CN101096681A - 利用水稻蛋白激酶基因OsCIPK15提高植物耐盐能力 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及耐盐有关的水稻DNA片段OsCIPK15的分离克隆、功能验证及应用。具体步骤是，将该基因的完整翻译区(Coding sequence)与玉米的组成型启动子(Ubquitin)结合后直接转入水稻，使转基因水稻植株的耐盐能力显著提高。克隆的OsCIPK15基因具有如序列表SEQ ID NO：1中第1-2044位所示的DNA序列，或者编码与SEQ ID NO：1编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。

Description

利用水稻蛋白激酶基因OsCIPK15提高植物耐盐能力
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及一种水稻DNA片段(基因)的分离克隆、功能验证和应用。所述的基因与植物耐盐有关。将该基因的完整翻译区(Coding sequence)与玉米的组成型启动子(Ubiquitinl)结合后直接转入一般植物体，转基因植株的耐盐能力显著提高。
背景技术
植物在生长的过程中会受到诸多环境因素的影响，干旱、盐害和低温往往导致农作物的大规模减产，在许多地区是农业发展的瓶颈。为了抵抗或适应环境不利因素，植物体感受细胞外环境条件的变化并通过多种途径将其传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受干旱、高盐、低温等胁迫伤害的功能蛋白、渗透调节物质以及传递信号和调控基因表达的转录因子，从而对外界的变化做出相应的反应(Xiong等Cell signaling during cold，drought and salt stress.Plant Cell.14(suppl)，S165-S183，2002)。而那些功能基因的表达对植株对环境刺激做出反应，最终使其存活起着重要的作用。而目前在许多植物中发现CDPK、CIPK、MAPK等蛋白激酶家族在植株逆境信号的传递、逆境的适应性方面起着重要的作用。这些蛋白激酶基因在不同的逆境胁迫下，可诱导表达或被抑制，因而认为这些蛋白激酶基因在植物对逆境的应答过程中起着非常重要的作用。因此分离和鉴定这类能提高植物应对逆境的功能基因对于于作物抗逆境的遗传改良，对育种有着重要的意义。目前人们已在植物抗性改良方面作了尝试，利用DREB1A和DREB2A培育的转基因拟南芥植株，其低温耐性和干旱，高盐耐性都比野生型强(Liu Q等Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with anEREBP/AP2 DNA domains separate two cellular signal thansduction pathways in drought-andlow-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.Plant Cell.1998，10：1391-1406.)。利用OsNAC1培育转基因水稻显著的提高了植株对干旱和高盐的耐受能力(Hu等Overexpressing aNAM，ATAF，andCUC(NAC)transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice.PNAS.2006，103：12987-12992.)
水稻是最重要的粮食作物之一，耐盐的水稻对我们来说具有重要的意义，因而找出与耐盐的功能基因，培育耐盐的品种对提高水稻产量和种植面积具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是从水稻中分离克隆一个包含有耐盐相关基因完整编码区段的DNA片段，利用这个基因改良水稻或其它植物的抗逆性，特别是通过转基因，提高转基因植物的耐盐性。对这个基因进行结构分析其属于植物CIPK蛋白激酶家族，而且是跟逆境相关的，将该克隆的基因被命名为OsCIPK15。
本发明涉及分离和应用一种包含OsCIPK15基因的DNA片段，该片段赋予植物在高盐等逆境条件下，增强耐受能力。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO：1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：1所示的高度同源DNA序列，或者其功能相当于SEQ IDNO：1所示序列的亚片段。
可以采用已经克隆的OsCIPK15基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsCIPK15基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsCIPK15基因的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体转化植株，可获得对高盐胁迫耐受力得到增强的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。
携带有本发明OsCIPK15基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，AcademyPress，New York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2ndEdition)。
可使用包括本发明的OsCIPK15基因的表达载体转化宿主是包括水稻在内多种植物，培育抗盐的植物品种。
本发明基因是受逆境诱导表达的，因此其启动子是诱导型启动子，将本发明的启动子区段与任何感兴趣的基因同时连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在逆境条件下可诱导表达基因，提高植物对逆境的耐受能力。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1显示的是本发明分离克隆的包含有OsCIPK15基因编码区DNA片段序列。
图1：OsCIPK15基因分离和鉴定流程图。
图2：用Northern杂交检测OsCIPK15基因在干旱，高盐，低温，PEG和ABA等逆境胁迫不同时间点的表达水平。
图3：用于水稻遗传转化的载体。将目标基因OsCIPK15序列通过BamHI和KpnI双酶切连接到图中红色字体标注的酶切位点即得到OsCIPK15超量表达载体。
图4：在水稻中超量表达OsCIPK15基因能提高植株耐盐胁迫能力。A，OsCIPK15基因在转基因植株中的表达情况，第一道为对照，其余为转基因独立转基因植株。B，转基因家系和野生型对照在含100mMNaCl的生根培养基上生长12天后的表型观察。C，转基因家系和野生型对照在含100mM NaCl的生根培养基上生长12天后地上和地下部分长度的统计。D，转基因家系和野生型对照在含100mM NaCl的生根培养基上生长12天以及正常生长条件下鲜重比较。
具体实施方式
