CN106591324B

CN106591324B - 谷子SiASR4基因及应用

Info

Publication number: CN106591324B
Application number: CN201611209447.5A
Authority: CN
Inventors: 于静娟; 李建锐; 董杨
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2016-12-23
Filing date: 2016-12-23
Publication date: 2019-11-26
Anticipated expiration: 2036-12-23
Also published as: CN106591324A

Abstract

本发明提供了谷子SiASR4基因及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明首次克隆得到与植物逆境胁迫相关的SiASR4基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，将所述基因转化到植物中可提高植物抗逆性。本发明还提供了用于PCR扩增及检测SiASR4基因的特异引物对，其核苷酸序列如SEQ ID No.2‑3所示；用于实时荧光定量PCR检测SiASR4基因的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ ID No.4‑5所示。本发明的SiASR4基因可用于植物抗逆新品种的培育，具有广阔的应用前景。

Description

谷子SiASR4基因及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及谷子SiASR4基因及应用。

背景技术

干旱及高盐是影响作物产量的两大重要因素。面对非生物胁迫的危害，植物在长期的进化过程中形成了一套复杂而精细的调控机制，包括离子转运、信号转导等方面。当胁迫来临后，大量的胁迫相关的基因被诱导表达，如分子伴侣(Wang W,Vinocur B,ShoseyovO(2004)Role of plant heat-shock proteins and molecular chaperones in theabiotic stress response.Trends Plant Sci.9,244-252)、渗透调节蛋白(Tamura T,Hara K,Yamaguchi Y(2003)Osmotic stress tolerance of transgenic tobaccoexpressing a gene encoding a membrane-located receptor-like protein fromtobacco plants.Plant Physiol.131,454-462)、离子通道蛋白(Ward JM,Pei ZM,Schroeder JI(1995)Roles of ion channels in initiation of signal transductionin higher plants.Plant Cell 7,833-844)及转录因子(Baldoni E,Genga A,CominelliE(2015)Plant MYB transcription factors:their role in drought responsemechanisms.Int.J.Mol.Sci.16,15811-15851)等。因此对胁迫相关基因的鉴定及功能分析有助于育种家对抗逆植物的培育。

ASR蛋白是植物特有的，小的亲水性及热稳定性蛋白，最初在番茄中克隆得到(Iusem N,Bartholomew DM,Hitz WD(1993)Tomato(Lycopersicon esculentum)transcript induced by water deficit and ripening.Plant Physiol.102,1353-1354)。之后陆续在其他植物中发现了ASR蛋白，包括单子叶植物、双子叶植物、草本以及木本植物，然而在拟南芥中却未发现ASR家族基因(Wong CE,Li Y,Labbe A(2006)Transcriptional profiling implicates novel interactions between abioticstress and hormonal responses in Thellungiella,a close relative ofArabidopsis.Plant Physiol.140,1437-1450)。ASR蛋白具有两个高度保守的结构域：第一个区域是包含6～7个组氨酸的N端，可以结合两个Zn²⁺(Kalifa Y,Gilad A,Konrad Z(2004)The water-and salt-stress-regulated Asr1(abscisic acid stress ripening)geneencodes a zinc-dependent DNA-binding protein.Biochem.J.381,373-378)；第二个区域是较长的C端区，通常包含一个核定位信号和ABA/WDS(Water deficit stress)序列(Cakir B,Agasse A,Gaillard C(2003)A grape ASR protein involved in sugar andabscisic acid signaling.Plant Cell 15,2165-2180)。ASR受许多非生物胁迫(干旱、高盐、低温、渗透、双氧水及脱落酸等)的诱导表达(Hu W,Huang C,Deng X(2013)TaASR1,atranscription factor gene in wheat,confers drought stress tolerance intransgenic tobacco.Plant Cell Environ.36,1449-1464)。尽管它的生理作用机制尚不清楚，但相关研究表明该基因可能作为一个转录调控复合体，在植物衰老、抗逆、果实成熟、葡萄糖代谢及花粉成熟等生长发育时期起着重要作用(Iusem N,Bartholomew DM,Hitz WD(1993)Tomato(Lycopersicon esculentum)transcript induced by water deficit andripening.Plant Physiol.102,1353-1354)。

