CN102586247B

CN102586247B - 一个逆境诱导型启动子在控制基因在干旱诱导表达中的应用

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Publication number: CN102586247B
Application number: CN201110004884.4A
Authority: CN
Inventors: 熊立仲; 都浩
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2011-01-10
Filing date: 2011-01-10
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2031-01-10
Also published as: CN102586247A

Abstract

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种受非生物逆境(干旱，高盐，脱落酸ABA)诱导型启动子OsIP3KP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，序列长度为2119bp。该启动子能够提高抗逆相关基因在非生物逆境环境中特异表达，应用于遗传改良水稻抵抗非生物逆境的能力。本发明采用PCR扩增及融合报告基因遗传转化方法，克隆到控制水稻非生物逆境诱导型启动子OsIP3KP，通过realtime-PCR，报告基因GUS染色观察及酶活测定，证明本发明克隆的启动子受非生物逆境(干旱，高盐，ABA)诱导，可应用于水稻等植物的遗传改良。

Description

一个逆境诱导型启动子在控制基因在干旱诱导表达中的应用

技术领域

本发明涉及水稻基因工程领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种受非生物逆境(干旱，高盐，ABA)诱导的启动子能够提高抗逆相关基因在非生物逆境环境中特异表达，应用于遗传改良水稻抵抗非生物逆境的能力。本发明采用PCR扩增及融合报告基因遗传转化的方法，克隆到控制水稻非生物逆境诱导启动子OsIP3KP，通过real time-PCR，报告基因GUS染色观察及酶活测定，证明该启动子受非生物逆境(干旱，高盐，ABA)诱导，可应用于水稻的遗传改良。

背景技术

植物的生长除了有其固有的遗传基础外，往往还会受到诸多环境因素的影响。干旱、高盐、低温是最为常见的非生物逆境，严重影响了植物的生长，限制了植物的分布。非生物逆境会造成作物产量和品质的下降，在许多地区是农业发展的瓶颈。因此，培育抗逆作物一直是农业科学技术研究的主要目标之一。为了适应或抵御这些逆境条件，植物在经过长期的生物驯化之后，形成了自己的一套防御干旱、高盐、低温、紫外线等逆境胁迫的自我保护机制。干旱、高盐和低温胁迫，都破坏了植物细胞的离子平衡，致使细胞脱水，使植物细胞受到离子和水分胁迫，干旱、高盐和紫外线还引起植物体得氧化胁迫，激发相关基因的表达，导致植物在新陈代谢以及形态上的变化，如植物生长的减缓甚至停止，体内激素(如ABA)的瞬时上升，体内调节渗透压的物质的聚集等(Seki M，Umezawa T，Urano K，Shinozaki K.Regulatory metabolicnetworks in drought stress responses.Curr Opin Plant Biol，2007，10：296-302)。并且植物在进化过程中也形成了一系列的信号转导路径来介导对胁迫的反应，从而控制植物的生长发育。

