CN106967728B

CN106967728B - 一种南瓜抗逆基因CmNAC1及其应用

Info

Publication number: CN106967728B
Application number: CN201710241324.8A
Authority: CN
Inventors: 别之龙; 曹海顺; 孔秋生; 黄远; 程菲
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2017-04-13
Filing date: 2017-04-13
Publication date: 2020-04-24
Anticipated expiration: 2037-04-13
Also published as: CN106967728A

Abstract

本发明公开了一种南瓜抗逆基因CmNAC1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因工程领域。本发明还公开了该基因构建的超表达载体pHellsgate8‑CmNAC1，并用该表达载体转化拟南芥，获得超表达转化植株。结果显示超表达拟南芥导致整体植株表型发生较大变化，叶色变浅、植株变矮、育性、分枝特性改变等，同时对干旱、盐害、低温胁迫抗性也明显提升，因此超表达载体可用于作物的遗传改良。

Description

一种南瓜抗逆基因CmNAC1及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，发明涉及南瓜抗逆基因CmNAC1及蛋白的应用。

背景技术

南瓜是一种在全世界各地广泛栽培的瓜类作物，作为葫芦科蔬菜中的一员，其种质资源较为丰富，生长势强，环境胁迫适应能力好。南瓜果实和幼嫩茎尖可食用，在生产上除作为蔬菜栽培外，还被广泛用作其他葫芦科作物的砧木，提高西瓜、黄瓜等重要葫芦科作物的抗逆性和对土传病害的抗性。因此培育抗逆性强、品质优的南瓜品种显得尤为迫切。

植物响应逆境胁迫的分子适应机理在拟南芥、水稻等模式植物中已经取得较好的进展，利用基因工程手段获得抗逆植物品种已成为遗传改良的重要措施。南瓜作为一种重要的葫芦科作物，其抗逆分子机理研究依然处于起步状态，因此挖掘和利用南瓜抗逆相关基因具有重要意义。NAC转录因子是植物特有的一类转录因子，前人在模式植物的研究中发现其在调控植物发育及抗逆性方面发挥着重要作用，NAC基因家族中有部分成员响应多重胁迫，并参与调控植物的抗逆性，然而在南瓜中关于抗逆相关的NAC转录因子研究尚未见报导。本申请通过对南瓜盐胁迫下转录组学分析，获得一个受盐胁迫诱导上调表达较为明显的NAC转录因子，通过氨基酸比对、亚细胞定位等实验明确了该蛋白的基本功能，同时构建了植物过表达载体，转化了模式植物拟南芥，研究了CmNAC1在模式植物拟南芥中的生物学功能。

发明内容

本发明提供了一种南瓜抗逆基因CmNAC1，并且通过该基因构建植物过表达载体，得到了过表达转基因拟南芥。后期研究发现转基因植物的表型和非生物抗性都有相应的改变，如植株颜色变浅、矮化，对干旱、盐、低温胁迫的抗性提升等。因此可以利用该基因或者超表达载体对作物抗逆性及育性、株型、叶色等重要相关农艺性状进行遗传改良。

本发明通过以下技术方案实现：

提供了一种南瓜盐胁迫响应基因CmNAC1，其核酸序列为SEQ ID NO.1，对应编码的蛋白质序列为SEQ ID NO.2。

本发明利用pHellsgate8载体构建了超表达载体pHellsgate8-CmNAC1，构建载体所用的引物序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。

本发明提供了该过表达载体及其所转化培养的转基因植物应用。

所述植物为双子叶或是单子叶植物，首选拟南芥、葫芦科、小麦、水稻作物等。

本发明构建超表达载体pHellsgate8-CmNAC1转化农杆菌GV3101，并侵染转化拟南芥得到转基因过表达拟南芥，经验证发现转基因拟南芥干旱、盐、低温等胁迫下相比于野生型拟南芥具有更好的耐受性，且转基因拟南芥在正常生长环境下叶色、叶形、株型、育性上都和野生型拟南芥有较大差异，可以用来对植物表型的综合遗传改良。

