后，冰浴5 min；加入800μl LB液体培养基，37℃、200 rpm 摇床培养45min使菌体复苏；培养结束后，常规3,000 rpm 离心1 min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1 ml时，使用移液枪混匀，接入带有Kan抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37℃过夜培养；挑取菌落接种于LB液体+Kan的培养基，37℃、180rpm培养12h后，提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒1301-AP3，具体方法为：向0.5 ml 的离心管中分别加入：质粒DNA（50ng/μl）2 μl、BamHI 0.5μl、PstI 0.5μl、10×buffer（K）2μl，使用无菌水补足20 μl；37℃反应4h；经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测发现，重组质粒1301-AP3可酶切出预期大小（726bp)的片段（见图2）。将酶切正确的重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序进行序列验证，最后获得花特异表达启动子表达载体1301-AP3。

花特异表达启动子表达载体1301-AP3-CsLOX1的构建

(1) 引物设计：根据NCBI上黄瓜CsLOX1的公布的序列（登录号为U25058），设计两端引物：

    CsLOX1-F：5’-aaaCTGCAGATGTTTGGAATTGGGAAG-3’（含PstI位点）

    CsLOX1-R：5’-aaaGGATCCTTAGATAGAAATACTATTAGG-3’（含BamHI位点）。

（2）黄瓜花蕾总RNA的提取

所用黄瓜品种为华北型黄瓜。取长度约0.7 mm 的花蕾1mg，取材后立刻冻到液氨中，采用TRIzol（Invitrogen，USA）试剂法提取总RNA：加1.5 ml Trizol后，室温放置5 min，使其充分裂解。12,000rpm 离心5 min，弃沉淀。加200 ul氯仿，振荡混匀后室温放置15 min。4℃ 12,000g 离心15 min。吸取上层水相，至另一离心管中。加0.5ml 异丙醇，混匀，室温放置30 min。4℃ 12,000g 离心10 min，弃上清。用1 ml 75%乙醇洗涤2 次沉淀。4℃ 8,000g 离心5 min，弃上清。室温晾干10 min。用50 uL H₂O（Rnase free）溶解RNA。

（3）黄瓜花蕾总cDNA第一链的合成

 黄瓜花蕾RNA用DNaseⅠ处理后用于以Oligo(dT)₁₈为引物的反转录：取RNA 15 uL，加Oligo(dT)₁₈ 1 uL，混匀，70℃保温5min，立即冰水浴，稍离心，依次加入10×M-MLV Buffer 2 uL、dNTP (10mM) 1 uL、RNasin (40U/uL) 1 uL、M-MLV (200U/uL) 1 uL，总体积20 uL，混匀，42℃保温60min，95℃ 10min 灭活M-MLV酶活性，-20℃保存。

（4）CsLOX1基因的扩增

设计特异性引物:CsLOX1-F: 5’-aaaCTGCAGATGTTTGGAATTGGGAAG-3’ (含PstI位点)，CsLOX1-R：5’-aaaGGATCCTTAGATAGAAATACTATTAGG-3’（含BamHI位点），以第一链产物为模板，用长片段、高保真酶KOD-Plus进行PCR 扩增，PCR 反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；68 ℃ 3.0 min，40 个循环；68℃ 5 min。PCR 产物用1.2%琼脂糖进行电泳检测，扩增片段大小约2637bp，与预期大小一致（图3）。

（5）CsLOX1片段的胶回收

     对PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，使用胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书对目的片段进行回收。

（6）CsLOX1片段加尾

取1.5 ml灭菌的eppendorf管，依次加入回收的PCR产物14μl、10× Taq DNA聚合酶缓冲液2μl、10mM dNTP 2μl、Taq DNA聚合酶2μl；72℃处理45 min；先加0.18 mL无菌水，再加20μl 3M醋酸钠，混匀，最后加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀60 min，12,000rpm，4℃离心10min。弃上清，75%乙醇洗涤沉淀2次。DNA晾干后加入20μL无菌水溶解沉淀，溶解的DNA置于-20℃保存备用。