番茄ASR基因SlASR1，其在细胞质中的无序结构可以稳定蛋白，防止在反复冻融的过程中造成蛋白变性，表明SlASR1在细胞质中可以作为分子伴侣发挥功能(Konrad andBar-Zvi(2008)Synergism between the chaperone-like activity of the stressregulated ASR1protein and the osmolyte glycine-betaine.Planta 227,1213-1219)。小麦TaASR1可以作为转录因子调控胁迫应答基因及ROS清除相关基因的表达，从而增强小麦非生物胁迫的耐受力(Hu W,Huang C,Deng X(2013)TaASR1,a transcription factorgene in wheat,confers drought stress tolerance in transgenic tobacco.PlantCell Environ.36,1449-1464)。水稻OsASR5可以结合铝胁迫应答基因启动子的顺式作用元件，调控这些基因的表达(Arenhart RA,Schunemann M,Bucker NL(2016)Rice ASR1andASR5are complementary transcription factors regulating aluminium responsivegenes.Plant Cell Environ.39,645-651)。在拟南芥中过表达香蕉ASR基因可以增强植株对干旱及高盐的胁迫耐受能力(Zhang L,Hu W,Wang Y(2015)The MaASR gene as acrucial component in multiple drought stress response pathways in Arabidopsis.Funct.Integr.Genomic.15,247-260)。在烟草中过表达谷子ASR基因SiASR1，可以增强转基因烟草对干旱及氧化胁迫的耐受能力(Feng Z,Xu Z,Sun J(2016)Investigation ofthe ASR family in foxtail millet and the role of ASR1in drought/oxidativestress tolerance.Plant Cell Rep.35,115-128)。此外，转录组及蛋白组学分析同样也表明了ASR在响应ABA信号以及抵抗非生物胁迫过程中起到非常重要的作用(Virlouvet L,Jacquemot MP,Gerentes D(2011)The ZmASR1protein influences branched-chainamino acid biosynthesis and maintains kernel yield in maize under water-limited conditions.Plant Physiol.157,917-936)。

谷子是中国及印度非常重要的粮食作物，可以在干旱及半干旱地区生长。谷子是C4植物，抗旱性强、基因组小(约510Mb)、自花授粉、生长周期短，这些都使其具有成为模式作物的优势(Zhang G,Liu X,Quan Z(2012).Genome SEQuence of foxtail millet(Setaria italica)provides insights into grass evolution and biofuelpotential.Nat.Biotechnol.30,549-554)。由于谷子具有强的耐旱性及对水的高效利用率,因此鉴定该植物的胁迫相关基因是至关重要的。ASR作为一类小分子蛋白,在植物生长发育和响应生物与非生物胁迫中发挥了重要的作用。SiASR4基因功能的研究将有助于了解ASR基因在谷子抵抗逆境胁迫作用中的分子机制,为植物抗逆分子育种提供基因资源。

发明内容

本发明的目的是提供一种从谷子(Setaria italica)叶片cDNA中克隆得到的谷子SiASR4基因。

本发明的另一目的是提供谷子SiASR4基因在提高植物抗逆境胁迫中的应用。

为了实现本发明目的，本发明以谷子叶片cDNA为模版，根据序列开放阅读框区段设计引物，克隆得到谷子SiASR4基因(SiASR4基因)。该基因的序列全长为309bp，包为双链核酸类型，线性，其核苷酸序列为：SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

通过对Phytozome数据库的检索，发现SiASR4基因编码蛋白与禾本科狗尾草ASR亲缘关系最近，其次是水稻ASR。SiASR4蛋白包含ABA/WDS结构域。亚细胞定位表明SiASR4分布于整个细胞中。荧光定量PCR分析SiASR4基因的表达模式，表明其在谷子根、茎、叶及成熟种子等组织中均表达，且在种子和根中的表达量较高。此外，SiASR4基因的表达受到ABA、PEG和NaCl的诱导。