本发明的前期工作获得了来源于水稻品种明恢63(一种中国普遍推广应用的一个水稻品种)的cDNA克隆EI101L12。该cDNA是OsCIPK15基因的全长cDNA，是一个抗逆境相关基因。主要依据有以下几个方面：(1)采用cDNA芯片技术(Gray A.Churchill，Fundamentals of exprerimental design for cDNA microarrays.Naturegenetics supplement，2002，32，490-495)分析发现cDNA克隆V2Chip#16A22在水稻品种“中旱5号”(由中国上海农科院提供的一个公开使用的一个水稻品种)干旱胁迫处理15天表达量增加2.95倍。对其进行测序，分析发现该基因就是OsCIPK15(Genebank登录号为AK121773)。鉴于该克隆表达量在干旱处理后的明显差异和其功能特征，认为V2Chip#16A22克隆所代表的基因在逆境下参与调控基因的表达。(2)对其进行逆境条件下的表达谱分析(图2)，发现在胁迫处理的过程中，表达量有明显的提高。(3)，将其全长基因在植株中超量表达，转基因植株的耐盐性能力大大增强(图4)。这些结果都表明OsCIPK15基因是一个逆境相关调控基因，参与植物对逆境的调控。
以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期工作基础上分离克隆包含有OsCIPK15基因完整编码区段的DNA片段以及验证OsCIPK15基因功能的方法(发明流程如图1所示)。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1：分离克隆包含有OsCIPK15基因区段的DNA片段
通过水稻品种“中旱5号”(由中国上海农科院提供的一个公开使用的一个水稻品种)的干旱诱导基因表达谱分析，发现了一个受干旱强烈诱导(干旱胁迫后期表达量提高2.95倍以上)的EST(表达序列签)，经序列分析发现，该基因为CIPK蛋白激酶家族的一个成员，其对应日本水稻全长数据库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)中的cDNA克隆J033092J11。根据该克隆序列，设计引物OsCIPK15F(5′-TAA GGTACCGGCTAAAGAATTGCAGTCCA-3′，序列特异引物外加接头KpnI位点)和OsCIPK15R(5′-TAA GGATCCTTGCGACTGCTGCTATTC-3′，序列特异引物外外加接头BamHI)，将该克隆的374-1773bp序列从“中旱5号”品种中反转录扩增出来。扩增产物就是本发明的序列1-1400bp。具体步骤为：采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)从干旱胁迫处理的水稻品种“中旱5号”中提取叶片总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA第一链。根据cDNA克隆001-015-H02的序列设计的巢式引物将其从反转录产物中扩增出来，反应条件为：94℃预变性2min；94℃30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，30个循环；72℃延伸5min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因。该克隆命名为PGEM-OsCIPK15。
实施例2：检测水稻内源基因OsCIK15的诱导表达
以水稻品种“中旱5号”为材料，在3叶期分别进行干旱、冷害和高盐胁迫以及脱落酸(ABA)，聚乙二醇(PEG)处理。干旱处理是将幼苗断水，并在0h，3h，6h，12h，24h后取样。冷害处理是将幼苗置于4℃生长箱，0h，3h，6h，12h，24h后取样。高盐胁迫是将幼苗根部浸泡在200mM/L NaCl溶液中并在0h，5h，14h，24h后取样。ABA处理是将幼苗根部浸泡在100μM/L ABA溶液中并在0h，3h，6h，12h和24h后取样。PEG处理是将幼苗根部浸泡在20％的PEG6000溶液中并在0h，3h，5h，12h后取样。提取叶片的总RNA(Trizol试剂，Invitrogen)后按《分子克隆》(J.萨姆布鲁克，科学出版社，北京，1999年版)有关实验操作方法进行RNA转膜，并以OsCIPK15为探针做Northern杂交。结果表明，本发明克隆的基因OsCIPK15能被干旱、冷害、高盐和ABA、PEG诱导表达(如图2所示)，是一个与逆境相关的蛋白激酶。
实施例3，OsCIPK15基因超量表达载体的构建，转化
根据实施例2的结果，知道本发明基因OsCIPK15是能被干旱、冷害、高盐，聚乙二醇(PEG)和脱落酸(ABA)诱导表达的，为了能更好地阐明此基因的功能，申请人将其在水稻中超量表达，从转基因植株的表型来验证。方法是：首先将实施例1中得到的阳性克隆pGEM-OsCIPK15质粒用BamHI和KpnI双酶切，回收外源片段；同时，用同样的方法酶切携带玉米强启动子Ubquitin的遗传转化载体pU1301(pU1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(来自澳大利亚CAMBIA实验室(Center for the Application ofMolecular Biology to International Agriculture)基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米强启动子Ubiquitinl的农杆菌介导的遗传转化载体)，酶切完毕，用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，纯化酶切产物。用包含OsCIPK15基因的酶切片段和酶切的pU1301载体(如附图3所示)做连接反应，转化大肠杆菌DH10β(菌株购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得转化载体。
通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系将其导入到水稻品种中花11(中国农业科学院作物科学研究所提供的一个公开使用的一个水稻品种)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗、移栽，得到转基因植株。将获得的转基因水稻植株被命名为S15。本发明总共获得独立转基因水稻植株26株。
农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系采用申请人所在的作物遗传改良国家重点实验室建立的转化体系。该体系的具体步骤如下：
(1)试剂和溶液缩写
本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)
(2)主要溶液配方
1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制：
硝酸钾(KNO3)           28.3g
磷酸二氢钾(KH2PO4)     4.0g
硫酸铵((NH4)2SO4)      4.63g
硫酸镁(MgSO4·7H2O)    1.85g
氯化钙(CaCl2·2H2O)    1.66g
逐溶解，然后室温下定容至1000ml。
2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制
碘化钾(KI)             0.08g
