CN108588117B - 青藏高原野生大麦HsCIPK17在提高水稻抗/耐非生物胁迫中的应用 - Google Patents

青藏高原野生大麦HsCIPK17在提高水稻抗/耐非生物胁迫中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种青藏高原一年生野生大麦(Hordeum spontaneum C.Koch)类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶基因HsCIPK17的用途：HsCIPK17用于构建转基因水稻(Oryza sativa L.)，所述转基因水稻具有重金属胁迫耐性，还同时具有耐盐和脱落酸胁迫耐性；重金属为汞、镉、铬；所述基因HsCIPK17的核苷酸序列，GenBank登录号JN655677。

Description

青藏高原野生大麦HsCIPK17在提高水稻抗/耐非生物胁迫中 的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及青藏高原野生大麦HsCIPK17在提高水稻抗/耐非生物胁迫中的应用。
背景技术
为了适应不断变化的环境，植物必须应对各种生物和非生物胁迫，从而在进化过程中建立起一系列调控机制，如感知和解码各种胁迫信号、信号转导及胁迫相关基因的表达。在植物的生长和发育过程中，Ca2+信号是植物细胞逆境生理响应的中心调节者(Dodd etal.,2010)。Ca2+信号的变化首先被钙感受器感知和解码，再由钙感受器互作蛋白将信号传递到下游，从而激活下游早期响应基因的表达，最终导致广泛的生理或各种特定的应激反应(Zhu et al.,2013)。在过去的十年中，钙调磷酸酶B类似蛋白(Calcinerurin B-likeproteins,CBL)，即一种钙感受器，和CBL互作蛋白激酶(CBL-interacting proteinkinases,CIPKs)，为一种Ca2+依赖的丝氨酸/苏氨酸激酶，已被证实是植物特有的一种信号系统，在植物应答各类生物和非生物胁迫过程中发挥信号功能作用(Kolukisaoglu etal.,2004；Xu et al.,2006；Luan 2009；Weinl and Kudla 2009；Hashimoto and Kudla,2011；de la Torre et al.,2013)。
CIPKs在各种生物胁迫(如病原体感染、营养缺乏等)和非生物胁迫(如盐、脱落酸(ABA)等)中起重要作用(Guo et al.,2001；Kim et al.,2003；Kurusu et al.,2010；Li etal.,2012；de la Torre et al.,2013；Meteignier et al.,2017)。水稻(Oryza sativaL.)中，超表达OsCIPK3、OsCIPK12和OsCIPK15能提高干旱、低温和盐胁迫的抗性(Xiang etal.,2007)，而缺失OsCIPK31功能基因突变体，在种子萌发和幼苗阶段表现出对多种非生物胁迫的敏感性，如脱落酸(ABA)，盐，甘露醇和葡萄糖(Piao et al.,2010)，但迄今没有证据表明CIPK参与植物对重金属毒性应答相关研究报导。
青藏高原野生大麦，尤其是其特有的一年生野生大麦(Hordeum spontaneumC.Koch)，长期遭受极端气候和环境条件，从而产生了丰富的变异体和独特的胁迫耐受性基因网络。由于青藏高原野生大麦与栽培大麦具有密切的遗传同源性，青藏高原被认为是栽培大麦驯化的中心之一(Dai et al.,2012)。青藏高原野生大麦CIPK是稀缺的种质资源，应用于转基因水稻或其他作物提高逆境胁迫能力具有重要意义。
脱落酸(ABA)参与植物重要生理过程及对多种逆境胁迫的响应，已有的研究表明，拟南芥AtCIPKs参与调控ABA介导的信号途径(Chen L et al.,2013；Lyzenga et al.,2013；Sanyal et al.,2017)。重金属是植物生长的重要胁迫因子，通过食物链危害动物和人类(梁尧等,2013；焦位雄等,2017)。由于重金属极其稳定、不可降解，污染土壤对植物生长发育和作物产量及品质造成不可逆转的危害(Mustafa and Komatsu,2016)。通过基因工程提高作物对重金属毒害的高抵抗力是最佳方案(Cao et al.,2014)。
目前，还未有告知同时具有重金属和盐等非生物胁迫抗/耐性的CIPKs基因。
上述参考文献具体如下：