本发明提供SiASR4基因以及上述生物材料在提高植物抗逆境胁迫中的应用。

所述植物抗逆境胁迫是指抗旱性和抗盐性。所述植物包括但不限于拟南芥、谷子。

本发明提供了用于检测谷子SiASR4基因的特异性引物对，其特征在于，所述特异性引物对的核苷酸序列为：

上游引物：5'-ATGGGTCACCACCACCACGA-3'(SEQ ID No.2)

下游引物：5'-TTAATGGTGGTGCTGGTGCC-3'(SEQ ID No.3)；

其中，序列如SEQ ID No.2-3所示的引物对用于PCR扩增及检测谷子SiASR4基因。

本发明提供了序列如SEQ ID No.4-5所示的引物对用于实时荧光定量PCR检测谷子SiASR4基因。

本发明构建了含有SiASR4基因的拟南芥和谷子过表达载体及SiASR4-RNAi转化谷子的干扰载体。

在一个优选的实施方式中，拟南芥表达载体上的表达盒是由CaMV 35S启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的3’转录终止区域构成，选择标记基因为新霉素磷酸转移酶II基因(nptII)。优选地，所述表达载体的出发载体为pCAMBIA2300载体，构建得到重组质粒pCAMBIA2300-SiASR4-flag，其中SiASR4基因正向插入，且在CaMV35S双启动子驱动下。

在另一个优选的实施方式中，谷子过表达载体上的表达盒是由玉米Ubiquitin启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的3’转录终止区域构成，选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。优选地，所述表达载体的出发载体为pCOU载体，构建得到重组质粒pCOU-SiASR4-flag，其中SiASR4基因正向插入，并且在Ubiquitin启动子驱动下。谷子干扰载体上的表达盒是由是由玉米Ubiquitin启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的3’转录终止区域构成，选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。优选地，所述表达载体的出发载体为pCOU载体，构建得到重组质粒pCOU-SiASR4-RNAi，其中SiASR4基因分别正向及反向插入到pCOU载体上，中间部分以GUS基因连接，并且在Ubiquitin启动子驱动下。

本发明将含有所述SiASR4基因的重组表达载体转化植物，如拟南芥和谷子，获得了抗逆性提高的转基因植物。

在一个优选的实施方式中，将含有所述SiASR4基因的表达载体转化拟南芥，获得的转基因植株抗旱和抗盐性提高。

另一个优选的实施方式中，将含有所述SiASR4基因的过表达载体转化谷子，获得的转基因植株抗旱和抗盐性提高。

本发明首次克隆得到与植物逆境胁迫相关的SiASR4基因，将所述基因转化到植物中可提高植物抗旱性和/或抗盐性。本发明提供了一种利用SiASR4基因增加植物抗逆性的新方法，可用于植物抗逆新品种的培育，对于农业生产具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明实施例2中含有SiASR4基因的拟南芥表达载体的T-DNA区域图。

图2为本发明实施例3中过表达及干扰SiASR4基因的谷子表达载体T-DNA的区域图。

图3为本发明实施例6中转基因拟南芥中SiASR4基因的检测结果；其中，A图为PCR检测结果，B图为semi-qRT-PCR扩增结果。

图4为本发明实施例7中转基因谷子中SiASR4基因的检测结果；其中，A为过表达株系PCR检测结果，B为干扰株系PCR检测结果，C为qRT-PCR扩增结果。

图5为本发明实施例8中SiASR4转基因拟南芥的抗逆性分析结果；其中，A为转SiASR4基因拟南芥植株的种子分别点播在MS培养基及含有75mM NaCl和100mM NaCl的MS培养基上，培养10天后拟南芥的生长情况，B为不同处理条件下转基因拟南芥植株见光生长10天后的鲜重，C为转SiASR4基因拟南芥植株在MS培养基上生长5天，移苗到含有150mM NaCl和200mM NaCl的MS培养基上，培养7天后拟南芥的生长情况，D为不同处理条件下幼苗期转基因拟南芥植株见光生长7天后的侧根数，E为不同处理条件下幼苗期转基因拟南芥植株见光生长7天后的鲜重。