硼酸(H3BO3)            0.16g
硫酸锰(MnSO4·4H2O)    0.44g
硫酸锌(ZnSO4·7H2O)    0.15g
室温下溶解并定容至1000ml。
3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)的配制
准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。
4)维生素贮存液(100X)配制
烟酸(Nicotinic acid)        0.1g
维生素B1(Thiamine HCl)      0.1g
维生素B6(Pyridoxine HCl)    0.1g
甘氨酸(Glycine)    0.2g
肌醇(Inositol)     10g
加水定容至1000ml，4℃保存备用。
5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制
硝酸铵(NH4NO3)    16.5g
硝酸钾            19.0g
磷酸二氢钾        1.7g
硫酸镁            3.7g
氯化钙            4.4g
室温下溶解并定容至1000ml。
6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制
碘化钾                 0.083g
硼酸                   0.62g
硫酸锰                 0.86g
钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)  0.025g
硫酸铜(CuSO4·5H2O)    0.0025g
室温下溶解并定容至1000ml。
7)2，4-D贮存液(1mg/ml)的配制：
秤取2，4-D100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，于室温下保存。
8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制：
秤取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。
9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制：
秤取NAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。
10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制：
秤取IAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO4·7H2O)2.78g。在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水用。
11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：
秤取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。
12)AS贮存液的配制：
秤取AS 0.392g，DMSO 10ml，分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。
13)1N氢氧化钾贮存液
秤取氢氧化钾5.6g，并用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。
(3)用于水稻遗传转化的培养基配方
1)诱导培养基
N6max母液(10X)          100ml
N6mix母液(100X)         10ml
Fe2+EDTA贮存液(100X)    10ml
维生素贮存液(100X)      10ml
2，4-D贮存液            2.5ml
脯氨酸(Proline)         0.3g
CH                      0.6g
蔗糖(Sucrose)           30g
Phytagel                3g
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
2)继代培养基
N6max母液(10X)           100ml
N6mix母液(100X)          10ml
Fe2+EDTA贮存液(100X)     10ml
维生素贮存液(100X)       10ml
2，4-D贮存液             2.0ml
脯氨酸                   0.5g
CH                       0.6g
蔗糖                     30g
Phytagel                 3g
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。3)预培养基
N6max母液(10X)           12.5ml
N6mix母液(100X)          1.25ml
Fe2+EDTA贮存液(100X)     2.5ml
维生素贮存液(100X)       2.5ml
2，4-D贮存液             0.75ml
CH                       0.15g
蔗糖                     5g
琼脂粉(Agarose)          1.75g
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
4)共培养基
N6max母液(10X)           12.5ml
N6mix母液(100X)         1.25ml
Fe2+EDTA贮存液(100X)    2.5ml
维生素贮存液(100X)      2.5ml
2，4-D贮存液            0.75ml
CH                      0.2g
蔗糖                    5g
琼脂粉                  1.75g
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。
5)悬浮培养基
N6max母液(10X)          5ml
N6mix母液(100X)         0.5ml
Fe2+EDTA贮存液(100X)    0.5ml
维生素贮存液(100X)      1ml
2，4-D贮存液            0.2ml
CH                      0.08g
蔗糖                    2g
加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。
6)选择培养基
N6max母液(10X)          25ml
N6mix母液(100X)         2.5ml
Fe2+EDTA贮存液(100X)    2.5ml
维生素贮存液(100X)      2.5ml
2，4-D贮存液            0.625ml