附图说明

图1是转基因拟南芥的PCR及表型鉴定结果。

图2是转基因拟南芥育性降低以及分枝特性改变试验结果。

图3是转基因拟南芥的非生物胁迫抗性提升试验结果。

具体实施方式

以下主要结合不同实施例对本发明进行详细说明，而非对本发明保护范围做出的其它形式的限制。

实施例1南瓜转录因子CmNAC1全长CDS序列克隆

1.1植物材料

供试材料为中国南瓜材料N15，具有较好的盐胁迫适应性。种子用55℃热水浸种4h后，进行清洗，沥干水份，用纱布包裹保湿至于30℃催芽箱中避光催芽，待种子露白后播种于50孔穴盘中，至于人工气候室中培养，待种子两叶一心后，挑选生长一致的种苗，定植于营养液栽培系统进行培养。营养液栽培系统如下：栽培容器蓝色水培塑料盆，每盆放入8LHoagland营养液；塑料盆上覆盖长宽适当的聚苯乙烯泡沫板(厚2.5cm)以防止营养液蒸发；泡沫板上均匀钻孔(孔径2cm)，每板9孔，以固定支持植株；营养液以空气泵进行间断均匀通气。每隔5天更换一次营养液，待植株三叶一心时，对植物全株进行取样，液氮速冻后，样品保存于-80℃冰箱。培养室栽培环境条件如下：白天平均温度为28℃，夜晚平均温度为18℃、光周期为12h光照/12h黑暗。

1.2南瓜根系RNA的提取及基因克隆

样品为-80℃冻存的南瓜植物材料，将南瓜苗在液氮状态下磨碎后，取0.1g样品进行RNA的提取，使用

reagent(Trans，中国)提取样品的总RNA，具体步骤参照使用说明书。使用TransScriptTM One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(Trans,中国)试剂盒，按照使用指南进行RNA的反转录，获取cDNA模板。根据实验室南瓜转录组数据并结合NCBI ORF finder发现CmNAC1基因编码框长度879bp(CDS)，编码292氨基酸。而后使用primer3plus网页软件设计克隆引物，得到结果为CmNAC1F(5’-ATGGCCGCCGATTTACAGTT-3’)和CmNAC1R(5’-TCAAAATGGCTTCTGAAGGTAC-3’)，利用该引物和以上cDNA为模板，使用高保真酶2×High-Fidelity Master Mix(Tsingke，中国)进行PCR扩增，获得PCR产物后链接T载体，转化大肠杆菌TranT1感受态，送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，进而得到CmNAC1DNA序列(SEQ ID NO.1)，并从NCBI下载获取已知棉花GhNAC2、大豆GmNAC2、拟南芥CUC1和AtATAF1蛋白和CmNAC1蛋白质序列(SEQ ID NO.2)进行氨基酸比对分析其保守结构域。结果表明CmNAC1是一个典型的NAC转录因子，NAC domain位于N端，约由150个氨基酸组成，C端则为一个转录激活结构域。

实施例2南瓜CmNAC1为核定位的转录因子

转录因子一般多在细胞核中发挥作用，为证实其核定位情况，使用gateway方法将CmNAC1基因全长构建到pK7FWG2载体上，接头引物为NAC1attB1-F(5’-AAAAAGCAGGCTTCACCATGGCCGCCGATTTACAGTTG-3’)和NAC1attB1-R(5’-AGAAAGCTGGGTCAAATGGCTTCTGAAGGTACATGAAC-3’)，分别进行BP和LR反应，转化大肠杆菌TranT1感受态，经测序验证载体构建无误后，菌液扩大培养，提取重组质粒，转化农杆菌GV3101，挑取阳性克隆并鉴定，摇菌至OD值为0.8-1.0，离心收集菌体，用MMA侵染液悬浮菌体至OD值0.5，常温黑暗静置2h注射烟草，以空载的含pK7FWG2的GV3101注射烟草为阴性对照。利用激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位情况，使用DAPI为核定位marker。结果显示，CmNAC1与DAPI共定位于细胞核中，在细胞其它部位看不到荧光，而空载GFP在细胞核与细胞质中都有较明显定位。由此可知该基因定位于细胞核，可能参与南瓜逆境胁迫下基因的表达调控。