（7）CsLOX1片段的T/A克隆和测序

将回收片段连接到pMD18载体上，其具体步骤为：向1.5 ml 离心管中分别加入：CsLOX1片段的cDNA 5μl、pMD18载体0.5μl、10×T4 DNA连接酶缓冲液 1μl, T4 DNA连接酶 1μl，加无菌水至10μl，用封口膜封好；置于16℃连接4-6h。将100μl 感受态肠杆菌E.coli DH5α加入连接体系中混匀；混合液冰浴30 min，42℃热刺激90 s后，冰浴5 min；加入800μl LB液体培养基，37℃、200 rpm摇床培养45min 使菌体复苏；培养结束后，常规3,000 rpm 离心2 min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1 ml 时，使用移液枪混匀，接入带有Amp抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37℃过夜培养；挑取菌落接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中培养12h，收集菌体，采用质粒抽提试剂盒提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒pMD18-CsLOX1，具体方法为：向0.5 ml的离心管中分别加入：质粒DNA（50ng/μl）2μl、PstI 0.5μl、BamH I 0.5μl、10×buffer（K）2μl，使用无菌水补足20μl；37℃反应4h；然后将酶切正确的重组质粒pMD18-CsLOX1进行测序验证插入基因的正确性。

（8）表达载体1301-AP3-CsLOX1的构建

使用PstI和BglII对质粒1301-AP3进行双酶切，使用PstI和BamHI对载体pMD18-CsLOX1进行双酶切，分别获得5’端带有PstI和3’端带有BamHI的CsLOX1片段，5’端带有PstI和3’端带有BglII的1301-AP3载体（BamHI和BglII为同尾酶），电泳后分别进行胶回收，16℃连接4-6h；将100μl感受态肠杆菌E.coli DH5α加入6μl连接体系中混匀；混合液冰浴30min，42℃热刺激90s后，冰浴5 min；加入800μl LB液体培养基，37℃、200 rpm 摇床培养45min使菌体复苏；培养结束后，常规3,000 rpm 离心1 min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1 ml时，使用移液枪混匀，接入带有Kan抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37℃过夜培养；挑取菌落接种于LB液体+Kan的培养基，37℃、180rpm培养12h后，提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒1301-AP3，具体方法为：向0.5 ml 的离心管中分别加入：质粒DNA（50ng/μl）2 μl、SacI 0.5μl、10×buffer（L）2μl，使用无菌水补足20 μl；37℃反应4h；经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测发现，重组质粒1301-AP3-CsLOX1可酶切出预期约600 bp和360 bp的片段（图4）。将酶切正确的重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序进行序列验证(其核苷酸序列如 SEQ ID NO1所示),最后获得花特异表达启动子表达载体1301-AP3-CsLOX1。

实施例2：1301-AP3-CsLOX1转农杆菌GV3101

（1）农杆菌感受态细胞制备

挑取农杆菌GV3101单菌落接种于5ml YEB培养基中，28℃摇培过夜，按1:100的比例接种于50 ml YEB培养基中扩培，28℃继续培养约6-7h至OD600=0.4-0.6。将菌液置于冰上30min；5,000 rpm，4℃离心5min，弃上清，将菌体悬于10 ml 0.15 M NaCl 中；5,000 rpm，4℃离心5min，弃上清，菌体用1 ml 20 mM CaCl₂，4℃）轻轻悬浮，每管 200μl分装，或加入终浓度为 20％的无菌甘油，-70℃保存。

（2）农杆菌的转化及鉴定

将 10μl 质粒DNA加入200μl农杆菌感受态中，混匀，冰浴30min，液氮冷冻 3-5min，37℃水浴5min，加入1 mlYEB培养基，28℃摇培3-4h。10,000rpm，室温离心 30s，弃上清，加入200μl YEB培养基重悬菌体，涂于YEB培养基上，28℃培养2天；碱裂解法提取农杆菌质粒DNA，酶切验证。质粒再重新转化大肠杆菌（DH5α），过夜培养后，挑取单菌落液体培养，提取质粒DNA，再用酶切鉴定。

实施例3：含1301-AP3-CsLOX1的农杆菌GV3101转化拟南芥

（1）拟南芥的种植

①当年收获的种子种植后4度春化72 h，隔年种子种植后春化24 h。然后转入人工培养室中在相对湿度80%，恒温20-24℃，光照强度80-200 μmol/M2/S，光照周期为8 h黑暗﹑16 h光照培养。所用的土为3份蛭石，1份珍珠岩和2份黑土混合而成。