1、Cao FB,Wang RF,Cheng WD,Zeng FR,Ahmed IM,Hu XN,Zhang,GP,and Wu FB(2014)Genotypic and environmental variation in cadmium,chromium,lead andcopper in rice and approaches for reducing the accumulation.Science of theTotal Environment,496:275-281(Cao FB,Wang RF,Cheng WD,Zeng FR,Ahmed IM,Hu XN,Zhang,GP,and Wu FB(2014)镉、铬、铅、铜影响水稻基因型和环境变异及减少积累的途径.Science of the Total Environment,496:275-281)；
2、Chen L,Wang QQ,Zhou L,Ren F,Li DD,Li XB(2013)Arabidopsis CBL-interacting protein kinase(CIPK6)is involved in plant response to salt/osmotic stress and ABA.Mol Biol Rep.40:475947-67(Chen L,Wang QQ,Zhou L,Ren F,Li DD,Li XB(2013)拟南芥CBL-互作蛋白激酶(CIPK6)参与植物对盐/渗透胁迫和ABA的胁迫响应.Mol Biol Rep.40:475947-67)；
3、Dai F,Nevo E,Wu DZ,Comadran J,Zhou MX,Qiu L,Cheng ZH,Belles A,ChenGX,Zhang GP(2012)Tibet is one of the centers of domestication of cultivatedbarley.Proc Natl Acad Sci USA 109:16969-16973(Dai F,Nevo E,Wu DZ,Comadran J,Zhou MX,Qiu L,Cheng ZH,Belles A,Chen GX,Zhang GP(2012)西藏是栽培大麦驯化的中心之一.Proc Natl Acad Sci USA 109:16969-16973)；
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发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种青藏高原野生大麦HsCIPK17在提高水稻抗/耐非生物胁迫中的应用，本发明所得的转基因植株同时具有重金属和盐、脱落酸(ABA)等非生物胁迫耐性。
为了解决上述技术问题，本发明提供青藏高原一年生野生大麦(Hordeumspontaneum C.Koch)类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶(CBL-interacting proteinkinase,CIPK)基因HsCIPK17的用途：HsCIPK17用于构建转基因水稻(Oryza sativa L.)，所述转基因水稻具有重金属胁迫耐性；
所述基因HsCIPK17的核苷酸序列，GenBank登录号JN655677。
作为本发明的野生大麦基因HsCIPK17的用途的改进：所述转基因水稻还同时具有耐盐和脱落酸(ABA)胁迫耐性。
即，所述转基因水稻HsCIPK17同时具有重金属、耐盐和脱落酸(ABA)这3种非生物胁迫耐性。
作为本发明的野生大麦基因HsCIPK17的用途的进一步改进：所述重金属为汞、镉、铬。
即，所述转基因水稻HsCIPK17具有耐汞性、耐镉性、耐铬性；还具有耐盐性，具有耐脱落酸(ABA)性。
作为本发明的野生大麦基因HsCIPK17的用途的进一步改进：用HsCIPK17基因转化水稻成熟胚愈伤组织，再将转化后的水稻细胞培育成转基因植株，所述转基因植株具有重金属、耐盐和脱落酸(ABA)这3种非生物胁迫耐性。
实现本发明的具体技术步骤如下：
一、克隆青藏高原一年生野生大麦HsCIPK17基因
通过PCR技术，克隆野生大麦HsCIPK17基因，通过酶切连接等分子生物学技术将HsCIPK17基因编码序列CDS构建到花椰菜花叶病毒35S启动子载体。见图1、2和表1。
二、水稻转基因
利用电击法将35S::HsCIPK17表达载体导入根瘤农杆菌感受态(EHA105)，通过农杆菌侵染水稻日本晴成熟胚愈伤组织，抗性愈伤的筛选与分化获得HsCIPK17基因超表达的转基因植株。见图3和表2。
三、外源HsCIPK17基因在水稻转基因植株中的表达