图6为本发明实施例9中SiASR4转基因拟南芥苗期抗逆性分析结果；其中，A为转SiASR4基因拟南芥植株在MS培养基上生长5天后移苗到花盆中2周，400mM NaCl处理14天的生长情况，B为存活率，C为叶绿素含量测定结果，D为A为转SiASR4基因拟南芥植株在MS培养基上生长5天后移苗到花盆中2周，干旱处理18天复水5天的生长情况，E为存活率统计，F为叶绿素含量测定结果。

图7为本发明实施例10中SiASR4转基因谷子萌发阶段的抗逆性分析结果；其中，A为萌发生长8天的抗逆性分析，B为芽长、根长及耐逆萌发指数测定结果。

图8为本发明实施例11中SiASR4转基因谷子幼苗的抗盐性分析结果；其中，A为转基因谷子幼苗分别在处理前、400mM NaCl处理14天和处理20天胁迫下的生长状态，B为存活率统计及叶绿素含量测定结果。

图9为本发明实施例11中SiASR4转基因谷子的抗旱性分析结果；其中，A为转基因谷子幼苗在处理前、干旱处理10天和处理13天复水5天后的生长状态，B为复水后的存活率统计及叶绿素含量测定结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1植物抗逆胁迫相关基因SiASR4的克隆

小量提取谷子叶片总RNA，经反转录后得到cDNA，根据序列开放阅读框区段设计引物，以cDNA为模版，用SEQ ID NO.2-3为引物进行PCR扩增，扩增得到约300bp的片段，将该片段用庄盟公司胶回收试剂盒回收后与pMD19T载体连接并转化大肠杆菌感受态细胞。测序结果表明克隆得到的片段包含一个309bp的完整开放阅读框，编码一个含102个氨基酸的蛋白，序列如SEQ ID NO.10所示。

实施例2用于拟南芥中表达SiASR4基因的表达载体的构建及农杆菌转化

表达盒是由花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的3’转录终止区域(Depicker A,Stachel S.,Dhaese P,Zam bryski P,Goodman HM(1982).Nopaline synthase:transcript mapping and DNA SEQuence.J Mol.Appl Genet.1,561-573)组成，选择标记基因为新霉素磷酸转移酶II基因(nptII)。其T-DNA区域如图1所示。

以pMD19T-SiASR4质粒为模版，利用PCR方法扩增两端带有Kpn I和Sac I酶切位点的SiASR4-flag基因片段，连接到pMD19T载体上，测序正确后用Kpn I和Sac I进行双酶切，回收340bp的片段。pCAMBIA2300载体含有过表达启动子CaMV35S，用Kpn I和Sac I进行双酶切，回收载体大片段。将载体和目的片段连接，转化大肠杆菌感受态细胞。得到由CaMV 35S启动子驱动的SiASR4基因正向插入的重组质粒pCAMBIA2300-SiASR4-flag。将pCAMBIA2300-SiASR4-flag采用电击法直接转化农杆菌GV3101，获得含有重组质粒pCAMBIA2300-SiASR4-flag的农杆菌GV3101。农杆菌转化技术参见(Mark M,Gregory J,Anath D(1990).Efficient transformation of Agrobacterium tumefaciens byelectroporation.Gene 16,6127-6145)。

实施例3用于谷子中表达SiASR4基因及干扰SiASR4基因的表达载体的构建及农杆菌转化

谷子过表达载体上的表达盒是由玉米Ubiquitin启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的3’转录终止区域(Depicker A,Stachel S.,Dhaese P,Zam bryski P,GoodmanHM(1982).Nopaline synthase:transcript mapping and DNA SEQuence.J Mol.ApplGenet.1,561-573)构成，选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。其T-DNA区域如图2所示。

以含有带flag-tag标签的SiASR4基因的质粒为模板，利用PCR方法得到两端带有BamH I和Sac I酶切位点的SiASR4-flag基因片段，连接到pMD19T载体上，测序正确后用BamH I和Sac I进行双酶切，回收340bp的片段。用BamH I和Sac I对表达载体pCOU(含玉米Ubiquitin启动子)进行双酶切，回收载体大片段。将载体和目的片段连接，转化大肠杆菌感受态细胞，得到由Ubiquitin启动子驱动的SiASR4基因正向插入的重组质粒pCOU-SiASR4-flag。将pCOU-SiASR4-flag采用电击法直接转化农杆菌LBA4404，获得含有重组质粒pCOU-SiASR4-flag的农杆菌LBA4404(pCOU-SiASR4-flag)。