② 将营养土用塑料盆装好，在托盘里加入营养液，待营养土吸水潮湿后，开始点种。

③ 将拟南芥的种子放在平铺的纸上，用牙签将拟南芥的种子点在土上。用保鲜膜盖好，暗培养两天，四天后揭掉保鲜膜正常培养。

 ④ 土稍干时可再浇一次营养液，以后浇水即可。若要做转化，待抽薹2到3cm时，剪除顶花序，用营养液再浇灌一次。

⑤ 种子的收集：拟南芥完全成熟后，停止浇水待植株干燥后将拟南芥剪下放在一张干净的光面纸上收集种子，尽量将杂物去干净，便于筛选。

  （2）拟南芥的转化和转化子的筛选

① 制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10 ml，在转化前一天晚上，转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液OD600当在1.2到1.6之间。室温5,000 rpm离心10 min。弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使OD600在0.8左右。

② 先将植株上已长出的果荚及开放的花剪掉，再将农杆菌悬浮液直接喷洒至整个植株，主要喷洒在花序上。盖上透明的塑料盖子以保持湿度，移入恒温室避光培养，第二天可开盖，正常光照培养。

③ 一周后再喷洒一次，收种子，在相应的抗性1/2 MS平板上筛选转化子。

④ 转化子的筛选：种子消毒，先用70%乙醇浸泡10 min，在上述处理时要不时地使种子悬浮，并换一次70%乙醇。最后用无菌水洗四次。

⑤ 处理后的种子用Top agar（0.1%琼脂水溶液）均匀涂布在相应的抗性固体筛选培养基表面，每块150 mm直径的平皿最多种1500棵。

⑥ 4℃春化2到3天，移入22℃恒温室培养。将筛选出的转化子长到合适的大小后移栽到土壤中。

实施例4：转基因植株的鉴定和分析

(1)拟南芥DNA的提取

将适量的经筛选的拟南芥叶片放入1.5 ml的离心管中，加入400 μl的SDS抽提缓冲液，用蓝色小棒研磨成浆状，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），猛烈摇匀，12,000 rpm，离心10 min。取上清至新的离心 管中，加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3M 醋酸钠 (PH5.2)，剧烈混匀使DNA成团，放入-20℃沉淀2hr以上。随后12,000 rpm，离心10 min。弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤一次后室温晾干，加适量的TE或超纯水溶解。

（2）转基因拟南芥植株的鉴定

以抽提的DNA为模板、使用引物CsLOX1-F1：CTGCAGTTCCTACTCCCGAAGTT GTC和CsLOX1-R1：TCTAGAAGAAGCAATGTTCTTGTGGC进行PCR扩增CsLOX1片段，PCR的25μl体系为：PCR 缓冲液（10×） 2.5μl、Taq 0.5μl、cDNA模板2μl、10mM dNTP 0.5μl、10μM CsLOX1-F引物1μl、10μM CsLOX1-R引物1μl、使用无菌水补足25μl。反应条件为：94℃5min，35个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，72℃反应10min。检测结果如图5所示。抽提阳性植株花蕾的总RNA，反转录后合成cDNA第一链，以CsLOX1-F1和CsLOX1-R1为引物进行RT-PCR分析，反应体系和程序同上。内参为CsACTIN基因，引物序列为：CsACTIN-F: GACATTCAATGTGCCTGCTATG，CsACTIN-R： CATACCGATGAGAGATGGCTG，PCR的25μl体系为：PCR 缓冲液（10×）2.5μl、Taq 0.5μl、cDNA模板2μl、10mM dNTP 0.5μl、10μM CsACTIN-F引物1μl、10μM CsACTIN-R引物1μl、使用无菌水补足25μl。反应条件为：94℃5min，26个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，72℃反应10min。检测结果见图6所示。

(3)转基因拟南芥植株表型分析

通过PCR和RT-PCR的结果，对获得的阳性植物进行观察，获得的CsLOX1转基因植株的花瓣呈封闭状、花瓣发育不完整或缺失、雄蕊退化，雌蕊的数目增加，不正常异位生长的胚珠和柱头明显可见(图7）。