CH                      0.15g
蔗糖                    7.5g
琼脂粉                  1.75g
加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。
使用前溶解培养基，加入250μl HN和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
7)预分化培养基
N6max母液(10X)        25ml
N6mix母液(100X)       2.5ml
Fe2+EDTA贮存液(100X)  2.5ml
维生素贮存液(100X)    2.5ml
6-BA贮存液            0.5ml
KT贮存液     0.5ml
NAA贮存液    50μl
IAA贮存液    50μl
CH           0.15g
蔗糖         7.5g
琼脂粉       1.75g
加蒸馏水至250ml，1 N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。
使用前溶解培养基，加入250μl HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
8)分化培养基
N6max母液(10X)      100ml
N6mix母液(100X)     10ml
Fe2+EDTA贮存液(100X) 10ml
维生素贮存液(100X)  10ml
6-BA贮存液          2ml
KT贮存液            2ml
NAA贮存液           0.2ml
IAA贮存液           0.2ml
CH                  1g
蔗糖                30g
Phytagel            3g
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。
煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。
9)生根培养基
MSmax母液(10X)        50ml
MSmix母液(100X)       5ml
Fe2+EDTA贮存液(100X)  5ml
维生素贮存液(100X)    5ml
蔗糖                  30g
Phytagel              3g
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。
煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。
(4)农杆菌介导的遗传转化步骤
4.1愈伤诱导
(1)将成熟的水稻种子(中花11，中国农业科学院作物科学研究所)去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；
(2)用灭菌水洗种子4-5次；
(3)将种子放在诱导培养基上；
(4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。
4.2愈伤继代
挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。
4.3预培养
挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。
4.4农杆菌培养
(1)在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105(来源于CAMBIA，商用菌株)两天，温度28℃；
(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。
4.5农杆菌侵染
(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；
(2)调节农杆菌的悬浮液至OD6000.8-1.0；
(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；
(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。
4.6愈伤洗涤和选择培养
(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；
(2)浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；
(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；
(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次潮霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)
4.7分化
(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；
(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，在培养室温度26℃下每天光照培养14小时(光照强度1000-1500lx)，暗培养10小时。
4.8生根
(1)剪掉分化时产生的根；
(2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，培养条件同4.7的步骤(2)所述。
4.9移栽
洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。
实施例4：OsCIPK15基因转基因T2家系苗期耐盐筛选
为了验证转基因水稻植株的耐盐性是否增强以及其增强是否与转入的OsCIPK15基因有关，本发明采用Northern杂交技术对转基因水稻植株中OsCIPK15基因的表达进行检测(图4A为Northern杂交(方法同实施例2)的结果，并对本发明T2代植株的部分家系进行了耐盐性筛选。具体步骤如下：T2代家系的种子在含有50mg/ml潮霉素的生根培养基发芽5天后，将发芽一致的幼苗移栽100mM的生根培养基上并种植野生型对照植株。同时在正常生根培养基上也进行了移植，正常培养基上的生长情况说明转基因对植株的生长发育没有明显的影响(图4D)。而在含100mM盐的生根培养基上，在生长12天以后，我们分别测量了野生型和转基因家系的鲜重、根长、地上部分长，结果显示转基因家系无论在地上和地下部分的长度，还是植株的鲜重都远远强于对照，它们之间的差异极显著(P＜0.01)(图4D、表一)。该结果说明OsCIPK15基因的确与植株耐盐相关，其超量表达能提高转基因植物的耐盐性，转基因水稻植株的抗性增强确实与转入的OsCIPK15基因有关。
表1本发明的转基因家系与对照在含NaCl的生根培养基上生长12天植株的鲜重、地上和根长统计
家系 鲜重(g) 标准差 地上部分长度(cm) 标准差 根长(cm) 标准差
  WTT4T14T19T22     0.060.110.150.130.12     0.010.040.040.040.04     4.329.2113.0211.0510.02     0.753.443.044.812.55     4.729.6011.1710.6710.50     0.842.511.374.500.79