谷子干扰载体上的表达盒是由玉米Ubiquitin启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的3’转录终止区域(Depicker A,Stachel S.,Dhaese P,Zam bryski P,Goodman HM(1982).Nopaline synthase:transcript mapping and DNA SEQuence.J Mol.ApplGenet.1,561-573)构成，选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。其T-DNA区域如图2所示。

以含有SiASR4基因的质粒为模板，利用PCR扩增得到两端带有Kpn I和Sac I酶切位点的SiASR4基因片段，连接到pMD19T载体上，测序正确后用Kpn I和Sac I进行双酶切，回收309bp的片段。用Kpn I和Sac I对表达载体pCOU(含玉米Ubiquitin启动子)进行双酶切，回收载体大片段。将载体和目的片段连接，SiASR4正向插入载体上。以含有SiASR4基因的质粒为模版，利用PCR扩增得到两端带有BamH I和Spe I酶切位点的SiASR4基因片段，连接到pMD19T载体上，测序正确后用BamH I和Spe I进行双酶切，回收309bp的片段。用BamH I和Spe I对连有正向SiASR4基因的pCOU(含玉米Ubiquitin启动子)进行双酶切，回收载体大片段。将载体和目的片段连接，得到SiASR4反向插入的载体。SiASR4基因分别正向及反向插入到pCOU载体上，中间部分以GUS基因连接，得到由Ubiquitin启动子驱动的重组质粒pCOU-SiASR4-RNAi。将pCOU-SiASR4-RNAi采用电击法直接转化农杆菌LBA4404，获得含有重组质粒pCOU-SiASR4-RNAi的农杆菌LBA4404(pCOU-SiASR4-RNAi)。

实施例4 pCAMBIA2300-SiASR4-flag表达载体转化拟南芥

在野生型拟南芥抽苔4-5cm时剪去顶端花序，使腋生花序生长，约4-5天后进行转化。此时植物次级花序即将开花，或仅有极少的花已开，是转化最佳时期。转化前要使土壤尽量湿透，将大的花蕾去掉，只保留未开放的小花蕾。农杆菌转化拟南芥植株的方法采用花芽浸泡法(Zhang,X.,Henriques,R.,Lin,S.S.,et al(2006).Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana using the floral dipmethod.Nat.Protoc.1,641-646)。将拟南芥整株浸入在盛有200ml稀释好的实施例2中制备的农杆菌GV3101菌液(OD₆₀₀＝0.6)的容器中浸泡2-3min，期间轻微晃动。浸泡完毕后，将拟南芥侧放于托盘中，置22℃，盖上黑色塑料布，24h后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养。等果荚成熟后，收获种子。收获的T₀代转基因植株的种子用20％次氯酸钠溶液(含0.1％TritonX-100)消毒处理15分钟，再用无菌水洗涤5-6遍。将种子均匀置于含50μg/ml Kanamycin的MS培养基上，于4℃暗培养2-3天进行春化，然后于22℃光照培养(16h光照，8h黑暗)7-10天，抗性苗表现为苗深绿色，有真叶，根伸长至培养基中。将抗性苗移栽到花盆(花卉营养土：蛭石＝1：1，重量比)培养，获得T₁代转基因种子。

实施例5 pCOU-SiASR4-flag及pCOU-SiASR4-RNAi表达载体转化谷子

选取枝梗分化期(约出苗45天)的谷子幼穗，用70％乙醇喷洒幼穗的外部苞叶，在超净台中用刀片去除苞叶，切分幼穗为0.5cm左右的小片段，置于诱导愈伤组织的培养基(MS medium including Vitamin(Duchefa Biochemie)+2mg/L 2,4-D+1g/L脯氨酸+800mg/L酸水解酪蛋白+5mg/L AgNO₃+30g/L蔗糖+3.5g/L植物凝胶，pH 5.8)上，黑暗条件下25～27℃培养，约一周后长出愈伤组织，随后每两周继代一次。选取生长约一个月质地致密，颜色淡黄的胚性愈伤组织作为农杆菌转化的受体材料。