植物基因启动子是重要的顺式作用元件，它是位于结构基因5’端上游区域调控基因转录的一段DNA序列，它能结合反式作用因子，使之与启动子准确地结合，确保转录精确而有效地起始，是转录调控的中心。根据基因表达情况，可将启动子分为两类：组成型启动子和特异型启动子。组成型启动子能在所有细胞、任何时候进行转录；特异型启动子又可分为组织特异型启动子和诱导型启动子，诱导型启动子平时不启动转录或转录活性很低，但在某些特定的逆境信号的刺激下，转录活性能够显著地提高。在转基因植物中，组成型启动子持续过量地表达转化的目的基因可能会阻碍植物正常的生长发育并且可能减少其产量，因为外源基因的过量表达会竞争植物在正常生长条件下需要的能源，并且对转基因植物的其他一些生理代谢活动却有竞争性抑制作用。因此，寻找植物内源的逆境胁迫诱导型启动子的研究已成为国内外研究的热点，使外源基因只在胁迫的情况下才表达，这样不仅会获得目的产物、达到预定目标，而且也不会产生副作用。植物非生物逆境基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调控制下游目的基因的表达。在最近二十年中，科学家们通过对植物中逆境相关基因及其启动子的研究，已经鉴定了多种参与非生物逆境的顺式作用元件，如干旱，高盐响应元件ABRE(ACGTGGC/ACGTGTC)，DRE(TACCGACAT)，MYBR(TGGTTAG)，CRT(GGCCGACAT)等。(Yamaguchi-Shinozaki and K.Shinozaki，A novelcis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought，lowtemperature，or high-salt stress，Plant Cell 6(1994)，pp.251-264.；Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.Organization of cis-acting regulatory elements in osmotic and cold stressresponsive promoters.Trends Plant Sci.2005 Feb；10(2)：88-94；Xiao B，Huang Y，Tang N，XiongL.Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions.Theor Appl Genet.2007 Jun；115(1)：35-46.Epub 2007 Apr 11；Xiao BZ，Chen X，Xiang CB，Tang N，Zhang QF，Xiong LZ.Evahation of seven function known candidate genes for their effects onimproving drought resistance of transgenic rice under field conditions.Mol Plant.2009Jan；2(1)：73-83.Epub 2008 Nov 2)利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因在转基因植物中表达是培育抗逆作物新品种的有效方法。但是，目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少，对于新的抗逆相关启动子的克隆及分析的研究仍然是今后研究的重点，将功能明确的抗逆启动子成功应用到转基因植物中调控抗逆基因的表达是植物抗逆遗传改良的研究方向。

水稻是重要的粮食作物和模式植物，通过寻找水稻中受非生物逆境诱导较强的基因，寻找逆境诱导型的启动子已成为一种重要的研究手段。在申请人的前期研究中分离到一个受非生物逆境(干旱，高盐，ABA)强烈诱导的启动子。鉴于水稻中OsIP3KP启动子是否能受非生物逆境(干旱，高盐，ABA)诱导特异提高下游目的基因的表达目前尚无相关报道。因此，从水稻中分离出OsIP3KP启动子，并鉴定它在提高特异提高下游目的基因的表达所发挥的功能，对于培育抗逆水稻新品种将具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的涉及一个肌醇3磷酸激酶基因家族OsIP3KP启动子在水稻抗旱盐性状改良中的应用。OsIP3K基因是一个编码肌醇3磷酸激酶基因基因，该基因受干旱，高盐，脱落酸(ABA)诱导表达量显著上升。本发明分离和应用一种OsIP3K基因的启动子DNA片段，该片段赋予下游目的基因在干旱，高盐及ABA)条件下表达量显著上升的能力。其中，所述的OsIP3KP启动子核苷酸序列长度为2119bp，其核苷酸序列如序列表SEQ NO：1所示。

携带有本发明OsIP3KP启动子启动目的基因的载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for Plant MolecularBiology VIII，Academy Press，New York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant MolecularBiology)。

可使用包括本发明的OsIP3KP启动子启动的抗逆基因的载体转化宿主是包括水稻在内多种植物，培育特异抗旱盐的植物品种。

本发明基因是受干旱，高盐，ABA诱导表达的，因此可将本发明的启动子与任何感兴趣的抗逆相关基因结合后转入合适的表达载体，并转化植物宿主，在干旱，高盐条件下可特异诱导表达抗性基因，提高植物抗旱盐的能力。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的OsIP3KP启动子核苷酸序列，序列长度为2119bp。

图1.是本发明分离克隆OsIP3KP启动子及功能鉴定的总体技术路线图。

图2.Real-time PCR检测发现本发明的启动子能受多种非生物逆境高盐、干旱、脱落酸(ABA)等诱导，受紫外线(UV)诱导较弱，而该启动子受低温、高温的诱导下游基因下降表达。图中上排从左至右依次是高盐、ABA和高温胁迫；下排从左至右依次是干旱、UV和低温胁迫。

