CN112980874B

CN112980874B - GhCIPK6D1基因在提高棉花抗旱性中的应用

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Publication number: CN112980874B
Application number: CN202110381553.6A
Authority: CN
Inventors: 杨细燕; 张献龙; 孙伟男; 夏林杰; 孙思敏; 朱龙付
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2041-04-09
Also published as: CN112980874A

Abstract

本发明提供了GhCIPK6D1基因在改变棉花抗旱性中的应用，属于棉花育种技术领域。本发明提供了一种用于敲除GhCIPK6D1基因的方法在提高棉花抗旱性中的应用，所述GhCIPK6D1基因包括核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的DNA序列或编码氨基酸序列如SEQIDNO:2所示蛋白质的DNA序列。实验表明分别构建超表达GhCIPK6D1基因的重组载体与敲除GhCIPK6D1基因的重组载体分别转入棉花植株中，经过干旱胁迫处理，超表达GhCIPK6D1基因的转基因棉花植株敏旱，敲除GhCIPK6D1基因的棉花植株更加抗旱。本发明所述应用为培育、筛选或鉴定棉花抗逆种质资源提供理想途经。

Description

GhCIPK6D1基因在提高棉花抗旱性中的应用

技术领域

本发明属于棉花育种技术领域，具体涉及GhCIPK6D1基因在提高棉花抗旱性中的应用。

背景技术

棉花是中国重要的经济作物和油料作物，也是天然纤维的主要来源，在我国的国民经济和国家安全中占有重要地位。但是由于棉花与主要粮食作物对土地的竞争使得棉花的主要产区逐渐向干旱和半干旱的新疆等地方发展，干旱严重制约棉花产量和品质。

随着科学技术的进步和棉花功能基因组学的研究发展，转基因技术作为棉花遗传改良快速有效的方法，为棉花遗传育种带来了巨大的发展空间。通过基因工程技术培育的抗虫棉已经成为我国推广最为成功的转基因作物，国产转基因抗虫棉的研发和产业化的成功，不仅有效提高了棉花对鳞翅目害虫特别是棉铃虫的抵抗能力，挽回了重大的经济损失，极大程度降低了农药的使用，保护了生态环境的安全，而且促进了我国棉花及相关产业的发展，提升了国际竞争力，所产生的经济效益和生态效益不言而喻。

CBL-CIPK信号系统是植物逆境信号转导的关键调控节点，也是研究植物逆境胁迫的热点之一。其中CIPKs基因在许多非生物逆境胁迫如干旱、低温、高盐和ABA等信号转导中扮演者重要的功能。CIPKs与植物中特有的钙感受器CBLs结合，调控下游靶蛋白来响应逆境胁迫，提高植物的抗逆性。干旱胁迫可引起植株根系构型发生改变，通过提高根系的吸水能力来抵御干旱。棉花中CIPK6基因家族有8个成员，通过调控根系发育提高棉花抗旱性的研究还没有被报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种GhCIPK6D1基因在提高棉花抗旱性中的应用，超表达GhCIPK6D1基因的转基因棉花植株更加敏旱，敲除GhCIPK6D1基因的棉花植株更加抗旱，可为培育棉花抗逆种质资源提供理想途经。

本发明提供了一种用于敲除GhCIPK6D1基因的方法在提高棉花抗旱性中的应用，所述GhCIPK6D1基因包括以下序列中的至少一种：

1)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA序列；

2)编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示蛋白质的DNA序列。

本发明提供了一种用于敲除GhCIPK6D1基因的sgRNA组合物，包括gRNA1和gRNA2；

所述gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明提供了一种用于敲除GhCIPK6D1基因的CRISPR/Cas9载体，所述CRISPR/Cas9载体包括所述sgRNA组合物。

优选的，所述CRISPR/Cas9载体的骨架载体为pRGEB32-7。

本发明提供了所述CRISPR/Cas9载体的制备方法，包括以下步骤：

1)以pGTR质粒为模板，采用GhCIPK6D1-a/pGREB32-7s引物对进行第一PCR扩增，得到含gRNA1的片段；

2)以pGTR质粒为模板，采用GhCIPK6D1-2a/GhCIPK6D1-2s引物对进行第二PCR扩增，得到含gRNA2的片段；

3)用所述含gRNA1的片段和含gRNA2的片段为模板，用Inf pRGEB32-7s/InfGhCIPK6D1-a引物对进行重叠延伸PCR扩增，得到含gRNA1和gRNA2的DNA片段；