将愈伤组织浸于含实施例3中制备的农杆菌LBA4404(pCOU-SiASR4-flag/pCOU-SiASR4-RNAi)的侵染培养基(MS medium including Vitamin(Duchefa Biochemie)+100μmol/L乙酰丁香酮+15g/L葡萄糖+1g/L脯氨酸+2mg/L 2,4-D，pH 5.8，OD 600＝0.4-0.6)中，慢慢摇动20min，将愈伤组织取出放到滤纸上在超净台内吹干后，置于共培养培养基(侵染培养基+3.5g/L植物凝胶，pH5.8)上黑暗条件下22℃共培养3天。然后，将愈伤组织转移至恢复培养基(MS medium including Vitamin(Duchefa Biochemie)+2.0mg/L 2,4-D+1g/L脯氨酸+800mg/L酸水解酪蛋白+30g/L蔗糖+3.5g植物凝胶+150mg/L特美汀，pH 5.8)中暗下25～27℃恢复培养一周后，转移至含5mg/L潮霉素的恢复培养基上黑暗条件下，25～27℃进行筛选培养。每14天继代一次，两次几代后，移至含10mg/L潮霉素恢复培养基继续筛选培养14天。将抗性愈伤组织转移到分化培养基(MS medium including Vitamin(DuchefaBiochemie)+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+150mg/L特美汀+30g/L蔗糖+3.5g植物凝胶，pH5.8)上进行诱导分化，两周继代一次，一个月后，部分愈伤组织的表面会分化产生绿芽，将绿芽切分到生根培养基(1/2MS medium including Vitamin(Duchefa Biochemie)+5mg/L潮霉素+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+3.5g植物凝胶，pH 5.8)中生根，待苗长大后，移栽到小盆里，置于温室培养。

实施例6转基因拟南芥中SiASR4基因表达的检测

SDS法小量提取实施例4制得的T1代转基因拟南芥叶片基因组DNA，利用SiASR4基因特异引物(SEQ ID NO.2-3)，进行PCR检测。结果如图3的A图所示，结果显示获得转基因拟南芥。

TRIzol法提取实施例4制得的T1代转基因拟南芥叶片总RNA，反转录成cDNA。以cDNA为模板，利用SiASR4基因的特异引物(SEQ ID No.4-5)进行semi-qRT-PCR扩增。结果如图3的B图所示，显示SiASR4基因在转基因拟南芥中可以稳定转录。

实施例7转基因谷子中SiASR4基因表达的检测

CTAB法提取过实施例5中T1代表达株系谷子叶片基因组DNA，利用载体和基因特异引物(SEQ ID No.6-7)，进行PCR检测，结果如图4的A图所示。CTAB法提取实施例5中T1代干扰株系谷子叶片基因组DNA，利用载体和基因特异引物(SEQ ID No.8-9)，进行PCR检测，结果如图4的B图所示。结果显示获得了转超表达和干扰载体的转基因谷子。

用TRIzol法提取野生型及实施例5中T1代转基因谷子叶片总RNA，反转录成cDNA。以cDNA为模板，以SiASR4基因的特异引物(SEQ ID NO.4-5)进行实时荧光定量RT-PCR扩增。结果如图4的C图所示，显示过表达株系OE13和OE24中SiASR4基因的表达量是野生型对照(WT)的2.5-3倍。干扰株系R53和R62中SiASR4基因的表达量是野生型对照(WT)的0.8-0.3倍。

实施例8 SiASR4转基因拟南芥萌发期及幼苗期抗盐性分析

将野生型(Col-0)和来自实施例4的转SiASR4基因拟南芥纯合植株(L11,L12和L13)的种子分别点播在MS培养基及含有75mM和100mM NaCl的MS培养基上，培养10天后观察拟南芥的生长情况，结果如图5的A图所示。在未添加NaCl时，Col-0和转基因种子的萌发情况相似，长势一致，说明在正常情况下，转基因株系与对照株系的生长无差异。在含有75mM及100mM NaCl时，野生型和转基因株系的种子萌发均受到抑制，生长缓慢，但是转基因株系受抑制程度较弱，子叶较大于野生型。与此同时，分别测量了转基因株系(L11,L12和L13)和野生型(Col-0)在正常条件及NaCl处理条件下见光生长10天后的生物量，结果如图5的A、B图所示。结果表明，在正常生长条件下，转基因株系与野生型的生物量没有显著差异，而在NaCl处理条件下，野生型鲜重明显低于转基因株系。