图3.是本发明的OsIP3KP启动子是显著的组织特异性表达启动子(图中编号分别为：1.节间，2.节，3.叶鞘，4.三叶期苗子，5.颖壳，6.种子，7.二次枝梗，8.花药，9.一次继代愈伤，10.二次继代愈伤，11.三次继代愈伤，12.幼芽，13.幼根，14.上午的剑叶，15.下午的剑叶，16.叶枕)。

图4.OsIP3KP-DX2181G启动子载体示意图。

图5.是本发明的OsIP3KP启动子在该启动子转基因水稻正常生长条件下驱动下游GUS报告基因的表达(图中编号分别为：1.一次继代愈伤，2.发芽七天的胚芽鞘和幼叶，3.胚和胚乳，4.颖壳和花药，5.节和节间，6.叶鞘、叶枕和叶耳，7.剑叶，8.分蘖期的根，9.穗发育七期的小穗及二次枝梗)。

图6.是本发明的OsIP3KP启动子在该启动子转基因水稻发芽期间干旱及ABA处理下诱导下游GUS报告基因的表达量显著上升(图中编号分别为：1.转基因水稻发芽五天后在正常生长条件GUS染液染色结果，2.转基因水稻发芽五天后在干旱胁迫30分钟后GUS染液染色结果，3.转基因水稻发芽五天后在用200uM脱落酸(ABA)处理1小时后GUS染液染色结果。

图7.本发明的OsIP3KP启动子在该启动子转基因水稻四叶苗期干旱胁迫前后GUS报告基因的活性的测定(图中灰色柱子代表的是该启动子转基因阴性植株，黑色柱子代表的是该启动子转基因阳性植株，其中编号分别为：DR0，干旱胁迫前；DR1，干旱胁迫一天；DR2，干旱胁迫两天；DR3.干旱胁迫三天)。

具体实施方式

以下实施方式定义了本发明，并描述了本发明在分离OsIP3KP启动子，克隆包含有OsIP3KP启动子的DNA片段，以及验证OsIP3KP启动子功能的方法，实施流程如图1所示。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

实施例1

1、分离OsIP3K基因的启动子

用Real-time PCR检测出OsIP3KP受干旱，高盐，脱落酸(ABA)诱导，该OsIP3KP的诱导时由上游启动子序列调控的，从水稻基因组注释数据库(本发明的启动子下游基因检索地址：http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/ORF_infopage.cgi，)中可以找到该基因在上述网站突变体库中登录号是LOC_Os03g12840.1，该启动子上游就是该基因的启动子序列。

根据OsIP3K基因基因序列在美国国家生物技术信息中心NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中做序列比对，找到OsIP3K基因在已经测序提交的水稻全基因组上的匹配位置，可以确定转录起始位点ATG在基因组上的位置其上游2.5kb内就是此基因候选启动子所在位置，再根据启动子所在位置设计PCR引物，其具体步骤如下所述的操作。选用粳稻品种“中花11号”(一个公开推广应用的水稻品种，来自中国农业科学院作物研究所商业品种)作为材料，从基因组中扩增OsIP3K基因启动子DNA序列的引物如下：

引物P01：5’CTCAAGCTTCGTCCAACGAATCCATCC 3’，

引物P02：5’CTCGGATCCGAATCCGCAGGCAAAGG 3’，

其中P01引物5’端加有限制性酶切割位点HindIII(AAGCTT)(用斜体加下划线表示，酶切位点前的三个碱基为保护碱基)，P02引物5’端加有限制性酶切割位点BamH1(GGATCC)(用斜体加下划线表示，酶切位点前的三个碱基为保护碱基)。