4)将所述含gRNA1和gRNA2的DNA片段插入骨架载体中，得到CRISPR/Cas9载体；

步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。

优选的，所述骨架载体的插入多克隆位点为Bsa1。

本发明提供了所述sgRNA组合物、所述CRISPR/Cas9载体或所述制备方法制备的CRISPR/Cas9载体在棉花抗旱中的应用。

本发明提供了所述sgRNA组合物、所述CRISPR/Cas9载体或所述制备方法制备的CRISPR/Cas9载体在培育抗旱棉花品种中的应用。

本发明提供了所述sgRNA组合物、所述CRISPR/Cas9载体或所述制备方法制备的CRISPR/Cas9载体在耐旱转基因棉花中的应用。

本发明提供了GhCIPK6D1基因在鉴定和/或筛选耐旱棉花品种中的应用。

本发明提供了一种用于敲除GhCIPK6D1基因的试剂在提高棉花抗旱性中的应用，所述GhCIPK6D1基因包括以下序列中的至少一种：1)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA序列；2)编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示蛋白质的DNA序列。本发明通过分别构建超表达载体pK2GW7-GhCIPK6D1和CRISPR敲除载体pRGEB32-7-GhCIPK6D1，然后分别由农杆菌菌株介导转入棉花中，分别得到超表达转基因植株和敲除转基因植株，分别对两种植株进行干旱胁迫，结果表明，超表达GhCIPK6D1基因的转基因植株更加敏旱，敲除GhCIPK6D1基因植株更加抗旱，可为培育棉花抗逆种质资源提供理想途经。基于GhCIPK6D1基因与棉花干旱胁迫之间呈负向相关。本发明还提供了GhCIPK6D1基因在鉴定和/或筛选耐旱棉花品种中的应用。

附图说明

图1为本发明提供的pK2GW7-GhCIPK6D1超表达质粒载体的图谱；

图2为本发明提供的pRGEB32-7-GhCIPK6D1突变体质粒载体的图谱；

图3为本发明提供的超表达转基因材料PCR阳性检测结果胶图；泳道M表示Marker电泳结果(由上到下依次为500，750，1000，2000，3000和5000bp)，N表示野生型对照材料，P表示阳性质粒对照，转基因材料OE12能扩增出对应的条带，野生型没有条带；

图4为本发明提供的GhCIPK6D1基因敲除编辑效率结果图；

图5为本发明提供的超表达GhCIPK6D1转基因材料RT-qPCR表达量检测结果图；

图6为本发明提供的GhCIPK6D1转基因突变体材料RT-qPCR表达量检测结果图；

图7为本发明提供的GhCIPK6D1转基因材料响应干旱胁迫下叶片相对含水量结果图；

图8为本发明提供的GhCIPK6D1转基因材料响应干旱胁迫下MDA含量测定结果图；

图9为本发明提供的GhCIPK6D1转基因材料响应干旱胁迫下表型变化结果图；其中图9A为GhCIPK6D1转基因材料在正常生长条件下的表型；图9B为超表达株系OE12和敲除GhCIPK6D1基因的cipk6d1-5和cipk6d1-6两个突变体在干旱胁迫下表型；

图10为本发明提供的GhCIPK6D1转基因材料响应干旱胁迫下根系相关指标测定结果图。

具体实施方式

1)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA序列；

2)编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示蛋白质的DNA序列。

在本发明中，通过对棉花GhCIPK6D1基因的敲除，敲除突变体能够显著提高棉花的抗旱性，因此敲除GhCIPK6D1基因可以改良棉花的抗旱性状，具有广泛的应用价值。

在本发明中，所述试剂优选包括sgRNA组合物、包含所述sgRNA组合物的CRISPR/Cas9载体。所述提高棉花抗旱性的方法，利用所述试剂敲除棉花中GhCIPK6D1基因，得到的突变体对干旱胁迫具有优异抗性。

本发明提供了一种用于敲除GhCIPK6D1基因的sgRNA组合物，包括gRNA1和gRNA2；所述gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3(AGCACTGCCATGAAAGTCGT)所示；所述gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4(ACTTCAGGGGCAACAAAAGC)所示。棉花中含有8个所述GhCIPK6基因，gRNA1和gRNA2两个靶标共同作用GhCIPK6D1基因，可以大大提高敲除GhCIPK6D1基因的概率。

本发明提供了一种用于敲除GhCIPK6D1基因的CRISPR/Cas9载体，所述CRISPR/Cas9载体包括所述sgRNA组合物。所述CRISPR/Cas9载体的骨架载体优选为pRGEB32-7。本发明对所述pRGEB32-7的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的pRGEB32-7质粒即可。所述sgRNA组合物插入骨架载体的多克隆位点优选为Bsa1酶切位点。

步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。

本发明以pGTR质粒为模板，采用GhCIPK6D1-a/pGREB32-7s引物对进行第一PCR扩增，得到含gRNA1的片段。

在本发明中，所述GhCIPK6D1-a的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。所述pGREB32-7s的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。所述第一PCR扩增的反应体系优选为ddH₂O 16.1μl；Buffer2μl；dNTP0.3μl；GhCIPK6D1-a引物0.2μl；pGREB32-7s引物0.2μl；DNA聚合酶0.2μl；pGTR模板1μl；所述第一PCR扩增的反应程序优选为95℃预变性4min；95℃30sec，55℃30sec，72℃20s，3个循环，95℃30sec，60℃30sec，72℃20s，27个循环；72℃延伸5min。

本发明以pGTR质粒为模板，采用GhCIPK6D1-2a/GhCIPK6D1-2s引物对进行第二PCR扩增，得到含gRNA2的片段。

在本发明中，所述GhCIPK6D1-2a的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。所述GhCIPK6D1-2s的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。所述第二个PCR片段扩增的反应体系优选为ddH₂O 16.1μl；Buffer2μl；dNTP 0.3μl；GhCIPK6D1-2a引物0.2μl；GhCIPK6D1-2s引物0.2μl；DNA聚合酶0.2μl；pGTR模板1μl。所述第二PCR扩增的反应程序优选为95℃预变性4min；95℃30sec，55℃30sec，72℃20s，3个循环，95℃30sec，60℃30sec，72℃20s，27个循环；72℃延伸5min。