此外，将野生型(Col-0)及SiASR4转基因拟南芥(L12和L13)的种子点播于MS培养基上生长5天，然后将长势一致的苗移到MS培养基及含有150mM和200mM NaCl的MS培养基上，培养7天后观察幼苗期拟南芥的生长情况，结果如图5的C图所示，在NaCl处理下，野生型冠部白化程度明显高于野生型。对野生型及转基因株系侧根数目统计及叶绿素含量测定，结果如图5的D、E图所示。结果表明，在正常生长条件下，转基因株系与野生型的侧根数及叶绿素含量没有差异，而在NaCl处理条件下，野生型的侧根数要明显少于转基因株系，叶绿素含量也低于转基因株系。

实施例9 SiASR4转基因拟南芥苗期抗逆性分析

将野生型(Col-0)及SiASR4转基因株系(L12和L13)的种子点播于MS培养基上生长5天，然后将长势一致的苗移于花盆中(蛭石与营养土1:1混合)，待其在土壤中生长两周后停止浇水18天，然后恢复浇水5天，观察表型并统计各株系的存活率，如图6的A、B图所示。取处理0天及恢复5天时的拟南芥材料，进行叶绿素含量的测定，结果如图6的C图所示。结果表明干旱18天复水后转基因拟南芥的生长状态明显好于野生型，存活率及叶绿素含量明显高于野生型。

此外，对在土壤中生长两周的拟南芥用400mM NaCl浇灌，每7天浇灌一次，共处理14天，观察表型并统计各株系的存活率，如图6的D、E图所示。取处理0天及14天的拟南芥材料，进行叶绿素含量的测定，结果如图6的F图所示。结果表明400mM NaCl处理后转基因拟南芥的生长状态明显好于野生型，存活率及叶绿素含量明显高于野生型。以上研究结果表明，在一定的胁迫程度下，转SiASR4基因拟南芥对盐及干旱胁迫的敏感性低于野生型，说明SiASR4基因增强了转基因拟南芥抗盐及抗干旱胁迫的能力。

实施例10 SiASR4转基因谷子萌发阶段的抗逆性分析

选取野生型冀谷11号及OE13和OE24过表达株系及R53和R62干扰株系T₂代种子分别置于相同体积的含0、100mM NaCl、15％PEG和5μM ABA溶液的滤纸上，26℃见光萌发。分别统计第2、4、6和8天的种子萌发数d2、d4、d6和d8。通过公式(d2+d4+d6+d8)/种子总数计算出种子萌发指数。分析野生型及转基因株系种子的耐逆萌发指数，根据公式耐逆萌发指数＝逆境条件下的萌发指数/正常条件下的萌发指数，计算得出。结果如图7的A图所示，在正常条件下，野生型与转基因株系的种子萌发没有明显差异。而在100mM NaCl、15％PEG和5μMABA处理条件下，野生型和转基因株系的种子萌发都受到了抑制作用，但相比而言过表达株系耐逆萌发指数明显高于野生型，具有较好的生长势，干扰株系与野生型相比差异不明显。对萌发6天后苗的根和芽长度测定结果显示如图7的B图，在正常生长条件下，野生型与转基因株系的根长和芽长没有明显差异。在100mM NaCl、15％PEG和5μM ABA处理条件下，过表达株系的根和芽的长度明显比野生型长，干扰株系与野生型相比基本没有差异。以上结果表明，过表达SiASR4基因可以提高谷子种子对盐及渗透的胁迫能力。