PCR反应体系的总体积为50μl，中花11水稻基因组DNA模板约100ng、2×GC buffer1(购自宝生物工程(大连)有限公司)酶反应缓冲液、10mM dNTP 0.5ul、10uM引物0.5ul、2单位LA-Taq酶(购自宝生物工程(大连)有限公司)，加双蒸水至50μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃ 30s、50℃ 30s、72℃2min、30个循环，72℃延伸7min。扩增结果测序(ABI3730测序仪，Applied Biosystem，测序在国家植物基因中心[武汉]完成)就可以得到该启动子及其序列如序列表SEQ ID NO：1。

2、检测水稻OsIP3KP启动子启动内源下游基因表达的水平

申请人选用粳稻品种“中花11”作为表达谱分析的材料。种子催芽后，在小桶正常土壤中生长至四叶期时进行各种逆境和激素的处理。干旱处理是不再浇水让其自然干燥，分别在胁迫前、胁迫后1天、2天、3天、4天取样；高盐胁迫是向桶中加入含有300mmol/L NaCl的溶液，分别在胁迫前，2小时、6小时、12小时、72小时取样；低温胁迫是把四叶期将水稻幼苗放入4℃人工气候室，分别于胁迫前、胁迫后2小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时取样。脱落酸(ABA)处理是用200μM脱落酸(ABA)均匀的喷洒水稻植株表面后并加到苗子生长的土壤中，分别在胁迫前、胁迫后30min，30分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时后取样。高温胁迫是把四叶期水稻幼苗放入42℃人工气候室，分别于胁迫前、胁迫后0.3小时、0.6小时、1小时、3小时、6小时、12小时取样。紫外线(UV)胁迫是把四叶期水稻幼苗放入42℃人工气候室，分别于胁迫前、胁迫后3小时、6小时、12小时、24小时、恢复12小时取样。水稻总RNA的提取采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取，提取方法按照上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶SSIII(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA(方法根据Invitrogen公司反转录酶试剂说明书)，反应条件为：65℃ 5min，50℃ 120min，70℃ 10min。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物P03(5’-GGCGAGGAAGAAGGGAATTAAT-3’)和引物P04(5’-AAATGGGCCTTGTTCTGCAA-3’)对OsIP3K基因进行特异的PCR扩增。同时用引物AF(5’-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3’)和AR(5’-TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’)对水稻Actin1基因(基因登录号X16280)做特异扩增，以作为内对照进行定量分析。反应条件为：95℃ 5min；95℃ 10sec，60℃ 5sec，72℃ 34sec，45个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。结果表明，OsIP3KP启动子(其序列如SEQ NO：1所示)在干旱、高盐、和ABA处理下诱导OsIP3K基因上升表达，在紫外线UV诱导下轻微上升表达，而在低温和高温胁迫中轻微地下降表达(图2)。组织表达谱分析仍以粳稻品种“中花11”为材料，取各个发育时期的组织样品检测发现OsIP3KP存在典型的组织发育特异性，除叶片中表达量较高外，其余各组织表达量均较低(图3)。

3、OsIP3KP启动子载体的构建和遗传转化

为了能更好的分析OsIP3KP启动子的功能，本发明的实施方案就是构建OsIP3KP的GUS基因表达载体并转化到粳稻品种中花11号中，检测转基因植株中OsIP3KP启动子驱动的GUS基因在逆境包括干旱、高盐、脱落酸(ABA)、紫外线(UV)、高温、低温等逆境迫下的诱导表达活性，从而验证该基因启动子的功能。具体操作如下：

首先将分离的OsIP3KP启动子的PCR产物连入pGEM-T Easy载体(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)，转化大肠杆菌DH5α(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)并获得阳性克隆。通过HindIII，BamHI双酶切从pGEM-T Easy阳性克隆上回收OsIP3KP再将其连接到GUS表达载体DX2181G(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室林拥军教授惠赠，载体含有GUS报告基因，该载体的结构示意图如图4所示)，酶切验证阳性克隆并检测插入方向正确后，通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系导入到水稻品种“中花11”中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(参见：Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacteriumand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant Journal 6：271-282，1994)并在其基础上进行改良和优化。主要步骤和试剂如下：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)。