得到所述含gRNA1的片段和含gRNA2的片段后，优选进行切胶回收。本发明对所述切胶回收的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的切胶回收的方法即可，例如采用切胶回收试剂盒进行。

得到含gRNA1的片段和含gRNA2的片段后，本发明用所述含gRNA1的片段和含gRNA2的片段为模板，用InfpRGEB32-7s/InfGhCIPK6D1-a引物对进行重叠延伸PCR扩增，得到含gRNA1和gRNA2的DNA片段。

在本发明中，所述InfpRGEB32-7s的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述InfGhCIPK6D1-a的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。所述重叠延伸PCR扩增的反应体系优选为ddH₂O 16.7μl、EasyTaq Buffer 2μl、dNTP 0.3μl、InfpRGEB32-7s引物0.2μl、InfGhCIPK6D1-a引物0.2μl、DNA聚合酶0.2μl、含gRNA1的片段和含gRNA2的片段各0.2μl。所述重叠延伸PCR扩增的反应程序优选为95℃预变性4min；95℃30sec，59℃30sec，72℃20s，28个循环，72℃延伸5min。

得到含gRNA1和gRNA2的DNA片段后，本发明将所述含gRNA1和gRNA2的DNA片段插入骨架载体中，得到CRISPR/Cas9载体。

在本发明中，所述骨架载体优选预先采用Bsa1酶进行酶切，形成线性化骨架载体。所述酶切的条件优选为37℃条件下酶切6h。所述酶切后，将酶切产物优选进行切胶回收。所述切胶回收优选采用切胶回收试剂盒进行。本发明对所述切胶回收试剂盒的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的切胶回收试剂盒的种类即可。

在本发明中，将切胶回收得到的线性化骨架载体与所述含gRNA1和gRNA2的DNA片段进行In-fusion连接。所述In-fusion连接连接用酶优选为Exnase酶。所述连接的条件优选为目的片段100ng，线性化表达载体100ng，Exnase 0.5μl，CE Buffer 1μl。当所述骨架载体为pRGEB32-7时，连接后得到的连接产物进行阳性重组载体检测。所述阳性重组载体检测的方法优选将得到的连接产物转化入大肠杆菌中，用卡那霉素进行抗性筛选，得到的菌落挑取单克隆培养，进行菌落PCR检测，提取阳性菌落的质粒，得到CRISPR/Cas9载体。所述菌落PCR检测所用引物优选为U6-7s和Inf GhCIPK6D1-a。所述U6-7s的核苷酸序列如SEQ IDNO:11。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。

在本发明中，所述棉花抗旱的方法优选将所述sgRNA组合物或所述CRISPR/Cas9载体导入棉花植株中。所述导入棉花植株的方法优选采用农杆菌介导方法进行。通过sgRNA组合物或CRISPR/Cas9载体能够敲除棉花基因组中GhCIPK6D1基因，使突变后的棉花植株具有较强的抗旱性。

在本发明中，所述培育抗旱棉花品种的方法，优选将所述sgRNA组合物或所述CRISPR/Cas9载体导入棉花植株中，经过阳性检测，得到抗旱棉花品种或耐旱转基因棉花。

本发明提供了GhCIPK6D1基因在鉴定和/或筛选耐旱棉花品种中的应用。所述鉴定和/或筛选耐旱棉花品种的方法优选通过检测GhCIPK6D1基因是否存在，从而判断耐旱棉花品种；具体为当检测样本中不含GhCIPK6D1基因，说明检测棉花品种样本为耐旱品种，当检测样本含有GhCIPK6D1基因，属名检测棉花品种样本为敏旱品种。所述检测GhCIPK6D1基因用引物为U6-7s和InfGhCIPK6D1-a。所述检测的PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。

下面结合实施例对本发明提供的GhCIPK6D1基因在提高棉花抗旱性中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

GhCIPK6D1基因超表达载体和CRISPR/Cas9载体的构建方法

(1)超表达载体pK2GW7-GhCIPK6D1的构建方法

从陆地棉基因组数据库中提取该基因序列(Gh_D07G0265)，设计扩增该基因的引物序列，具体如下：

GhCIPK6D1-BP-F:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGCGGATAAAGCTAAAAA(SEQ ID NO:12)；

GhCIPK6D1-BP-R:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACTCATTCTTTGTAGCACCAG(SEQ ID NO:13)。

以cDNA为模板采用上述引物对进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30sec，57℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。PCR产物经BP反应连接至pDONR^TM载体上(BP酶购自Invitrogen公司，美国；室温下反应4小时，pDONR^TM载体来源于CSIROPlantIndustry，澳大利亚)后转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，培养10～12小时后挑取单克隆进行PCR阳性检测，将阳性克隆测序验证后确定其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。

将克隆到pDONR^TM上的GhCIPK6D1用LR反应(Invitrogen)将其重组至植物表达载体pK2GW7，其中：LR酶购自Invitrogen公司，美国；室温下反应4小时，载体构建图谱见图1(该载体骨架为pK2GW7，在细菌中的抗性为壮观霉素，转基因植株抗性为卡那霉素，目标基因GhCIPK6D1由组成型启动子35S驱动；表达载体pK2GW7来自比利时根特大学)，用反应产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10。培养10～12小时后挑取单克隆进行PCR阳性检测，引物选用35S-F(CCACTATCCTTCGCAAGACCCT，SEQ ID NO:14)和GhCIPK6D1-BP-R(GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACTCATTCTTTGTAGCACCAG，SEQ ID NO:13)，PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。阳性单克隆扩繁并提取质粒，即获得用于转化的超表达质粒pK2GW7-GhCIPK6D1(载体图谱见图1)。