实施例11 SiASR4转基因谷子幼苗的抗逆性分析

选取两周龄的野生型及OE13和OE24过表达株系及R53和R62干扰株系的谷子幼苗进行了盐胁迫处理，结果如图8的A图所示。在未处理的情况下，转基因株系比野生型谷子无明显差异。当用400mM NaCl处理幼苗两周后，野生型谷子生长缓慢，刚长出的幼嫩叶片明显白化，而转基因株系生长较野生型粗壮，叶片白化程度较低。处理20天后，野生型谷子整株开始萎蔫，并有严重的白化现象，生长受到严重影响，而转基因株系生长明显好于野生型，只有叶尖白化，野生型株系的存活率显著低于过表达株系。叶绿素含量测定显示如图8的B图，当400mM NaCl处理20天后，野生型的叶绿素含量明显低于过表达株系。干扰株系与野生型相比没有明显的差异。以上结果表明，SiASR4在谷子中过表达能够提高苗期对盐胁迫的耐受性。

选取两周龄的野生型及OE13和OE24过表达株系及R53和R62干扰株系的谷子幼苗进行了干旱胁迫处理，结果如图9的A图所示。在未处理情况下，转基因株系和野生型谷子长势无明显差异。当干旱处理10天后，过表达株系的生长状态好于野生型，野生型谷子叶片卷曲萎蔫，而过表达株系长势良好。干旱13天复水5天后，约80％的过表达株系存活，明显高于野生型的10％。叶绿素含量测定显示如图9的B图，干旱13天复水5天后，转基因株系的叶绿素含量显著高于野生型。干旱处理后干扰株系与野生型相比无明显差异。以上结果表明，SiASR4基因过表达谷子有较强的耐旱能力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 谷子SiASR4基因及应用

<130> KHP161119045.3

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 309

<212> DNA

<213> 谷子（Setaria italica）

<400> 1

atgggtcacc accaccacga caagaacaag aacaaggcgg aggcgggcgc cggcggcgac 60

gactggcgca agaaggagaa gcaccacaag cacatggagc agctcgccca ggtcggtgcc 110

gtcgcagcgg gagcgtacgc catgcacgag aagcacaagg ccaagaagga ccccgagcac 180

gcccgctcgc accggatcaa ggaggagatc gccgccacca tcgccgccgg cagcgcgggc 240

ttcgccatcc acgagcacca caagaagaaa gaagccaaga agcacgcccg gcaccagcac 300

caccattaa 309

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgggtcacc accaccacga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttaatggtggtgc tggtgcc 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

accaccacca cgacaagaac aag 23

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctgcgacggc accgacct 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttttgttcgc ttggttgtga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tccgccttgt tcttgttctt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcggtctagc ctggtcactg 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tttatccgtt cgtccatttg ta 22

<210> 10

<211> 102

<212> PRT

<213> 谷子（Setaria italica）

<400> 1

Met Gly His His His His Asp Lys Asn Lys Asn Lys Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

Ala Gly Gly Asp Asp Trp Arg Lys Lys Glu Lys His His Lys His Met

20 25 30

Glu Gln Leu Ala Gln Val Gly Ala Val Ala Ala Gly Ala Tyr Ala Met

35 40 45

His Glu Lys His Lys Ala Lys Lys Asp Pro Glu His Ala Arg Ser His

50 55 60

Arg Ile Lys Glu Glu Ile Ala Ala Thr Ile Ala Ala Gly Ser Ala Gly

65 70 75 80

Phe Ala Ile His Glu His His Lys Lys Lys Glu Ala Lys Lys His Ala

85 90 95

Arg His Gln His His His

100

Claims

1.谷子SiASR4基因在提高植物抗逆境胁迫中的应用，所述谷子SiASR4基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

所述植物抗逆境胁迫是指抗旱性或抗盐性；所述植物为拟南芥、谷子。

2.谷子SiASR4基因在植物种质资源改良中的应用，所述谷子SiASR4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述植物为拟南芥、谷子；所述改良是指提高抗旱性或抗盐性。

3.用于检测谷子SiASR4基因的特异性引物对在植物种质资源改良、培育植物抗逆新品种中的应用，所述特异性引物对的核苷酸序列为：

上游引物：5'-ATGGGTCACCACCACCACGA-3'

下游引物：5'-TTAATGGTGGTGCTGGTGCC-3'；

所述谷子SiASR4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述植物为拟南芥、谷子；所述改良是指提高抗旱性或抗盐性；所述抗逆是指抗旱性或抗盐性。