实施例3南瓜转录因子CmNAC1基因功能的验证

3.1CmNAC1基因植物表达载体及拟南芥转化

根据对植物超表达pHellsgate8载体多克隆位点分析，选用XhoI和XbaI酶(Takara，日本)对载体进行线性化，并设计重组正向引物CmNAC1gate8F(5’-CATTTGGAGAGGACACGCTCGAGATGGCCGCCGATTTACAGTT-3’)和反向引物CmNAC1gate8R(5’-TCTCATTAAAGCAGGACTCTAGATCAAAATGGCTTCTGAAGGTAC-3’)进行PCR反应，同源重组的方法具体操作方法参照ClonExpressTM II One Step Cloing Kit(Vazyme，中国)，转化大肠杆菌TranT1感受态，经测序验证无误后，菌液扩大培养，提取重组质粒，即为pHellsgate8-CmNAC1植物过表达载体。将构建好的植物表达载体转化农杆菌感受GV3101，然后采用蘸花法转化拟南芥，将T0代种子播种于MS添加1％蔗糖和50mg/L的培养基中进行筛选，获得转基因阳性植株16株。并对T0种苗进行阳性鉴定，单株留种后将T1代种苗播种于MS添加1％蔗糖和50mg/L的培养基中进一步筛选并统计分离比，将符合3:1的阳性种苗继续种植，收获种子后继续纯化获取足够的种子用于后续实验。

取表型稳定的8株转基因拟南芥和野生型拟南芥(WT、OE3、OE11、OE15、OE17、OE19、OE24、OE26、OE28)使用CTAB法提取植物基因组DNA，选用植物表达载体特异性引物作为PCR鉴定引物，分别为35SF(5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’)和OCT-R(5’-CGTCTCGCATATCTCATTAAAGC-3’)，使用2×EasyTaq PCR SuperMix(Trans,中国)进行PCR扩增，结果可知全部转基因系都为阳性(图1A上)。同时使用Trizol提取拟南芥RNA进行反转录(方法同上)，以cDNA为模版进行RT-PCR鉴定，确定CmNAC1基因在拟南芥中过表达情况。半定量引物为CmNAC1-RT-F(5’-GGGATTAAGAAGGCGTTGGT-3’)和CmNAC1-RT-R(5’-GAACTCCGACGACATCACCT-3’)，基因特异性引物，内参基因为拟南芥AtActin基因。结果显示，OE11和OE15有较弱条带，而OE19和OE26、OE28条带较亮为过表达系(图1A中)，内参结果(图1A下)。后期分析发现转基因表达量较低株系同野生型表型较为一致(图1B右)，而过表达植株和野生型表型具较大差异(图1B左)。且过表达株系表型稳定，在T2依然表现出相同表型，其中OE19(图1C左)和OE26(图1C中)为过T2代表达系，WT为野生型(图1C右)，最终选定两个T2代过表达转基因系OE19、OE26和WT野生型拟南芥进行下一步的表型及功能分析。