SEQ ID  NO：1

〈210〉：1

〈211〉:2637

〈212〉：DNA

〈213〉：黄瓜（Cucumis sativus L.）

〈400〉: 1

ATGTTTGGAA TTGGGAAGAA CATCATTGAA GGGGCCTTGA ATACAACTGG AGATCTTGCA  60

GGTTCTGTTA TCAATGCTGG TGGTAACATT TTAGATAGAG TTTCCAGTCT TGGAGGAAAC  120

AAAATCAAAG GGAAAGTGAT TCTTATGAGA AGCAATGTTT TGGATTTCAC TGAATTTCAT  180

TCCAATCTTC TTGATAACTT CACTGAGCTC TTGGGTGGTG GTGTTTCTTT CCAACTCATT  240

AGTGCCACTC ATACTTCAAA TGACTCAAGA GGGAAAGTTG GGAACAAGGC ATATTTGGAG  300

AGGTGGCTAA CTTCAATCCC ACCACTGTTT GCTGGAGAAT CAGTGTTCCA AATCAACTTT  360

CAATGGGATG AAAATTTTGG ATTTCCAGGA GCTTTCTTCA TAAAAAATGG ACATACAAGT  420

GAATTCTTTC TCAAATCTCT CACTCTTGAT GATGTTCCTG GCTATGGCAG AGTCCATTTT  480

GATTGCAATT CTTGGGTTTA CCCTTCTGGA AGATACAAGA AAGATCGCAT TTTCTTTGCC  540

AATCATGTTT ATCTTCCAAG TCAAACACCA AACCCTCTTC GTAAGTATAG AGAGGAAGAA  600

TTGTGGAATT TGAGAGGAGA TGGAACAGGA GAAAGAAAGG AATGGGATAG AATTTATGAC  660

TATGATGTTT ATAATGACAT TGCTGACCCT GATGTTGGTG ATCATCGTCC TATTCTCGGT  720

GGGACGACCG AATATCCTTA CCCTCGTAGG GGAAGAACAG GACGACCACG ATCAAGAAGA  780

GACCACAATT ATGAGAGCAG ATTGTCACCA ATAATGAGCT TAGACATCTA TGTACCAAAA  840

GATGAAAACT TTGGGCATTT GAAGATGTCA GATTTCCTTG GTTATACATT AAAAGCACTT  900

TCGATATCAA TCAAACCAGG ACTTCAATCC ATATTTGATG TAACTCCAAA TGAATTTGAC  960

AATTTTAAAG AAGTTGATAA TCTCTTTGAG AGAGGTTTTC CCATTCCATT TAATGCTTTT  1020

AAGACCCTCA CTGAGGACCT CACTCCACCT TTGTTCAAAG CACTCGTGAG GAATGATGGT  1080

GAAAAATTCC TCAAATTTCC TACTCCCGAA GTTGTCAAAG ATAATAAAAT AGGATGGAGC  1140

ACTGATGAAG AATTTGCAAG AGAAATGTTA GCAGGACCCA ATCCTCTATT GATTCGTCGT  1200

CTTGAAGCTT TTCCACCAAC AAGTAAGCTT GACCCAAATG TTTATGGGAA TCAAAACAGT  1260

ACCATCACTG AAGAACACAT AAAGCATGGT TTAGATGGTC TTACGGTTGA TGAGGCAATG  1320

AAGCAAAACA GGCTCTACAT AGTGGATTTC CATGATGCAT TAATGCCCTA TCTTACAAGG  1380

ATGAATGCAA CATCAACAAA AACATATGCC ACAAGAACAT TGCTTCTTTT GAAAGATGAT  1440

GGGACTTTGA AGCCATTGGT TATTGAGTTA AGCTTGCCAC ATCCTCAAGG AGATCAACTT  1500

GGTGCCATTA GCAAACTATA CTTTCCAGCT GAAAATGGAG TTCAAAAATC CATTTGGCAA  1560

TTGGCTAAAG CTTATGTAAC TGTTAATGAT GTTGGCTACC ATCAACTTAT TAGTCATTGG  1620

TTGCATACTC ATGCTGTACT TGAGCCATTT GTGATTGCAA CACATAGACA ATTGAGCGTG  1680

CTTCATCCAA TCCATAAGTT GCTTGTTCCT CATTACAAAG ACACTATGTT TATAAATGCA  1740

TCTGCAAGAC AAGTTTTGAT CAATGCCAAT GGTCTTATCG AAACAACCCA TTATCCATCA  1800