通过转基因技术将外源HsCIPK17基因导入水稻中，利用半定量RT-PCR等方法在T1转基因植株中检测外源HsCIPK17基因的表达水平，最终获得超表达的转基因水稻植株。见图4和表1。
四、T3转基因纯合株系的筛选
高表达株系繁殖至T3代后对其进行纯合株系筛选，根据其分离比进行纯合体或杂合体判定。见图5和表2。
五、重金属等非生物胁迫诱导一年生野生大麦内源HsCIPK17转录表达
通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测重金属盐(HgCl2、CdCl2和K2Cr2O7)和其他非生物胁迫(盐和ABA)对青藏高原一年生野生大麦内源HsCIPK17转录表达水平的影响。见图6和表1。分别以20μM HgCl2(图6A)、20μM CdCl2(图6B)、0.5mM K2Cr2O7(图6C)、400mM NaCl(图6D)和20μM ABA(图6E)胁迫处理1、3、6、12和18小时后检测内源HsCIPK17转录表达，结果表明，各胁迫不同时间表达水平均显著增加。
六、T3转基因纯合株系HsCIPK17基因功能鉴定
选择T3转基因纯合株系水稻种子和非转基因种子，经过催芽、幼苗培养4天，用于重金属、盐和ABA等胁迫处理。0.5μM HgCl2(图7A)、5μM CdCl2(图7B)、5μM K2Cr2O7(图7C)、NaCl 50mM(图7D)和1μM ABA(图7E)，空白对照处理为0.1mM CaCl2，处理24小时后，测定初生根伸长量，计算初生根相对伸长率RER(％)。结果表明，HsCIPK17转基因水稻植株对重金属、盐和ABA等非生物胁迫处理均具有明显抗/耐性(图7)。
由于工业化的加速，耕地重金属污染严重，国土资源部统计表明，目前全国耕种土地面积的10％以上已受重金属污染。为充分利用这些耕地，迫切需要培育抗耐性强的作物品种，基因工程技术的发展使得应用CIPK基因调节作物适应不同重金属逆境条件成为可能。本发明通过克隆技术获得青藏高原一年生野生大麦HsCIPK17基因，通过转基因获得超表达材料，并初步鉴定了该基因的功能。
本发明使水稻具有良好的抗重金属等逆境耐性，从而促进其生长发育。本发明明确了HsCIPK17在抗重金属毒性、耐盐性和脱落酸(ABA)等方面的功能，发明成果可用于通过生物技术调节作物CBL互作蛋白激酶基因的表达，从而培育在抗环境胁迫或产量方面有显著提高的作物新品种。本发明具有良好的应用前景。
综上所述，本发明涉及一种通过PCR克隆青藏高原一年生野生大麦(Hordeumspontaneum C.Koch)类钙调磷酸酶B蛋白(calcineurin B-like proteins,CBLs)互作蛋白激酶(CBL interacting protein kinases，CIPKs)基因HsCIPK17，并且通过转基因技术获得HsCIPK17超表达水稻植株；还涉及利用该基因调控水稻受到重金属逆境胁迫和其他非生物胁迫抗/耐性，从而增强水稻在逆境条件下生长发育提高水稻产量。
本发明通过分子克隆技术成功从青藏高原一年生野生大麦中克隆到HsCIPK17基因，并构建了HsCIPK17超表达载体，利用根瘤农杆菌介导的水稻遗传转化技术，将HsCIPK17表达载体导入日本晴水稻品种中，筛选鉴定转基因后代，繁殖高表达转基因株系。本发明发现HsCIPK17能显著提高转基因水稻植株对重金属(如汞、镉和铬)、盐和ABA等非生物胁迫的抗/耐性能力。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是水稻转化超表达载体示意图；
A为简明结构示意图；B为植物表达载体图谱；
2×35S为花椰菜花叶病毒35S启动子载体(pCAMBIA2300-2×35S)，载体无gus报告基因，含有卡那霉素(Kanamycin)抗性基因，35S启动子后接全长HsCIPK17cDNA，用于转基因后可获得超表达HsCIPK17的转基因植株。
图2是HsCIPK17超表达载体构建图；
(A)HsCIPK17PCR产物；
(B)PCR阳性克隆鉴定，CK为对照，1～23分别代表不同株系，其中19和22为两个阳性克隆株系；
(C)35S:HsCIPK17双酶切鉴定；M：DNA分子量标记；D：酶切；U：未酶切。
图3是水稻遗传转化获得转基因幼苗；
(A)愈伤诱导，水稻日本晴成熟胚在N6D培养基上诱导愈伤，用于转基因；
(B)共培养，导入HsCIPK17的超表达载体的农杆菌EHA105，侵染愈伤组织后，在共培养基上暗培养；
(C)抗性愈伤筛选，脱菌后将愈伤组织转移到含有G418的培养基上进行抗性筛选(因水稻对卡那霉素具有较高抗性)，长出新的抗性愈伤；