3.2南瓜CmNAC1转基因拟南芥的表型分析

3.2.1转基因拟南芥的叶色的变浅

将野生型和转基因过表达拟南芥分别定植于含有泥炭土的营养钵中，每盆9株，置于光照培养箱中JNR-RXZ(宁波江南，中国)，生长5周后能够明显观察出转基因拟南芥叶色呈现出淡绿色(图1C)，用spad分别测量野生型和转基因拟南芥植株叶绿素的相对含量发现OE19、OE26和WT的相对叶绿素含量值分别为22.3、22.7和29.1(spad值)，可知转基因拟南芥的相对叶绿素含量显著低于野生型拟南芥。并且在转基因拟南芥生长后期叶片衰老过程中叶绿素更易脱色，表现为衰老叶片白化，而野生型拟南芥则在衰老过程中明显积累更多的花青素及类胡萝卜素而呈现出紫红色。

3.2.2转基因拟南芥出现矮化表型

将野生型和转基因过表达拟南芥分别播种于基质中，出芽一周后对拟南芥的胚轴进行测量，OE19、OE26和WT胚轴长分别为4.1mm、4.1mm和8.0mm。定植于基质7周后，OE19、OE26和WT株高分别为20.8cm、26.4cm、40.0cm。可以得知转基因拟南芥胚轴和株高都明显降低，且从拟南芥整株水平上观察发现，转基因拟南芥的叶柄长度及其莲座直径也明显变小，进一步在显微镜下观察发现，转基因拟南芥细胞显著变短，进而使得转基因拟南芥株型更加紧凑，说明该基因对于细胞的伸长和株高的调控具有较大作用。

3.2.3转基因拟南芥育性降低

拟南芥开花结果期观察发现转基因拟南芥开花正常，但结实率变差，种荚短小(图2A)。通过对转基因拟南芥花进行显微观察时发现和株高、胚轴变短结果一样，雄蕊的伸长也受到一定程度抑制，正常情况拟南芥为自花授粉植物，转基因植株雄蕊的变短导致其很难接触到柱头，进而造成授粉困难，结实率严重下降，种子量极少(图2B)，且这一情况可以通过人工辅助授粉进行改善。过表达拟南芥OE19(图2C)和OE26(图2E)的分枝特性和野生型拟南芥WT(图2D)具有较大差异，主要表现为过表达拟南芥主枝不明显，产生了更多的侧枝，顶端优势被抑制，以上说明CmNAC1在调控植物株型和育性方面发挥了重要的作用。

3.2.4超表达CmNAC1基因提高拟南芥非生物胁迫抗性

为评价转基因拟南芥对非生物胁迫的抗性，将定植在营养钵中4周大小的转基因和野生型拟南芥进行非生物胁迫处理，每钵9株，其中盐害采用250mM NaCl进行灌根处理，隔一周处理一次，共处理两次。干旱处理，一次浇足水份后，然后保持控水持续干旱状态，直至拟南芥明显萎蔫出现重度干旱表型后进行重新进行浇水恢复处理，一周后统计成活率。而低温处理，选用-10℃处理1h，然后4℃处理3h，而后置于正常生长环境进行恢复处理。

持续干旱处理两周后发现野生型拟南芥先出现萎蔫表型，并且大量积累花青素而变成暗紫色，而转基因植株长势良好，没有表现出水份胁迫表型(图3A)，而后重新浇水进行恢复处理，并统计成活率，结果显示转基因拟南芥在干旱情况下成活率远远高于野生型拟南芥(图3D)。盐处理10天后发现野生型拟南芥叶片开始黄化，而转基因拟南芥叶片颜色逐渐变深(图3B)，说明野生型拟南芥的叶绿素大幅度下降，受盐害损伤情况较为严重。盐处理结束后成活率统计表明转基因拟南芥的成活率显著高于野生型拟南芥(图3D)，这也证实了转基因拟南芥耐盐性更好。同样低温处理结果显示转基因拟南芥抗冻性明显提高，转基因拟南芥低温处理后具有更高的成活率(图3D)，后期在常温恢复过程中也发现转基因拟南芥表型恢复效果更好(图3C)。