(2)主要溶液配方

1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制：

硝酸钾(KNO₃) 28.3g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 4.0g

硫酸铵((NH₄)₂SO₄) 4.63g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 1.85g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 1.66g

逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000ml。

2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制

碘化钾(KI) 0.08g

硼酸(H₃BO₃) 0.16g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 0.44g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.15g

室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ml。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)的配制

准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，用蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)配制

烟酸(Nicotinic acid) 0.1g

维生素B1(Thiamine HCl) 0.1g

维生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1g

甘氨酸(Glycine) 0.2g

肌醇(Inositol) 10g

用蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制

硝酸铵(NH₄NO₃) 16.5g

硝酸钾 19.0g

磷酸二氢钾 1.7g

硫酸镁 3.7g

氯化钙 4.4g

室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ml。

6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制

碘化钾 0.083g

硼酸 0.62g

硫酸锰 0.86g

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.025g

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.0025g

室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取2，4-D 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取NAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取IAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g。在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：

秤取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

秤取AS 0.392g，DMSO 10ml，分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

秤取氢氧化钾5.6g，并用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

2，4-D贮存液 2.5ml

脯氨酸(Proline) 0.3g

CH 0.6g

蔗糖(Sucrose) 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

2，4-D贮存液 2.0ml

脯氨酸 0.5g

CH 0.6g

蔗糖 30g

Phytagel 3g

3)预培养基

N6max母液(10X) 12.5ml

N6mix母液(100X) 1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.75ml

CH 0.15g

蔗糖 5g

琼脂粉(Agarose) 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X) 12.5ml

N6mix母液(100X) 1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.75ml

CH 0.2g

蔗糖 5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X) 5ml

N6mix母液(100X) 0.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 0.5ml

维生素贮存液(100X) 1ml

2，4-D贮存液 0.2ml

CH 0.08g

蔗糖 2g

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X) 25ml

N6mix母液(100X) 2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.625ml

CH 0.15g

蔗糖 7.5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和400ppmCN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

N6max母液(10X) 25ml

N6mix母液(100X) 2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

6-BA贮存液 0.5ml

KT贮存液 0.5ml

NAA贮存液 50μl

IAA贮存液 50μl

CH 0.15g

蔗糖 7.5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

6-BA贮存液 2ml

KT贮存液 2ml

NAA贮存液 0.2ml

IAA贮存液 0.2ml

CH 1g

蔗糖 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10X) 50ml

MSmix母液(100X) 5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 5ml

维生素贮存液(100X) 5ml

蔗糖 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

1)愈伤诱导

(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；

(2)用灭菌水洗种子4-5次；

(3)将种子放在诱导培养基上；

(4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

2)愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3)农杆菌培养

(1)在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105(购自澳大利CAMBIA实验室，为商用菌株)两天，温度28℃；

(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

5)农杆菌侵染

(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；

(2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养2天，温度19-20℃。

6)愈伤洗涤和选择培养

(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

(2)浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；

(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次潮霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)