(D和E)愈伤分化，抗性愈伤转到分化培养基上诱导分化，长成小苗；
(F)生根培养，分化出的小苗转移至生根培养基，根从苗的基部长出；
(G.)炼苗，炼苗后移入大田种植。
图4是半定量RT-PCR鉴定外源HsCIPK17基因在T1代水稻转基因植株中表达水平；
转35S:HsCIPK17株系，NC：阴性对照株系日本晴；OsActin为内参；数字为不同株系编号；1～9为株系编号。
图5是T3代纯合株系筛选；
(A)G418抗性培养基筛选，左边纯合体株系，右边野生型株系；
(B)筛选培养基上根的生长情况，左边抗性株系，右边野生型株系。
图6是重金属等非生物胁迫诱导一年生野生大麦内源HsCIPK17转录表达结果；
以RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)RNA试剂盒提取4日龄一年生野生大麦幼苗经重金属和其他非生物胁迫分别处理0、1、3、6、12和18小时后的苗或根的总RNA并进行测定。相对表达水平以相对平均值±标准偏差表示，以0小时处理组为对照，经t-检验，*、**和***分别表示P＜0.01、0.001和0.0001。
图6A 20μM HgCl2处理，HsCIPK17的相对表达水平；
图6B 20μM CdCl2处理，HsCIPK17的相对表达水平；
图6C 0.5mM K2Cr2O7处理，HsCIPK17的相对表达水平；
图6D 400mM NaCl处理，HsCIPK17的相对表达水平；
图6E 20μM ABA处理，HsCIPK17的相对表达水平。
图7是HsCIPK17超表达水稻植株的重金属等非生物胁迫鉴定结果；
T3转基因纯合株系水稻种子和非转基因(NT)种子，幼苗培养至根长3-4cm，分别进行重金属、盐和ABA等非生物胁迫处理24小时后，测定初生根的伸长量，并计算初生根相对伸长率RER(％)，所得结果以相对平均值±标准偏差表示，以NT为对照，经t检验，*和**分别表示P＜0.01和0.001；
图7A 0.5μM HgCl2，图7B 5μM CdCl2，图7C 5μM K2Cr2O7，图7D 50mM NaCl，图7E 1μM ABA。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、种子萌发和培养
青藏高原一年生野生大麦X74(Hordeum spontaneum C.Koch)和水稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica)种子用70％乙醇进行表面消毒10分钟，随后用10％NaClO消毒30分钟，最后用水漂洗8次。大麦和水稻籽粒胚乳中含有大量的营养素，从而足以满足一周内籽粒萌发的营养需要。因此，一个简单的CaCl2溶液(0.1mM CaCl2；pH 5.8)用于大麦和水稻种子萌发和幼苗生长。在黑暗25℃，大麦无菌种子置于CaCl2溶液浸湿的两层滤纸之间萌发一天，种子转移到新的CaCl2溶液浸湿的脱脂棉滤纸上继续培养4天(黑暗25℃)。水稻种子在黑暗(4℃)处理3天，然后在37℃下萌发3天，最后将发芽种子转移到CaCl2溶液浸湿的脱脂棉滤纸上继续培养4天(14小时光28℃/10小时暗25℃)。根长相近的4日龄大麦和水稻幼苗用于本发明的研究。
实施例2、青藏高原一年生野生大麦HsCIPK17基因的克隆
(1)使用的两种方法电子克隆HsCIPK17。首先用已知水稻OsCIPK1到OsCIPK31(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/；OsCIPK cDNAs基因登录号如下)全长cDNAs为探针，在大麦(Hordeum vulgare L.)全长cDNA库搜索同源基因(http://earth.lab.nig.ac.jp/～ dclust/cgi-bin/barley_pub/)。其次，将作为探针的水稻OsCIPK1到OsCIPK31全长cDNAs中的保守序列激活环和NAF/FISL基序与大麦nucleotide collection(nr/nt)数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST比对同源片段序列，并进行电子拼接和延伸。最后，用DNA STAR SeqMan和Megalign software对所得的全长cDNA进行分析。
OsCIPK1-OsCIPK31cDNAs NICB Genbank登录号
Figure BDA0001657492470000101
