CN109207495A

CN109207495A - 超表达GhCIPK6基因提高植物水分利用效率促进可溶性糖积累

Info

Publication number: CN109207495A
Application number: CN201811090438.8A
Authority: CN
Inventors: 杨细燕; 邓晋武; 何良荣; 张献龙
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-09-18
Filing date: 2018-09-18
Publication date: 2019-01-15
Anticipated expiration: 2038-09-18
Also published as: CN109207495B

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及超表达GhCIPK6基因提高植物水分利用效率促进可溶性糖积累。从棉花中克隆的GhCIPK6基因是CIPK蛋白家族的一个关键成员。GhCIPK6基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。本发明涉及构建该基因的超表达载体pK2GW7.0‑GhCIPK6，通过转化该载体能提高棉花对水分的利用效率，同时能显著提高棉花叶片中可溶性糖的含量。

Description

超表达GhCIPK6基因提高植物水分利用效率促进可溶性糖积累

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及棉花的GhCIPK6基因在提高植物水分利用效率，促进可溶性糖积累中的应用。本发明涉及将棉花中克隆的GhCIPK6构建到超表达载体pKGWFS7.0上，借助农杆菌介导的遗传转化，使棉花显著提高对水分利用的效率，同时使棉花叶片可溶性糖含量显著提升。

背景技术

棉花作为重要的经济作物，转基因技术作为棉花遗传改良快速有效的方法，为棉花遗传育种带来了巨大的发展空间。通过基因工程技术培育的抗虫棉已经成为我国推广最为成功的转基因作物，其有效提高了棉花对鳞翅目害虫特别是棉铃虫的抵抗能力，挽回了重大的经济损失，极大程度降低了农药的使用，在保护环境，降低人畜中毒风险，提高植棉效益等方面发挥着重大作用[1]。

钙离子作为重要的第二信使，广泛参与了植物生长发育和逆境应答的各个方面，其中，CBLs作为植物特有的一类钙感受器，通过激活与之特异互作的蛋白激酶CIPKs从而磷酸化下游靶蛋白，通过调控靶蛋白的活性来实现胞质钙离子的解码和下游响应。CIPK作为一类极具潜力的蛋白激酶家族基因，在各个领域均引起了广泛的研究，众多的研究者分别将不同的家族成员分别利用基因工程的手段转移到不同物种中，均得到了较好的效果，同时也更加完善了这些基因参与的调控机制的解析。

CIPK参与的调控路径的研究主要有调控生长发育及代谢，调控离子转运，调控逆境抗性等方面。Vineeta等通过研究拟南芥及鹰嘴豆CIPK6表明，CIPK6参与了生长素的极性运输及根系的发育[2]，Liming Zhou等研究表明CIPK10,12,14,19均在成熟花粉中高量表达，超表达均能引起花粉管肿胀，CIPK19表型最为明显，CIPK19突变体同样抑制花粉管伸长，出现结节，CIPK19超表达能引起花粉管尖部钙离子积累，破坏钙离子稳态[3]。水稻淹水条件下的萌发，其所需的糖类来源，也是由CIPK来介导参与的，其中，CIPK15通过激活a-淀粉酶来保证了充足的能量供应[4]。

同时，研究表明大量的CIPK参与了离子的转运，主要是阳离子的转运，包括金属及非金属阳离子。其中CIPK调控钠离子的吸收及存储成为离子转运的经典，最为代表性的是SOS途径，SOS3(CBL4)作为钙感受器，结合钙离子后与SOS2(CIPK24)互作，最后通过磷酸化SOS1(钠离子转运蛋白)，将多余的钠离子排出细胞外[5]。同样CIPK还广泛参与钾离子的吸收和低钾耐性，拟南芥中超表达ZmCIPK21抗盐性增强，DREB表达提高，钠含量降底，钾含量升高，能弥补拟南芥AtCIPK1突变体盐敏感表型[6]。同时，CIPK还参与了镁离子的吸收与转运[7]。