(2)CRISPR敲除载体pRGEB32-7-GhCIPK6D1的构建方法

棉花中共有8个GhCIPK6基因，本发明创建一个特异性针对GhCIPK6D1基因敲除的CRISPR/Cas9载体，命名为pRGEB32-7-GhCIPK6D1，参考基因组序列和CRISPR-P网站http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/搜索靶标，其中pRGEB32-7-GhCIPK6D1包含gRNA1和gRNA2两个靶标，可以大大提高敲除GhCIPK6D1基因的概率。

gRNA1:AGCACTGCCATGAAAGTCGT(SEQ ID NO:3)；

gRNA2:ACTTCAGGGGCAACAAAAGC(SEQ ID NO:4)。

根据gRNA序列设计引物进行两次PCR扩增，利用Bsa1对pRGEB32-7空载体进行酶切，酶切后进行凝胶电泳，对pRGEB32-7空载体大片段挖胶回收，利用Exnase酶将目的片段和线性化表达载体进行连接。所用到的引物如下：

GhCIPK6D1-a:AGCACTGCCATGAAAGTCGTtgcaccagccgggaat(SEQ ID NO:5，含靶标1互补序列)；

pRGEB32-7s:AAGCATCAGATGGGCAAACAAAGCACCAGTGGTCTAG(SEQ ID NO:6，载体上序列)；

GhCIPK6D1-2a:GCTTTTGTTGCCCCTGAAGTtgcaccagccgggaat(SEQ ID NO:7，含靶标2互补序列)；

GhCIPK6D1-2s:AGCACTGCCATGAAAGTCGTgttttagagctagaaata(SEQ ID NO:8，含靶标1序列)；

InfpRGEB32-7s:AAGCATCAGATGGGCAAACAAA(SEQ ID NO:9，载体上序列)；

InfGhCIPK6D1-a:ttctagctctaaaacGCTTTTGTTGCCCCTGAAGT(SEQ ID NO:10，含靶标2互补序列)；

U6-7s：TGTGCCACTCCAAAGACATCAG(SEQ ID NO:11，载体上序列)。

利用引物pGREB32-7s和GhCIPK6D1-a进行PCR1扩增，扩增反应体系为ddH₂O 16.1μl；Buffer 2μl；dNTP 0.3μl；GhCIPK6D1-a引物0.2μl；pGREB32-7s引物0.2μl；DNA聚合酶0.2μl；pGTR模板1μl。扩增反应的程序为95℃预变性4min；95℃30sec，55℃30sec，72℃20s，3个循环，95℃30sec，60℃30sec，72℃20s，27个循环；72℃延伸5min。利用引物GhCIPK6D1-2s和GhCIPK6D1-2a进行PCR2扩增，扩增反应体系为ddH₂O16.1μl、Buffer 2μl、dNTP0.3μl、GhCIPK6D1-2a引物0.2μl、GhCIPK6D1-2s引物0.2μl DNA聚合酶0.2μl、pGTR模板1μl。扩增反应的程序为95℃预变性4min；95℃30sec，55℃30sec，72℃20s，3个循环，95℃30sec，60℃30sec，72℃20s，27个循环；72℃延伸5min。再将PCR1和PCR2产物利用InfpRGEB32-7s和InfGhCIPK6D1-a进行重叠延伸PCR扩增，扩增反应体系为ddH₂O 16.7μl、Buffer2μl、dNTP0.3μl、InfpRGEB32-7s引物0.2μl、Inf GhCIPK6D1-a引物0.2μl、DNA聚合酶0.2μl、含gRNA1和gRNA2的片段各0.2μl。扩增反应的程序为95℃预变性4min；95℃30sec，59℃30sec，72℃20s，28个循环，72℃延伸5min。获得包含2个gRNA的片段。

利用Bsa1对pRGEB32-7空载体37℃酶切6小时，酶切后进行凝胶电泳，对pRGEB32-7空载体大片段挖胶回收，利用Exnase酶将第二次PCR扩增的目的片段和线性化表达载体进行In-fusion连接，构建完成的载体被命名为pRGEB32-7-GhCIPK6D1(载体图谱见图2，附图标记说明：该载体骨架为pRGEB32-7用于在细菌中的抗性为卡那霉素，转基因植株抗性为卡那霉素。)

用反应产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10。培养10～12小时后挑取单克隆进行PCR阳性检测，引物选用U6-7s和InfGhCIPK6D1-a，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。阳性单克隆扩繁并提取质粒，即获得用于转化的超表达质粒pRGEB32-7-GhCIPK6D1(图2)。

(3)载体转化农杆菌

将pK2GW7-GhCIPK6D1和pRGEB32-7-GhCIPK6D1质粒载体分别转化农杆菌菌株EHA105，分别挑取单克隆菌落接于含100mg/L壮观霉素的LB液体培养基和含100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中于150rpm，28℃摇24h，分别用特异引物(U6-7s/Inf GhCIPK6D1-a引物对和35S-F/GhCIPK6D1-BP-R引物对)对菌液进行阳性检测，阳性菌液进行扩繁后可用于棉花的遗传转化。