(2)从4日龄幼苗用于总RNA的提取，方法参考总RNA提取试剂盒RNeasy PlantMini Kit(QIAGEN)厂家提供的提取方法。用NanoDrop测定OD值。利用上述获得的总RNA进行cDNA合成，合成方法参见逆转录试剂盒
Figure BDA0001657492470000102
III Reverse Transcriptase(Invitroge)厂家提供的提取方法。
备注说明：基因HsCIPK17，GenBank登录号JN655677；其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例3、HsCIPK17基因的转基因35S::HsCIPK17载体的构建
采用PCR、限制性酶切及与植物转化载体pCAMBIA2300S拼接构建了35S::HsCIPK17(图1)。pCAMBIA2300S含2×CaMV 35S启动子和卡那霉素抗性标记。该载体用于HsCIPK17基因在水稻中的超表达。以cDNA为模板，利用HsCIPK17特异性引物(表1)扩增相应HsCIPK17目的片段，PCR扩增体系(50μL体系)如下：PCR H2O 17.5μL，2×PrimerSTAR GCBuffer 25μL，PrimerSTAR HS DNA Polymerse 0.5μL，dNTP mixture 4μL，Primer F 1μL，Primer R 1μL，cDNA 1μL。PCR扩增程序如下：预变性94℃3min，变性98℃10s，退火65℃5s，延伸72℃1min，35个循环，延伸72℃10min，16℃保存。然后通过纯化(切胶回收)、酶切、连接等分子克隆操作将目的片段连接到载体上，用热击法将连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中。利用PCR和酶切进行阳性克隆分析鉴定，再进行测序分析，最后获得正确的35S::HsCIPK17超表达载体。最终载体35S::HsCIPK17图见图1，鉴定结果见图2。
表1、克隆、RT-PCR和荧光定量PCR的引物序列
Figure BDA0001657492470000111
根据图2，可得知35S::HsCIPK17超表达载体构建成功。
实施例4、HsCIPK17基因超表达转基因水稻的培育(图3和表2)
水稻转基因背景材料为粳稻品种日本晴(Nipponbare)。转基因方法如下：
(1)根瘤农杆菌(EHA105)转化，采用电击法将HsCIPK17超表达载体(35S::HsCIPK17)导入根瘤农杆菌感受态(EHA105)。
(2)水稻愈伤组织预培养，以水稻日本晴成熟胚为试材诱导愈伤组织，基本步骤如下：
①将水稻成熟种子进行机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子；
②将种子放入250mL无菌三角烧瓶中，用70％酒精消毒2min；
③用无菌水冲洗3-5次，再加入30％NaClO溶液，每50mL加入1滴Tween-20，置于180rpm摇床上消毒30min；
④重复上一步骤，用无菌水清洗种子4-5遍(由此开始均在超净台上操作)；
⑤倒去无菌水，将种子置于无菌滤纸上以吸走剩余的水分，然后将消毒后的种子接种到N6D培养基上，32℃持续光照培养5-7天，诱导大量愈伤(培养过程中每隔1-2天观察种子的愈伤诱导状况，同时检查污染情况，将未污染的种子及时转入干净的N6D培养基中)。
(3)农杆菌侵染及脱菌
①摇菌、取含相应载体的农杆菌EHA105菌株划板于LB+50mg/L Rif+50mg/L Kan培养基上，28℃暗培养2天。挑取单克隆菌落于5mL LB+Kan+Rif液体培养基中，28℃摇菌约24h。取500uL菌液于50mL含10-20mg/L AS的AAM培养基中，220-250rpm，过夜培养至OD600约0.1。
②侵染、将预培养的愈伤组织转移到250mL无菌三角烧瓶中，然后倒入50mL农杆菌悬浮液，轻轻晃动约1.5min；倒出愈伤组织并用无菌滤纸上吸去多余菌液，干燥30min。
③共培养，在共培养基(N6D-AS，即，含10-20mg/L AS的N6D培养基)表面上垫一层用AAM浸润的无菌滤纸，将愈伤组织接种于此滤纸上)，25℃暗培养3天。
④脱菌，共培养3天后，将愈伤组织转移到无菌三角烧瓶中，先用无菌水清洗4-5次，直至液体不再浑浊，然后加入适量含500mg/L Cef的无菌水冲洗并置于28℃，120rpm摇床上，间隔30min替换含500mg/L Cef无菌水，最后再用无菌水冲洗。脱菌干净后，将愈伤置于滤纸上晾干(2-3h)。