在抗逆方面，CIPK均参与了生物及分生物抗性，已有研究表明，CIPK参与了病毒病的抗性，AtCIPK7与病毒TuYV的RT蛋白互作，促进病毒增殖16倍，但只有GFP：CIPK7融合方式有效，但是对另一种病毒BMYV的增殖效益GFP：CIPK7及CIPK7：GFP均有效，促进约2倍[8]。NtCIPK12磷酸化黄瓜花叶病毒聚合酶2a，抑制病毒繁殖[9]。在调控植物度高盐及低钾等胁迫下的抗性反应下，CIPK一样起到了重要作用，TaCIPK29能与TaCBL2/3,NtCBL2/3,NtCAT1互作，提高烟草抗盐，提高钠/钾比及钙离子浓度，提高CAT及POD表达，减低过氧化氢含量。TaCIPK4提高烟草抗盐性，抗冻性，转基因烟草叶绿素及糖增加，CAT活性加强，降低钠含量AtCIPK9与CBL2/3互作，负调控钾稳态，CIPK9及CBL2，CBL3超表达均表现不耐低钾，反之CIPK9及CBL3缺失突变体更耐低钾[10]。AtCIPK23与AtKC1协同调控AtAKT1介导的低钾响应，AtKC1抑制AtAKT1活性，降低钾渗漏，提高低钾耐性[11]。

AtCIPK21与CBL2/CBL3互作，调控拟南芥渗透胁迫和盐胁迫，其中AtCIPK21突变体对盐和PEG更敏感，而CBL2/CBL3突变体没表型，盐胁迫下AtCIPK21与CBL2/CBL3互作引起AtCIPK21定位到液泡膜上[12]。活性氧在多种抗逆中都发挥着重要作用，CIPK也参与了活性氧的调控，其中AtCIPK26与AtRbohF互作，负调控活性氧ROS产生[13]，这与Drerup MM等报道的AtCIPK26与AtCBL1/9互作后磷酸化AtRbohF，提高活性氧ROS[14]有所不一致，说明CIPK调控的复杂性，有待进一步验证。Xiong等通过超表达水稻不同CIPK成员，分别提高了水稻对低温，干旱及盐胁迫的抗性[15]。

棉花GhCIPK6来源于棉花体细胞胚胎再生的表达谱数据库，超表达该基因能提高棉花对水分的利用效率，促进可溶性糖的积累。应用该基因可以为培育节水高产棉花新品种提供理想的途径。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，基于棉花体细胞胚胎再生过程中表达谱数据的挖掘，从中筛选并克隆到一个来源于棉花的GhCIPK6基因，该基因与拟南芥AtCIPK6有一定的同源性而被命名。通过遗传转化棉花后，对转基因植株分析表明，该基因能够显著提高棉花对水分的利用效率，同时促进了可溶性糖的积累，是一个新鉴定到的CIPK家族成员，在改良植物水分利用效率和可溶性糖的积累中具有重要意义。

本发明的技术方案如下所述：

本申请人的研究团队通过早期的研究揭示体细胞胚胎发生过程是植物响应逆境和环境信号的重要过程，在这一过程中有大量逆境响应相关的基因优势表达。基于这一理论，本发明分析了棉花体细胞胚胎发生过程中的表达谱数据，筛选了一系列高量表达的基因，根据相关文献报道，本发明最终选取了GhCIPK6作为重要的候选基因并进行克隆。

对该基因克隆并测序后，将完整的CDS序列与拟南芥数据库进行比对，根据该基因与拟南芥AtCIPK6的同源性将棉花中新鉴定到的这一基因命名为GhCIPK6。通过遗传操作手段，以35S启动子驱动，将该基因借助农杆菌介导的转化手段，在棉花中进行超量表达，通过分子检测筛选到转基因株系，并对转基因株系在水分利用效率和可溶性糖积累等方面进行了鉴定，最终首次确定该基因能够提高棉花对水分的利用效率，同时促进了可溶性糖的大量积累。