实施例2

超表达和敲除载体分别在棉花中的遗传转化方法

农杆菌介导的棉花遗传转化

供体材料为陆地棉品系(Jin668)，选择饱满一致Jin668种子，剥去种皮，用0.1％升汞溶液杀菌7～10min，期间不断摇动，再用无菌水冲洗种子3次，每次3min，将种子置于MS培养基表面。30℃暗培养1天后扶苗，继续暗培养4～5天。

将实施例1中EHA105菌株接种于2ml含100mg/L壮观霉素的LB液体和含100mg/L卡那霉素的LB液体中，28℃震荡培养1天，活化好的菌液分别接20μl于20ml含100mg/L壮观霉素的新鲜液体LB和含100mg/L卡那霉素的新鲜液体LB中，于28℃震荡培养过夜，吸取1ml浑浊菌液于2ml无菌离心管，8000rpm离心30s收集菌体，用20ml含50mg/L乙酰丁香酮(AS)的MGL培养基(具体成分见后面描述)重新悬浮菌体，28℃振荡培养30min，用于侵染下胚轴。

农杆菌介导的棉花下胚轴的转化具体步骤如下：

在超净工作台中，取30株无菌苗，在无菌滤纸上将下胚轴切成0.7cm小段接入50ml无菌锥形瓶，分别加入活化好的含有目标载体pK2GW7-GhCIPK6D1和pRGEB32-7-GhCIPK6D1的EHA105农杆菌菌液中，侵染10min，期间摇动数次；倒去菌液，将下胚轴置于无菌滤纸上吸干表面菌液，置于超净工作台吹10～15min后接入不含抗生素的2,4-D诱导培养基(具体成分见后面描述)上，在21℃黑暗条件下共培养36～48h；共培养结束后将下胚轴切段接入含卡那霉素(100mg/L)和头孢霉素(100mg/L)的2，4-D的诱导培养基(具体成分见后面描述)，在28℃弱光下培养；每月继代一次至出现胚性愈伤组织；将胚性愈伤陆续接入胚分化培养基(具体成分见后面描述)，继续每月继代一次至体细胞胚成熟，将成熟的子叶胚接入生根培养基(具体成分见后面描述)上萌发，直至获得完整植株。

本实施例中所用的培养配方：

MGL培养基：胰蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，MgSO₄﹒7H₂O 0.1g/L，KH2PO40.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1g/L，用蒸馏水补充至1L。

2,4-D诱导培养基：以MS为基础培养基，添加2,4-D 0.1mg/L，细胞激动素(KT)0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L。调pH至5.9。

胚分化培养基：以MS为基础培养基，添加1.9g/LKNO₃，KT 0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Gln 1.0g/L，Asn 0.5g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L。调pH至5.9。

生根培养基：以1/2MS为基础培养基，添加葡萄糖15g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L。调pH为5.9。

上述培养基配方中所述的基础MS培养基配方为:大量元素(KNO₃1.9g/L，NH₄NO₃1.65g/L，KH₂PO₄0.17g/L，MgSO₄﹒7H₂O 0.37g/L，CaCl₂﹒2H₂O 0.44g/L)，微量元素(KI0.83mg/L，H₃BO₃6.2mg/L MnSO₄﹒4H₂O22.3mg/L，ZnSO₄﹒7H₂O 8.6mg/L，Na₂MoO₄﹒2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄﹒5H₂O0.025mg/L，CoCl₂0.025mg/L)，铁盐(Na₂﹒EDTA37.3mg/L，FeSO₄﹒7H₂O27.8mg/L)，有机成分(肌醇100mg/L，Gly 2mg/L，VB10.1mg/L，VB60.5mg/L，VB50.5mg/L)。

实施例3

转基因植株的分子鉴定

(1)超表达转基因植株阳性检测及纯系检测

提取实施例2制备的转基因植株幼嫩叶片的基因组DNA，DNA抽提采用天根生化(北京)科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取(具体操作步骤见该试剂盒的说明书)，以35s启动子正向引物35S-F(SEQ ID NO:14)和目的基因反向引物GhCIPK6D1-BP-R(SEQ IDNO:15)，进行PCR检测是否有相应T-DNA插入。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。

转基因植株阳性检测结果见图3。图3为本发明提供的超表达转基因材料阳性检测结果胶图；附图标记说明：N表示野生型对照材料，P表示阳性质粒对照，OE12为阳性超表达株系；

将收取的T1代的种子剥去种皮，用0.1％升汞溶液杀菌10～12min，期间不断摇动，用无菌水冲洗3次，将种子置于棉花无菌苗培养基(含100mg/L卡那霉素)表面。30℃暗培养1天后扶苗，转移至光照室(光照强度为3000Lux，15h光照/9h黑暗)培养，5～6天观察是否有抗性分离(若有长侧根的转基因植株鉴定为阳性转基因植株)。之后每一代单株保留自交种进行筛选直至不发生抗性分离的即为转基因纯系，用作下一步表型分析和功能鉴定。

(2)敲除转基因植株的编辑效率检测

CRISPR-Cas9介导的转基因编辑植株采用高通量测序的方法来鉴定编辑效率。在靶标位点上下游各100bp范围内设计基因特异的引物，在引物上加上扩增接头，通过第一轮PCR反应从转基因植株基因组DNA中扩增靶标区域。以第一轮PCR产物作为模板，通过第二轮PCR扩增，在第一轮PCR产物两端对每份样本加上不同的条码序列(barcode)以便对不同样本进行区分，同时在第二轮PCR反应中引入第二代测序接头和索引序列(index)用于测序数据的提取。