(4)抗性愈伤的筛选与分化，脱菌后的愈伤接种于筛选培养基(N6D+150mg/L G418+500mg/L Cef)上，32℃持续光照培养两周。将生长旺盛的抗性愈伤转移到分化培养基(RE-Ⅲ+0.02mg/L NAA+2mg/L KT+125mg/L Cef+100mg/L G418)上诱导分化，32℃持续光照培养待长出绿芽。
(5)生根与炼苗，由于分化培养基上营养有限，分化出的幼苗需及时移栽到生根培养基(HF+125mg/L Cef+70mg/L G418)上诱导生根。2-3周后将长势茁壮的组培苗的生根瓶打开，加入适量的无菌水以隔离病原体，炼苗三天左右，洗脱琼脂，进行水培。
备注说明：
炼苗后的再生试管苗即为T1代，经RT-PCR检测T1代植株，确认含35S::HsCIPK17载体的转基因植物为超表达株系；
T3代超表达纯合体株的获取方式为经G418-抗性选择(即，满足不再出现分离条件)获得HsCIPK17超表达转基因株系的纯合株系T3代。
实施例5、转基因水稻目的基因表达量检测
(1)RNA提取和cDNA合成
根据RNA提取试剂盒RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)的说明，提取T1代转基因水稻各株系的总RNA，并用NanoDrop测定RNA浓度。利用上述获得的总RNA进行cDNA合成，根据逆转录试剂盒ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO)提供的合成方法进行逆转录，合成体系(20μL)如下：5×RT Buffer 4μL，RT Enzyme Mix 1μL，Primer Mix 1μL，RNA 5μL，Nuclease-free water 9μL。
RNA变性，取0.1-1μg RNA置于PCR管中，用Nuclease-free water定容到5μL，混匀后置于PCR仪内，65℃变性5min，立即取出插入冰中快速降温，防止复性。
逆转录程序，37℃逆转录15min；98℃酶失活5min；16℃保温。
(2)引物，根据HsCIPK17的编码序列CDS，利用DNAStar Lasergene 7.1软件设计引物，用于RT-PCR分析。具体引物序列(RT-PCR assay)见表1。
(3)RT-PCR反应参数，以cDNA为模板，OsActin作为内参，RT-PCR反应体系如下：PCRH2O 8.2μL，2×Taq Master Mix 10μL，Primer F 0.4μL，Primer R 0.4μL，cDNA 1μL。RT-PCR反应程序如下：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火60℃30s，延伸72℃1min，27个循环，延伸72℃5min，16℃保存。
用1％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，检测结果如图4。
根据图4显示，能得出以下结论：HsCIPK17超表达转基因株系的基因表达较非转基因对照均有提高，其中超表达的株系见表2。因此，转基因水稻获得了预期的转基因效果。
表2、获得的T1代转基因株系与T3代超表达纯合株系
Figure BDA0001657492470000131
图4为半定量RT-PCR鉴定，根据结果可得知：6、8、9株系(即对应的T1代编号为T1.6、T1.8、T1.9)的表达明显强于对照NC野生型日本晴，说明构建的载体成功在此株系；T3代为在T1代基础上，通过分离选择得到相应的纯合株系，即对应的T3代编号为T3.6、T3.8、T3.9。
根据此表2，可得知：转基因水稻获得了预期的转基因效果，获超表达纯合株系T3代，可以对HsCIPK17的抗性功能进行实验研究，确保数据稳定。
实施例6、水稻T3代转基因纯合株系的筛选
将高表达株系繁殖至T3代后对其进行纯合株系筛选。每一植株选取约40粒种子，置于37℃生化培养箱中萌发。先用0.6％的稀硝酸浸泡16h(促进萌发)，再换用自来水浸泡两天(每天换一次水)，待种子露白后将其插入0.6％Agar+20-80mg/L G418的固体培养基上，进行抗性筛选。28℃，14h光照/10h黑暗培养两周后，可以发现抗性幼苗与非抗性幼苗的生长状况(地上部分及根)明显不同，根据其分离比进行纯合体或杂合体判定。若同一植株的所有幼苗均有对筛选培养基的抗性，并且不出现分离(注：是否纯合，最主要看有没有出现分离)，则表明此植株为纯合体株系。见图5和表2。
根据图5，可得知：水稻T3代转基因纯合株系顺利获得。