7)分化

(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；

(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

8)生根

剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中，光照下培养2-3周，温度26℃。

9)移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入大田生长至收种。

4、OsIP3KP启动子逆境诱导活性鉴定

将OsIP3KP启动子(即SEQ ID NO：1所示DNA片段)控制GUS报告基因构建出的转化载体OsIP3KP-DX2181G(见图4OsIP3KP-DX2181G)转化上述所述的中花11，对转基因植株在不同发育阶段组织部位进行了GUS活性染色(染色液配方：Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、0.2mol/L Na₃PO₄缓冲液，双蒸水，0.2mol/LNa₂HPO₄，0.2mol/L NaH₂PO₄；0.1mol/L K3[Fe(CN)₆]；0.1mol/L K3[Fe(CN)₆]，1％triton x-100；0.5％X-Gluc)。通过GUS组织染色(染色方法：转基因植株不同组织器官用染液于37℃恒温箱中过夜染色，倒掉染色液加入脱色液处理后观察拍照)，证实GUS报告基因在正常生长条件下在愈伤、茎、叶舌、叶耳、雄蕊、雌蕊、颖壳和护颖有较低的GUS活性，在叶、茎各组织部位中有相对较高的GUS表达(见图5)。发芽7天后的幼苗在干旱及ABA处理后做GUS染色，发现干旱，及200μM脱落酸(ABA)处理后GUS有较高的活性(图6)。

5、OsIP3KP启动子逆境诱导活性鉴定

本发明的实施方案就是构建OsIP3KP启动子的GUS基因表达载体并转化到水稻品种“中花11”中，定量地检测OsIP3KP启动子在干旱诱导表达活性。具体操作如下：

申请人采用构建的OsIP3KP-DX2181G表达载体转化水稻“中花1”，得到转基因阳性植株18株；不连接外源片段的DX2181G空载体转化水稻“中花11中”得到转基因阳性植株8株。选取3个转启动子阳性家系和1个转空载体DX2181G阳性对照家系对T1代种子进行潮霉素(HN)抗性筛选发芽试验，将发芽的上述水稻苗一部分种于小红桶的沙土内长至4叶期用做干旱胁迫试验，一部分种于小方盒内长至4叶期用做干旱胁迫试验。其中干旱胁迫方法如实施例2中所述，取胁迫前(记为DR0)，叶片微卷(干旱胁迫一天，记为DR1)，叶片半卷(干旱胁迫2天，记为DR2)，叶片全卷(干旱胁迫3天，记为DR3，得到四个时间点的样品，每份样品取自该家系的混合样(不少于10株)。

样品用液氮磨样，通过GUS抽提液(50mM Na₂HPO₄，pH7.0，10mM β-mercaptoethanol，10mM Na₂EDTA，0.1％Sarkosyl，0.1％Triton-100)抽提总蛋白，从样品中取出一定量的蛋白着进行GUS活性定量分析。通过分析荧光结果获得原样品的GUS比酶活。具体步骤如下：通过Bradford法(参见：A rapid andsensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principleof protein-dye binding.1976，Anal Biochem，72：248-254)测得样品的总蛋白浓度，再根据测定的总蛋白浓度用移液器量取一定体积的相同质量约10ug的总蛋白，向其中加入0.4ml GUS提取缓冲液(50mMNa2HPO4[PH 7.0]，10mM β-mercaptoethanol，10mM Na₂-EDTA，0.1％sarkosyl，1％Triton X-100)、10μl 40mM底物4-甲基微型酮-葡萄糖醛酸苷(MUG)(4-methylumbelifferyl-β-D-glucuronide)在37℃水浴(1h以内)后，加入1.6ml反应终止液(0.2M Na₂CO₃)；每个反应设置三个重复。用Tecan光栅型酶标仪(型号：infinite M200)测量各个样品在激发光365nm，发射光455nm处的荧光值，同时以50nM MU的荧光值作为参比，进而通过以上数据计算出各个样品中GUS蛋白的比酶活，即1ug总蛋白每分钟反应底物MU的量(单位pmol MU/min/ug protein)。通过GUS蛋白活性定量测量发现，本发明克隆的OsIP3KP启动子控制下的GUS蛋白活性受到干旱胁迫的强烈诱导，在独立转基因家系中GUS蛋白在叶片全卷时的活性是胁迫前的约7至8倍(如图7)。这一结果再次证实OsIP3KP启动子是一个干旱诱导型启动子，可以用于目标基因的干旱诱导性表达。

Claims

1.一种被干旱诱导表达的启动子OsIP3KP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的启动子OsIP3KP在控制基因在水稻干旱胁迫诱导表达中的应用。