第一轮所用到的Hi-TOM引物如下：

GhCIPK6D1-target1-s:ggagtgagtacggtgtgcGTTTGCTTCACGGAAAATACG(SEQ IDNO:16)；

GhCIPK6D1-target1-a:gagttggatgctggatggAAATCTCACGCTTGATCTGCTC(SEQ IDNO:17)；

GhCIPK6D1-target2-s:ggagtgagtacggtgtgcGATTTCGGACTCAGTGCTTTC(SEQ IDNO:18)；

GhCIPK6D1-target2-a:gagttggatgctggatggGAACCCAGCAAGAAGAACATA(SEQ IDNO:19)。

第二轮PCR完成后将不同的样品进行混合，用DNA纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，每100份单株的混合样品通过第二代测序平台测1G数据量，通过Hi-TOM分析网站(http://www.hi-tom.net/hi-tom/)对数据进行分析。将测定的序列与参考基因组的序列进行比较，对最终的编辑效率(每个株系编辑效率％＝编辑类型1所占比例+编辑类型2所占比例+……编辑类型n所占比例，其中n为编辑类型的总数)进行评估。

图4为本发明提供的pRGEB32-7-GhCIPK6D1转基因材料编辑效率分析。cipk6d1-5和cipk6d1-6为GhCIPK6D1基因编辑创造出的两个突变体；target1是sgRNA1对应的靶标，target2是sgRNA2对应的靶标。两个突变体株系的两个靶标都参与基因编辑，且两个突变体株系都有较高的编辑效率。

(3)转基因植株表达量检测

取转基因棉花植株主茎倒一叶提取RNA，RNA的抽提用常规异硫氰酸胍法。cDNA的合成是以2μg总RNA为模版，与1μl 500μg/ml oligo-dT(15)引物(购自Promega公司)，DEPC-water混合，总体积为14μl；然后70℃变性5min冰上骤冷；再加入10μl含有5μl RTbuffer，1.25μl 10mM dNTP，1.75μl DEPC-water，1μl

Ribonuclease Inhibitor(购自Promega公司，美国)，和1μl SuperscriptⅢ反转录酶(购自Invitrogen公司，美国)的混合液；42℃温浴1h合成第一链；反应结束后70℃处理15min使SuperscriptⅢ反转录酶失活。每份cDNA稀释到200μl后于-20℃保存待用。以上述反转录合成的cDNA为模板，用实施例1中的引物进行特异PCR扩增，棉花GhUb7(GenBank登陆号：DQ116441)基因作为内参对照进行相对定量分析。

图5和图6为本发明提供的GhCIPK6D1转基因材料表达量分析结果图。GhCIPK6D1基因在超表达株系中表达量明显升高，GhCIPK6D1基因在突变体株系中表达量明显降低，后续的功能验证研究中选取超表达系OE12和两个突变体(cipk6d1-5，cipk6d1-6)进行进一步分析。

实施例4

利用转基因棉花对GhCIPK6D1基因进行功能验证

具体步骤如下：

将转基因纯系材料OE12，cipk6d1-5和cipk6d1-6及野生型材料(Jin668)四个株系的材料种植于光照培养室，用相同质量的营养土(基质：蛭石＝3：1)进行培养，待幼苗长至三叶一心时挑取长势一致的每个株系各20株，进行干旱处理7天，同时设置平行对照(正常条件下生长)，分别选取同一部位的叶片，样品取完后迅速放入液氮中冻存。在实验室条件下用液氮将每个处理样品研磨后称取0.1g于2mL离心管中，每个样品称取6份放于-80℃冰箱待用。

(1)相对含水量测定

采集干旱胁迫处理后的三个株系的同一部位的叶片，用天平称取鲜重(FW)，每组材料取3个重复。将称过的叶片浸泡在蒸馏水中约4h，用吸水纸吸干表面的水分后称重(DW)。将叶片置于80℃烘箱约2天，称取重量(TW)，并按照下面公式I计算叶片相对含水量。

相对含水量(％)＝(FW-DW)/(TW-DW) 公式I

图7为本发明提供的GhCIPK6D1转基因材料叶片相对含水量分析。在正常生长条件下，四个材料间叶片含水量基本没差异，而在干旱胁迫下，超表达株系OE12较野生型材料(JIn668)叶片相对含水量低；cipk6d1-5和cipk6d1-6两个突变体相对野生型材料(Jin668)有显著较高的叶片相对含水量，说明突变体更加抗旱。

(2)丙二醛(MDA)含量测定

将称取好的样品取出，每个处理3份样品，按照苏州科铭生物技术有限公司丙二醛(MDA)试剂盒说明书操作，最后取200ul提取液于酶标板中在532nm和600nm处测定吸光值，记为A532和A600，按照如下公式II计算样品MDA含量：

MDA含量(nmol/g鲜重)＝51.6×(A532-A600)÷鲜重公式II

图8为本发明提供的GhCIPK6D1转基因材料MDA含量分析。在正常生长条件下，四个材料间MDA含量基本没差异，而在干旱胁迫下，超表达株系OE12较野生型材料(JIn668)积累更多的MDA；cipk6d1-5和cipk6d1-6两个突变体相对野生型材料(Jin668)积累更少的MDA含量，说明突变体更加抗旱。