本发明具体操作步骤如下：

对体细胞胚胎发生过程中的候选基因GhCIPK6进行RT-PCR验证(图1)，结果证实了该基因在体胚发生过程中高量表达，为克隆和研究该基因提提供了参考。

参考棉花基因组序列，设计带有attB接头的引物对该基因全长进行了PCR扩增，引物序列为：GhCIPK6-S：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGCGGACAAAGCTAAAACC，GhCIPK6-A：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAAGCCACAGTCGAGTTCTC，对克隆产物进行BP重组反应，将GhCIPK6构建到pDONR221质粒上，通过载体上的M13测序引物对克隆片段进行测序，综合多个测序结果及参考序列进行比对，最终确定了GhCIPK6的实际序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，该基因的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所述。

将选取的克隆通过LR重组反应将目的基因GhCIPK6重组到pK2GW7表达载体上，构建完成的载体被命名为pK2GW7-GhCIPK6(载体图谱见图2)。热击转化大肠杆菌TOP10，通过PCR鉴定阳性克隆，扩繁并提取质粒，将质粒通过点击的方法转化到农杆菌菌株EHA105感受态中，将PCR鉴定为阳性的克隆保存备用。

将含有pK2GW7-GhCIPK6质粒的农杆菌EHA105扩繁，然后通过农杆菌介导的遗传转化方法将T-DNA片段转化到棉花下胚轴，通过组织培养获得再生植株，设计引物对再生植株进行PCR鉴定阳性(结果见图3)，提取阳性植株DNA进行Southern杂交鉴定拷贝数(结果见图4)，选取单拷贝阳性植株的RNA并反转录成cDNA，设计qRT-PCR引物进行表达量分析(见图5)。

将选取的GhCIPK6超表达株系及对照种植于转基因试验田和培养室，用于分析水分利用效率和可溶性糖的含量的测定分析等。将不同的转基因株系及对照植株分别种植于含有相同水分的同等质量的营养土中，待萌发后套上塑料膜防止水分从土壤表面蒸发，保持不同株系各10个重复，待植株将土壤水分消耗直至出现萎蔫时将植株地上部分取样，烘干并测量干物质重量，同时测量土壤中水分的消耗量，以单位水分所产生的干物质来计算不同株系的水分利用效率，结果表明超表达GhCIPK6能显著提高棉花对水分的利用效率(图6)。

将不同株系分别种植于条件良好的转基因试验田，选取同一部位的叶片，用液氮迅速冻存，在实验室条件下称取等量叶片，分别进行可溶性糖的提取，将提取液稀释后采用硫酸蒽酮比色法测定不同株系中可溶性糖的含量，结果表明超表达株系可以显著提高正常条件下棉花可溶性糖的含量(结果图7)。

本发明的优点

棉花是重要的经济作物，但是由于棉花与主要粮食作物对土地的竞争使得棉花的主要产区逐渐向干旱和半干旱的新疆等地方发展，水资源的不充分成了制约棉花发展的主要问题。同样，随着全球气候变化导致的干旱问题日益严重，在其它作物中提高水分利用效率也具有重要意义。本发明通过对棉花GhCIPK6的克隆和转基因鉴定，发现GhCIPK6能显著提高水分利用效率，这对缓解水资源不足，提高水分利用效率具有重大帮助。同时，本发明还明确了GhCIPK6能够显著提高棉花可溶性糖的含量，可溶性糖即可以作为重要的能源物质，也对提高植物的非生物逆境抗性具有很大的作用，因此利用该发明，可以改良作物的多种性状，具有广泛的应用价值。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆的GhCIPK6基因的核苷酸序列，其中1-1296bp是该基因的编码区(CDS)。1-1296bp也是该基因对应的氨基酸序列。

序列表SEQ ID NO:2是GhCIPK6基因编码的蛋白质序列。编码431个蛋白质。

图1：GhCIPK6基因在体细胞胚胎发生过程中的表达模式的胶图。附图标记说明：GhCIPK6基因在体细胞胚胎发生的不同时期均具有较高的表达量，样品编号依次为棉花下胚轴诱导0小时，6小时，1天，2天，5天，40天；EC为胚性愈伤组织，GE为球形胚，TE为鱼雷胚，CE为子叶胚时期。

图2：pK2GW7-GhCIPK6超表达质粒载体的图谱。附图标记说明：该载体骨架为pK2GW7，在细菌中的抗性为壮观霉素，转基因植株抗性为卡那霉素，目标基因GhCIPK6由组成型启动子35S驱动。