说明：为保证材料的可靠性及后续实验数据稳定，本发明对以上获取高表达株系进行抗性筛选，最终获得超表达纯合体株系作为后续功能验证的材料。从T1代植株上收获T2代种子，经含20mg/L G418抗性培养基筛选后，结合孟德尔分离比，选择3:1分离比的杂合株系，再繁殖一代获得T3代种子。将T3代种子在含20-80mg/LG418G418的Agar培养基上进行纯合株系筛选，如图5A所示。抗性幼苗根和叶能够正常生长，而野生型幼苗生长受到明显抑制，植株矮小，且叶片不展开，根生长也明显受到抑制(图5B)。若筛选株系为杂合体时，将表现出接近3:1的分离比，即1/3幼苗叶和根生长抑制，而其余2/3的幼苗叶和根生长正常；当筛选的株系为纯合体时，则全部幼苗叶和根生长均正常。通过以上方法，HsCIPK17表达载体的超表达转基因株系筛选到纯合体株系。
实施例7、重金属等非生物胁迫诱导一年生野生大麦内源HsCIPK17转录表达测定
为检测重金属等非生物胁迫对内源HsCIPK17在青藏高原一年生野生大麦内转录表达水平的影响，用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)分离提取各处理后的全苗或根总RNAs。
处理方式为20μM HgCl2、20μM CdCl2、0.5mM K2Cr2O7、400mM NaCl和20μM ABA，各浓度增多处理处理0、1、3、6、12和18小时。
cDNA的首链用SuperScript III First-Strand Synthesis System(Invitrogen)合成。qRT-PCR检测采用Thunderbird SYBR qPCR mix(Toyobo)和StepOnePlus Real-TimePCR System(Applied Biosystems)。反应体积20μl，含10μl 2×SYBR qPCR mix(Toyobo),10ng cDNA,1μM各基因特异引物。PCR循环：每循环95℃，3min；40个循环95℃5sec，60℃50sec。使用StepOne Software v2.1收集和分析所得到的数据。转录水平内参基因HvActin(表2)。HsCIPK17经胁迫处理不同时间后的转录水平以0时间点(对照，设为1.0)的相对值表示。统计分析采用t-test(Student’s t-test,two tails；type 2)，不同时间点三次独立实验的转录水平与对照进行比较。见图6。
根据图6，可得知：重金属等非生物胁迫对内源HsCIPK17在青藏高原一年生野生大麦内转录表达水平均有显著和及显著的影响。
实施例8、水稻T3代抗逆境胁迫根伸长测定
首先利用根相对伸长率(RERs)来确定各种逆境处理的最佳处理浓度。将水培4天根长约3-4cm的野生型水稻(日本晴)幼苗8-10株，分别用不同浓度梯度的处理液(含0.1mMCaCl2)和空白对照(Mock，0.1mM CaCl2)处理24小时。测量处理前后初生根长度，计算初生根相对伸长率RER(％)＝(LT24-LT0)/(Lmock24-Lmock0)×100％，其中LT0和LT24为胁迫处理前后初生根长度(mm)，而Lmock0和Lmock24为空白对照处理前后初生根长度(mm)。当根的相对伸长率RER接近50％时的处理浓度确定为最佳浓度。最后确定各胁迫最佳处理浓度(均含0.1mMCaCl2)分别为：0.5μM HgCl2，5μM CdCl2，5μM K2Cr2O7，50mM NaCl和1μM ABA。将根长3-4cm的转基因和非转基因(NT)幼苗，胁迫处理24小时，并在处理前后分别测量初生根的长度，按照上述公式计算各转基因株系初生根相对伸长率。三次独立实验、每处理45棵幼苗的测定数据用于统计分析，以非转基因株系(NT)为对照，Student’s t-test(two tails；type 2)进行统计学评价。
根据统计分析，明证转基因水稻抗重金属等非生物胁迫能力显著增强，具有明显的耐重金属等非生物胁迫特性。见图7。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 兰州大学
<120> 青藏高原野生大麦HsCIPK17在提高水稻抗/耐非生物胁迫中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1401
<212> DNA
<213> 青藏高原一年生野生大麦(Hordeum spontaneum C. Koch)
<400> 1
atggtggcga cgggcgacgc ggaggacgcg gcggcggggt gccgcgcgcg ggcggcgctg 60