(3)根系表型鉴定

转基因材料响应棉花干旱根系表型的变化采用水培法。挑选籽粒饱满的转基因纯系材料OE12，cipk6d1-5和cipk6d1-6及野生型材料(Jin668)四个株系的材料种植于蛭石中，待种子萌发但子叶未完全平展，未长出侧根或刚要长出侧根时将其轻轻拔出，用清水冲洗干净后放置于培养液中，用商业化营养土或改良Hoagland营养液进行培养，具体配方为：2.5mM KNO₃，2.5mM Ca(NO₃)₂，0.5mM KH₂PO₄，1mM MgSO₄，0.5mM KOH，0.15mM EDTA-FeSO₄，15μM H₃BO₃，15μM MnSO₄，4.5μM ZnSO₄，0.015μM CuSO₄，0.15μM Na₂MoO₄，0.75μM KI，0.015μMCoCl₂，棉花苗期实验材料种植于光照培养室，培养条件为14h光照/12h黑暗，光强3000lux，培养温度25℃(除在个别实验中另作说明外)。待幼苗长至三叶一心时采用8％的PEG 6000进行培养一周，同时设置正常生长的平行对照，一周后进行表型鉴定和根系考察。

图9为本发明提供的GhCIPK6D1转基因材料响应干旱的表型鉴定结果。在正常生长条件下，四个材料间植株表型和根系表型没差异，而在干旱胁迫下，超表达株系OE12与野生型材料(Jin668)相比表现敏旱的表型且根系很少甚至没有二级侧根的生长(箭头所示)(图9A)；cipk6d1-5和cipk6d1-6两个突变体相对野生型材料(Jin668)表现出较耐旱的表型且根系有较多的二级侧根生长(箭头所示)(图9B)，说明突变体更加抗旱。

图10为本发明提供的GhCIPK6D1转基因材料响应干旱的根系表型相关指标鉴定结果。在正常生长条件下，四个材料间根系鲜重基本没差异，而在干旱胁迫下，超表达株系OE12与野生型材料(Jin668)相比根系鲜重较低；cipk6d1-5和cipk6d1-6两个突变体相对野生型材料(Jin668)根系鲜重更重，说明突变体更加抗旱。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> GhCIPK6D1基因在提高棉花抗旱性中的应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1368

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgataaggg catcgttgga aaggcctgaa ctgtgccgcc acggtaagcg gtccgtccgc 60

cgcagggatt gccaccctaa aaataataaa agcccgggtt tgcttcacgg aaaatacgag 120

cttggtcgga ttttgggtca tggtactttc gccaaagttt accatgcacg gaatcttcag 180

acagggaaga gcactgccat gaaagtcgtc ggcaaagaaa aagtgataaa cgctggtatg 240

acggagcaga tcaagcgtga gatttccgtc atgaaaatgg tgaaacatcc gaatatagtc 300

gaattgcatg aaattatggc aactaaaacc aagatttact tcgccatgga acttgtccgt 360

ggcggagaac ttttctctaa agtcgctaaa ggccggctcg atgaagactc ggcgagactt 420

tactttcaac aattggtttc cgccatcgat ttctgccata gccgcggcgt ttaccaccgt 480

gatttgaagc ctgagaattt gctgttagac gaagatggaa acctgaaagt tgctgatttc 540

ggactcagtg ctttctcgga acatttgaaa caagatgggt tattgcatac aagttgtgga 600

acaccagctt ttgttgcccc tgaagttatt gggaagaaag gatatgatgg agccaaggtt 660

gatatttggt cttgtggtgt tatcctttat gttcttcttg ctgggttctt gccatttcaa 720

gatgataact tgattgccat gtatagaaag atttacagag gagatttcaa atgtccgcca 780

tggttttctt ctgaagctcg tagattaatc actaagcttt tagaccctaa cccgaagacc 840

cgaatcacca tctcgaagat catgaactcg tcctggttca agaaatctac acccaaggtg 900

gttaaactca aaaccaagga agactcagaa tttgaacatt tcaatggcga caaatcatcg 960

aagcctgaga cattgaacgc ctttcatatc atttcattat ccgatggctt tgatttatcg 1020

ccgttgttcg aagagaaaaa gagagaagag aaacaagagc tgagattcgc tacaaccagg 1080

ccggcgagca gtgtgatatc gagactggaa gaggtggcca agtcggtgaa gttcagtgtg 1140

aagaagaccg agtcgagagt gaggttgcag ggtcaggaat gtgggagaaa agggaaatta 1200

gcggtggccg ccgatatatt cacggtgacg ccctcgttcc tggtggtgga agttaaaaag 1260

gacaacggcg atacccttga atacaaccag ttttgcagta aagagctccg accggcgctt 1320

aaagacatcg tgtggacgtc accggccgag aaatcgacac ttgcttga 1368

<210> 2

<211> 455

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ile Arg Ala Ser Leu Glu Arg Pro Glu Leu Cys Arg His Gly Lys