实施例4南瓜转录因子CmNAC1在转基因植物中的应用

拟南芥的遗传转化

1)培养基及侵染液配制

种子发芽培养基：1/2MS固体培养基

种子筛选培养基：1/2MS固体培养基+50mg/L卡那霉素

拟南芥侵染液：5％蔗糖+0.05％silwetL-77

2)培育方法

拟南芥培养:将野生型拟南芥撒播于以泥炭土为基质的营养钵中，用保鲜膜覆盖保湿，待种子发芽长出真叶后，将生长健壮且一致10d苗龄大小的种苗移栽到新的营养钵中，每营养钵种植一株拟南芥。移栽后浇足水份，用保鲜膜保湿一周左右，拟南芥开出第一花序时剪去第一花序，以便后期长出更多花序，拟南芥盛花时即可用于转基因。(培养条件光16h/黑暗8h，温度为光23℃/黑暗18℃，光照强度为200mmol m-2s-1)。

取检测呈阳性农杆菌菌液按照1:100的比例转入含三中抗生素(kana、rif、genta)的YEB培养基中，28℃黑暗180rpm震荡培养至农杆菌OD600＝1.8-2.0之间。

将培养好的菌液加入50ml无菌离心管中，常温离心5000r，离心5min，收集菌体，弃上清，用拟南芥侵染液重新悬浮菌体，然后将其倒入500ml的烧杯中。将植株(已剪除授粉完成的花及角果)倒扣入烧杯，使花序完全浸入渗透培养基，轻轻晃动烧杯，60s后将植株取出，用滤纸吸干植株上的残留液体，用保鲜膜包裹植株花序，保持湿度，暗培养24h后转入正常生长环境。为了提高转化效率7d后按照上述方法再转化一次。待角果发黄后，收集种子，即为T0代种子。

转基因苗的筛选：取部分T0代种子用给0.1％升汞消毒5min后，用ddH₂O清洗3-5次，播于MS筛选培养基上筛选转基因的T1代植株。置于光照培养箱中进行培养，两周后挑选没有黄化的且长出真叶的种苗转移至基质中，放入人工气候室内培养。