AAATATTCAA TGGAGTTGTC ATCTATCTTG TACAAGGATT GGACCTTCCC TGATCAAGCA  1860

TTACCTAATA ATCTCATGAA GAGAGGACTA GCTGTGGAGG ACTCAAGTGC CCCCCATGGA  1920

CTTAGATTGC TAATAAATGA TTATCCATTT GCTGTTGATG GTCTTGACAT TTGGTCAGCC  1980

ATTAAAACAT GGGTACAGGA TTATTGCTGT CTCTACTACA AAGATGACAA TGCAGTACAA  2040

AATGACTTTG AACTCCAATC TTGGTGGAAT GAGCTAAGAG AGAAAGGCCA CGCTGACAAG  2100

AAACATGAAC CATGGTGGCC AAAAATGCAA ACTTTAAGTG AATTAATCGA ATCCTGCACT  2160

ACAATTATAT GGATTGCTTC AGCTCTTCAT GCCGCAGTTA ACTTTGGACA ATATCCCTAC  2220

GGAGGCTATA TTCTCAATCG ACCAACTACA AGTCGTAGGT TCATGCCTGA AGTTGGCACG  2280

GCTGAGTACA AAGAACTGGA ATCGAATCCC GAAAAAGCTT TCTTGAGAAC AATATGTTCA  2340

GAATTACAAG CACTTGTTAG TATTTCAATT ATTGAAATCT TGTCAAAGCA TGCTTCTGAT  2400

GAAGTTTATC TTGGACAAAG AGCTTCAATT GATTGGACTT CAGATAAAAT TGCATTGGAA  2460

GCATTTGAGA AATTTGGGAA AAATTTATTT GAAGTTGAGA ATAGGATCAT GGAAAGGAAT  2520

AAAGAGGTGA ATTTGAAGAA TAGATCTGGA CCTGTTAATT TGCCTTATAC TCTACTTGTT  2580

CCATCAAGTA ATGAAGGACT CACTGGAAGA GGAATTCCTA ATAGTATTTC TATCTAA     2637

Claims (5)

1.黄瓜CsLOX1基因，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO1所示。

2.黄瓜CsLOX1基因花特异表达载体，其特征在于，所述表达载体为1301-AP3-CsLOX1，含有来自黄瓜脂氧合酶CsLOX1，基因的上游连有拟南芥AP3花特异启动子。

3.根据权利要求2所述的黄瓜CsLOX1基因花特异表达载体，其特征在于，所述表达载体由下述方法构建而成：

(1)设计拟南芥花特异性启动子AP3 特异性引物，其中AP3-F引物引入了BamHI位点，AP3-R引物引入了PstI位点：AP3-F: 5’-aaaGGATCCAACTTGTGATTCCTTCTTAA-3’,AP3-R: 5’- aaaCTGCAGATTCTTCTCTCTTTGTTTAATC-3’,以拟南芥基因组为模板进行PCR扩增获得AP3启动子；回收并纯化AP3启动子，将其连接到pMD18载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-AP3；

（2）使用BamHI和PstI酶切pMD18-AP3和表达载体1301，回收后进行连接、转化感受态细胞，获得中间表达载体1301-AP3；

（3）根据NCBI上黄瓜CsLOX1的公布序列设计两端引物，其中CsLOX1-F引物引入了PstI位点，CsLOX1-R引物引入了BamHI位点： CsLOX1-F：5’-aaaCTGCAGATGTTTGGAATTGGGAAG-3’， CsLOX1-R：5’-aaaGGATCCTTAGATAGAAATACTATTAGG-3’,以黄瓜花蕾的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得CsLOX1全长；回收CsLOX1的cDNA全长，将其连接到pMD18载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-CsLOX1；

（4）使用PstI和BamHI酶切pMD18-CsLOX1，回收CsLOX1片段，使用PstI和BglII酶切中间表达载体1301-AP3，回收大片段，将CsLOX1片段与载体1301-AP3大片段进行连接、转化感受态细胞，获得植物表达载体1301-AP3-CsLOX1。

4.如权利要求2所述黄瓜CsLOX1基因花特异表达载体的应用，其特征在于，将植物表达载体1301-AP3-CsLOX1导入植物以改变植物的花型。

5.如权利要求4所述黄瓜CsLOX1基因花特异表达载体的应用，其特征在于，将植物表达载体1301-AP3-CsLOX1转入农杆菌GV3101，再转入到拟南芥中，收获植株的种子，晾干后通过潮霉素筛选获得抗性苗，再通过PCR鉴定和RT-PCR检测后获得转基因植株。