1 5 10 15

Arg Ser Val Arg Arg Arg Asp Cys His Pro Lys Asn Asn Lys Ser Pro

20 25 30

Gly Leu Leu His Gly Lys Tyr Glu Leu Gly Arg Ile Leu Gly His Gly

35 40 45

Thr Phe Ala Lys Val Tyr His Ala Arg Asn Leu Gln Thr Gly Lys Ser

50 55 60

Thr Ala Met Lys Val Val Gly Lys Glu Lys Val Ile Asn Ala Gly Met

65 70 75 80

Thr Glu Gln Ile Lys Arg Glu Ile Ser Val Met Lys Met Val Lys His

85 90 95

Pro Asn Ile Val Glu Leu His Glu Ile Met Ala Thr Lys Thr Lys Ile

100 105 110

Tyr Phe Ala Met Glu Leu Val Arg Gly Gly Glu Leu Phe Ser Lys Val

115 120 125

Ala Lys Gly Arg Leu Asp Glu Asp Ser Ala Arg Leu Tyr Phe Gln Gln

130 135 140

Leu Val Ser Ala Ile Asp Phe Cys His Ser Arg Gly Val Tyr His Arg

145 150 155 160

Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Asp Glu Asp Gly Asn Leu Lys

165 170 175

Val Ala Asp Phe Gly Leu Ser Ala Phe Ser Glu His Leu Lys Gln Asp

180 185 190

Gly Leu Leu His Thr Ser Cys Gly Thr Pro Ala Phe Val Ala Pro Glu

195 200 205

Val Ile Gly Lys Lys Gly Tyr Asp Gly Ala Lys Val Asp Ile Trp Ser

210 215 220

Cys Gly Val Ile Leu Tyr Val Leu Leu Ala Gly Phe Leu Pro Phe Gln

225 230 235 240

Asp Asp Asn Leu Ile Ala Met Tyr Arg Lys Ile Tyr Arg Gly Asp Phe

245 250 255

Lys Cys Pro Pro Trp Phe Ser Ser Glu Ala Arg Arg Leu Ile Thr Lys

260 265 270

Leu Leu Asp Pro Asn Pro Lys Thr Arg Ile Thr Ile Ser Lys Ile Met

275 280 285

Asn Ser Ser Trp Phe Lys Lys Ser Thr Pro Lys Val Val Lys Leu Lys

290 295 300

Thr Lys Glu Asp Ser Glu Phe Glu His Phe Asn Gly Asp Lys Ser Ser

305 310 315 320

Lys Pro Glu Thr Leu Asn Ala Phe His Ile Ile Ser Leu Ser Asp Gly

325 330 335

Phe Asp Leu Ser Pro Leu Phe Glu Glu Lys Lys Arg Glu Glu Lys Gln

340 345 350

Glu Leu Arg Phe Ala Thr Thr Arg Pro Ala Ser Ser Val Ile Ser Arg

355 360 365

Leu Glu Glu Val Ala Lys Ser Val Lys Phe Ser Val Lys Lys Thr Glu

370 375 380

Ser Arg Val Arg Leu Gln Gly Gln Glu Cys Gly Arg Lys Gly Lys Leu

385 390 395 400

Ala Val Ala Ala Asp Ile Phe Thr Val Thr Pro Ser Phe Leu Val Val

405 410 415

Glu Val Lys Lys Asp Asn Gly Asp Thr Leu Glu Tyr Asn Gln Phe Cys

420 425 430

Ser Lys Glu Leu Arg Pro Ala Leu Lys Asp Ile Val Trp Thr Ser Pro

435 440 445

Ala Glu Lys Ser Thr Leu Ala

450 455

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcactgcca tgaaagtcgt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acttcagggg caacaaaagc 20

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcactgcca tgaaagtcgt tgcaccagcc gggaat 36

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagcatcaga tgggcaaaca aagcaccagt ggtctag 37

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcttttgttg cccctgaagt tgcaccagcc gggaat 36

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agcactgcca tgaaagtcgt gttttagagc tagaaata 38

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aagcatcaga tgggcaaaca aa 22

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttctagctct aaaacgcttt tgttgcccct gaagt 35

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgtgccactc caaagacatc ag 22

<210> 12

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc catggcggat aaagctaaaa a 51

<210> 13

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcactcattc tttgtagcac cag 53

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccactatcct tcgcaagacc ct 22

Claims

1.一种用于敲除GhCIPK6D1基因的方法在提高棉花抗旱性中的应用，其特征在于，所述GhCIPK6D1基因包括以下序列中的至少一种：

1）核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA序列；

2）编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示蛋白质的DNA序列。

2.一种用于敲除GhCIPK6D1基因的sgRNA组合物，其特征在于，包括gRNA1和gRNA2；

所述gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

3.一种用于敲除GhCIPK6D1基因的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体包括权利要求2所述sgRNA组合物。

4.根据权利要求3所述CRISPR/Cas9载体，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体的骨架载体为pRGEB32-7。

5.权利要求3或4所述CRISPR/Cas9载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以pGTR质粒为模板，采用GhCIPK6D1-a/pGREB32-7s引物对进行第一PCR扩增，得到含gRNA1的片段；所述GhCIPK6D1-a的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述pGREB32-7s的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示;

2）以pGTR质粒为模板，采用GhCIPK6D1-2a/GhCIPK6D1-2s引物对进行第二PCR扩增，得到含gRNA2的片段；所述GhCIPK6D1-2a的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述GhCIPK6D1- 2s的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

3）用所述含gRNA1的片段和含gRNA2的片段为模板，用In fpRGEB32-7s/Inf GhCIPK6D1-a引物对进行重叠延伸PCR扩增，得到含gRNA1和gRNA2的DNA片段；所述Inf pRGEB32-7s的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述Inf GhCIPK6D1-a的核苷酸序列如SEQID NO:10所示。