<110> 华中农业大学

<120> 一种南瓜抗逆基因CmNAC1及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 879

<212> DNA

<213> 南瓜

<400> 1

ATGGCCGCCG ATTTACAGTT GCCGGCGGGA TTTAGGTTTC ATCCGACGGA TGACGAACTC 60

GTGATGCATT ACTTGTGCCG TAAATGTGCA TCGCATCCGA TTTCGGCGCC GATCATTGCT 120

GAAATCGATC TGTATAAATA CAACCCTTGG GAACTTCCTG GGCTGGCTTT TTATGGAGAG 180

AAGGAGTGGT ACTTCTTTAC GCCGAGGGAT CGGAAGTATC CGAACGGTTC GAGGCCGAAC 240

AGGGCTGCTG GTAGTGGTTA CTGGAAGGCG ACCGGCGCTG ATAAACCGAT CGGGCAGCCG 300

AAGGCCGTCG GGATTAAGAA GGCGTTGGTG TTTTACGCCG GGAAAGCTCC TAAGGGCGAG 360

AAAACGAATT GGATCATGCA CGAGTACCGG CTCGCTAATT CGGACCCCTC GGCTCGCAAG 420

AAGAACAGTC TTAGGTTAGA CGATTGGGTG CTCTGCCGCA TATACAACAA AAAAGGAGTA 480

ATCGAAAAGC AACCTCCGCA CCACGGTTCA ATAAACTCGC CGGAATTGAA CACAATCGGA 540

TTCATGGAAA ACGATGATCA GGAAGAGAAG CCGGATGTAA TCAACGTTTC CGGCCGAGTT 600

CAGTCGCCGT CGTCCGACCT GATGACCGAA TACATAAACT TCGAATTATC GGATTCGATT 660

CCTCGTCTTT ACACGGATTC GAGCAGCTCC GAGCAGGTGG TGTCGTCGGA GTTCACGAGC 720

GAGGTTCAGA GCCAGCCGAG ATTGAAGGAA GAGTACTCTG GATTCACGTT CAATTACCTG 780

GACGCTTCAC TGGAGGACGC GTTTTGTTCG CAGTTTCCGA CATTAAATCA GATGTCGCCA 840

TTGCAGGATA TGTTCATGTA CCTTCAGAAG CCATTTTGA 879

<210> 2

<211> 292

<212> RNA

<213> 南瓜

<400> 2

MET Ala Ala Asp Leu Gln Leu Pro Ala Gly Phe Arg Phe His Pro Thr

1 5 10 15

Asp Asp Glu Leu Val MET His Tyr Leu Cys Arg Lys Cys Ala Ser His

20 25 30

Pro Ile Ser Ala Pro Ile Ile Ala Glu Ile Asp Leu Tyr Lys Tyr Asn

35 40 45

Pro Trp Glu Leu Pro Gly Leu Ala Phe Tyr Gly Glu Lys Glu Trp Tyr

50 55 60

Phe Phe Thr Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Pro Asn

65 70 75 80

Arg Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala Asp Lys Pro

85 90 95

Ile Gly Gln Pro Lys Ala Val Gly Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr

100 105 110

Ala Gly Lys Ala Pro Lys Gly Glu Lys Thr Asn Trp Ile MET His Glu

115 120 125

Tyr Arg Leu Ala Asn Ser Asp Pro Ser Ala Arg Lys Lys Asn Ser Leu

130 135 140

Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr Asn Lys Lys Gly Val

145 150 155 160

Ile Glu Lys Gln Pro Pro His His Gly Ser Ile Asn Ser Pro Glu Leu

165 170 175

Asn Thr Ile Gly Phe MET Glu Asn Asp Asp Gln Glu Glu Lys Pro Asp

180 185 190

Val Ile Asn Val Ser Gly Arg Val Gln Ser Pro Ser Ser Asp Leu MET

195 200 205

Thr Glu Tyr Ile Asn Phe Glu Leu Ser Asp Ser Ile Pro Arg Leu Tyr

210 215 220

Thr Asp Ser Ser Ser Ser Glu Gln Val Val Ser Ser Glu Phe Thr Ser

225 230 235 240

Glu Val Gln Ser Gln Pro Arg Leu Lys Glu Glu Tyr Ser Gly Phe Thr

245 250 255

Phe Asn Tyr Leu Asp Ala Ser Leu Glu Asp Ala Phe Cys Ser Gln Phe

260 265 270

Pro Thr Leu Asn Gln MET Ser Pro Leu Gln Asp MET Phe MET Tyr Leu

275 280 285

Gln Lys Pro Phe

290

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

CATTTGGAGAGGACACGCTCGAGATGGCCGCCGATTTACAGTT 43

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

TCTCATTAAAGCAGGACTCTAGATCAAAATGGCTTCTGAAGGTAC 45

Claims

1.包含南瓜抗逆基因CmNAC1的超表达载体在转基因作物中的应用，其特征在于：用于提高作物对干旱、盐害、低温胁迫的耐受性，以及对叶色、叶形、株型、育性上的遗传改良，所述超表达载体的构建方法是：根据对pHellsgate8载体多克隆位点分析，选用XhoI和XbaI酶对载体进行线性化，并设计重组正向引物CmNAC1gate8F和反向引物CmNAC1gate8R，进行PCR反应，同源重组后转化大肠杆菌TranT1感受态，菌液扩大培养后提取获得的重组质粒，

正向引物CmNAC1gate8F：

5’-CATTTGGAGAGGACACGCTCGAGATGGCCGCCGATTTACAGTT-3’

反向引物CmNAC1gate8R：

5’-TCTCATTAAAGCAGGACTCTAGATCAAAATGGCTTCTGAAGGTAC-3’，

所述南瓜抗逆基因CmNAC1具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。