ctgggcgggt acgagctcgg gcggacgctc ggggaaggca acttcggcaa ggtgaagcac 120
gcgcggcacc gcgccaccgg ggaccacttc gccgtcaaga tcctcgaccg cggccgggtg 180
ctctccctcc gcggcgccga cgaccaggtc cgccgcgaga tcgccacgct caccatgctc 240
gcccacccca acgtcgtccg cctccacgag gttgctgcta gcaaaacaaa gatctatatg 300
gtgcttgagt ttgtcaatgg aggcgaactt tttgacagga ttgcaatgaa gaaaaaacta 360
tctgaacgag aaggaaggag gctttttcag cagctaattg atggtgtgag ctattgccat 420
ggaaagggtg tctaccacag agacctcaag cctgaaaacg ttcttattga ccggaaaggc 480
aacatcaaga tctctgattt tggtctcagt gctttaccac aacatctcgg gaatgatgga 540
ttgctgcata caacctgtgg tagccccaac tatattgctc ctgaggttct gcagaacaga 600
ggttacgacg gatcattgtc ggatatctgg tcttgtggag taattcttta cataatgctc 660
gtaggaaacc ttccgtttga tgaccgaaat atggttgttc tttatcagaa gattttcaag 720
ggtgacgctc agatcccgga gtggctttct cccagtgcac aaaacctcct tcgtaggatt 780
cttgaaccaa atccgaggaa gaggattaac atggcagaga taaaaataca cgaatggttt 840
cagaaggact atattcctgt tgctccatat gatgacgatg atgaagatgt acggcttggt 900
gcaattctac ctatcaaaca gcaaattagt gaagcacccg gcgacaagag cactcatcag 960
atgaacgctt ttcagctgat cggaatggca tcctccctcg atctttcagg tttatttgag 1020
gaagagggag tgtcccagag aaagatcagg ttcacatcag cacaaccacc gaaggatttg 1080
ttcgacaaga ttgaagtgtc cgcgacacag tcggggttcc atgtccagag agcgcatagc 1140
aagctcaaaa taacgggaaa ctgcaatgga ccgaacaacc ccacaccatt cttagtctgt 1200
gccgaggtgt ttgagcttgg cccctctctt catgttgtgg agcttaggaa gtcccatggt 1260
gacactgcag tgtacagaca gctctgcgac aggatctcga gtgacctggg aattgacaag 1320
atttttggga tggggtcgct cttcgacgac aacctcccga gcttcgacag cagagccgcg 1380
acaccactgg ttgccttgtg a 1401

Claims (2)

1.青藏高原一年生野生大麦(Hordeum spontaneum C.Koch)类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶基因HsCIPK17的用途，其特征是：HsCIPK17用于构建转基因水稻(Oryza sativaL.)，所述转基因水稻具有重金属胁迫耐性，还同时具有耐盐和脱落酸胁迫耐性；所述重金属为汞、镉、铬；能促进根伸长；
所述基因HsCIPK17的核苷酸序列，GenBank登录号JN655677。
2.根据权利要求1所述的野生大麦基因HsCIPK17的用途，其特征是：用HsCIPK17基因转化水稻成熟胚愈伤组织，再将转化后的水稻细胞培育成转基因植株，所述转基因植株具有重金属、耐盐和脱落酸这3种非生物胁迫耐性，能促进根伸长。
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