说明：表中WT为野生型对照，Tx：为转基因家系。
序列表
<110>华中农业大学
<120>利用水稻蛋白激酶基因OsCIPK15提高植物耐盐能力
<130>
<141>2007-05-31
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2044
<212>DNA
<213>水稻(Oryza sativa)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(2044)
<223>
<400>1
ggcatccact cctgatacta ccactcaaaa actctctctc tctacccaaa caggtgttga    60
gaaagaagtg agggacagat ccaaaaagtt caccttttgt tacctgaatc tcctcttctt   120
cctgtcaccg gaaggggaat caataaaaaa aacaagcagt gaaagcctca aggaatgctg   180
aaagatgtgc ttgcatagaa gaaattttcc gtgtgagata aaacagattg ctggttcacc   240
agtgctactg atctactcaa gtcttgatgt gagtgatcaa ctttcctgca ctaattctac   300
accatttaga ctccgaaacg acgatgatat aagaatgttg ttctccatcc acgatcatga   360
ccttggggag gatggctaaa gaattgcagt ccatctgatt ggtggtcaaa acatagtgct   420
gagatttata tctttgtggg catggagagt agagggaaga ttctaatgga gaggtatgag   480
ttggggagat tgttggggaa aggaacattt ggcaaggtgc actatgcaag gaatctggag   540
tcaaaccaga gtgtggccat aaagatgatg gacaaacagc agatattgaa ggtcgggctt   600
tcggagcaga tcagacgtga gatcacaacc atgcggttgg tggctcataa gaacattgtt   660
cagcttcatg aggtcatggc aacacggaac aagatctact ttgtgatgga gtatgtgaaa   720
ggtggtgagc tatttgaaaa ggttgcaaag cgtggaaagc ttacagaggt tgttgcacat   780
aagtatttcc agcaactcat tagtgcagtg gattactgcc acagtcgagg tgtgtatcac   840
cgggacttga agcctgagaa cctactgttg gatgagaatg agaacctgaa agtctcagac   900
tttggattga gtgcgctttc agagtcgaag aggcaagatg gcttactcca taccacctgt   960
ggaacacctg catatgtagc tccagaggtg attagcaaga taggctatga tggtgcaaag  1020
tcagatattt ggtcttgtgg tgttatcctg tttgttcttg ttgctggtta ccttcgtttc  1080
cagggcccaa acttgatgga aatgtatcgg aagatacaac acggtgaatt caggtgcccc  1140
ggttggtttt cacgcaaact ccagaagttg ttgtacaaga tcatggaccc caacccaagc  1200
acaaggattt caatccagaa gataaaggag tctacctggt tccggaaagg tcctgaggag    1260
aaccgtattt tgaaggaaag aactttgaat gaaaacacca ccaaaaatgt tgctccggtg    1320
cttggtgtga gacgcaagaa aaatgctcat gaagatgtga agcccatgtc agtgacaaac    1380
ttaaatgctt ttgaaattat ctctttctct aagggatttg atctctctgg catgttcatt    1440
gtaaaggaat ggagaaatga ggcaaggttc acttcagata aatctgcctc aaccataatc    1500
tcaaagctag aagatgtagc aaaggcgcta aatctcaggg taaggaagaa agacaatggt    1560
gtagtgaaga tgcaagggag gaaggaggga aggaatggtg ttcttcagtt tgacatagag    1620
atatttgagg ttaccacttc ctatcatatc atcgagatga aacaaacaag tggcgattca    1680
ttggagtacc gacagctact ggaggagggc atccggccag ctctgaagga cattgtcttg    1740
gcctagcatg gagatgaata gcagcagtcg caagagtaga ttttgatgtc tcaagcattt    1800
agtttccgct cctcaaattc attaggtttt agctcaaatg aatttatttg tcttgcctgt    1860
gttcttttta gcatctatgt ttttgtatct ggagagttca tgttgagaca atgtatgcaa    1920
ttgtatttgg agagttgatg tttaggcaat ttatgcacaa tttagatgga gtctgtcgag    1980
agtaatttta tgagaaattg agctgcaata taaaaattgg ctttgagcct ttcaagcttt    2040
cttc                                                                 2044

Claims (4)

1、OsCIPK15基因介导的赋予植物对盐胁迫耐受能力的DNA序列，它是(a)SEQ ID NO：1中第1-2044位所示的DNA序列，或(b)编码与(a)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。
2、合适启动子连接的权利要求1所述的DNA序列。
3、权利要求2所述的DNA序列，它是SEQ ID NO：1所示的DNA序列。
4、权利要求1-3任一项所述的DNA序列在增加水稻盐胁迫耐受能力中的应用。
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