图3：转基因材料PCR阳性检测结果胶图。附图标记说明：泳道M表示Marker电泳结果(由上到下依次为300，500，800，1000，1500，2000，3000，5000bp)，WT表示野生型受体材料，Null表示阴性分离株系，转基因材料PCR能扩增出对应的条带，野生型及阴性分离株系Null没有条带。PCR扩增正向引物为35S-F：CTGACGTAAGGGATGACGC，反向引物C6-R：CCAATGACTTCCGGCGCCACATA。

图4：转基因材料Southern杂交结果胶图。附图标记说明：泳道M表示Marker电泳结果(由上到下依次为2027，2322，4361，6557，9416，23130bp)，野生型株系没有杂交信号，作为阴性对照，其余转基因株系均为单拷贝。

图5：转基因材料qRT-PCR检测结果胶图。附图标记说明：WT表示野生型受体，Null表示阴性分离株系，Ri16和Ri19为两个干涉株系，OE24和OE35为两个超表达株系。干涉株系能够降低GhCIPK6的表达，超表达株系能够提高GhCIPK6的表达。

图6：转基因材料生长情况及水分利用效率的分析。附图标记说明：图6中的A图为取样前不同株系的生长状态。结果表明，与对照相比，超表达株系OE24和OE35水分消耗相对较少，株高较高，叶片没有严重萎蔫，而对照材料已经明显萎蔫；图6中的B图为水分利用效率的统计分析，超表达株系单位干物质积累下的耗水量显著低于对照，即水分利用效率有了明显的提高。

图7：转基因材料可溶性糖含量分析。附图标记说明：与野生型比较，本发明的超表达株系OE24和OE35极大的促进了植株可溶性糖的含量，分别为野生型植株的3.33和3.39倍，而阴性分离株系Null与野生型植株比较没有显著差异。

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明克隆包含有GhCIPK6基因完整编码区段的DNA片段，以及验证GhCIPK6基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

实施例1 GhCIPK6基因的克隆及表达模式分析

A.RNA的提取及cDNA的获得

取陆地棉品系(YZ1，又称豫早熟棉1号，来自河南省农业科学院经济作物研究所)植株体细胞胚胎发生过程不同时期的样品，采用异硫氰酸胍的方法提取总RNA，cDNA的合成是以2μg总RNA为模版，与1μl 500μg/ml oligo-dT(15)引物(购自Promega公司)，DEPC-water混合，总体积为14μl；然后70℃变性5min冰上骤冷；再加入10μl含有5μl RT buffer，1.25μl 10mM dNTP，1.75μl DEPC-water，1μl Ribonuclease Inhibitor(购自Promega公司，美国)，和1μl SuperscriptⅢ反转录酶(购自Invitrogen公司，美国)的混合液；42℃温浴1h合成第一链；反应结束后70℃处理15min使SuperscriptⅢ反转录酶失活。每份cDNA稀释到200μl后于-20℃保存待用。

B.GhCIPK6基因全长序列的获得

将A步骤中的cDNA样品进行表达谱测序分析，找到了高量表达的序列，其将注释为CIPK家族成员。根据注释从陆地棉基因组数据库中提取该基因序列(Gh_D06G1020)，设计扩增该基因的引物序列，具体如下：

GhCIPK6-S：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGCGGACAAAGCTAAA ACC，

GhCIPK6-A：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAAGCCACAGTCGAGT；

以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30sec，57℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。PCR产物经BP反应连接至pDONR^TM221载体上(BP酶购自Invitrogen公司，美国；室温下反应4小时，pDONR^TM221载体来源于CSIROPlantIndustry，澳大利亚)后转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，10-12小时后挑取单克隆进行PCR阳性检测，将阳性克隆测序验证后确定其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。

C.GhCIPK6基因的表达模式分析

以A步骤中获得的cDNA为模板，采用引物：GhCIPK6-RT-S：TGGTGGTGGAAGTTAAAAAGGAC和GhCIPK6-RT-A：AATCAAGCCACAGTCGAGTTCTC。同时采用引物GhUb7-S：GAAGGCATTCCACCTGACCAAC和GhUb7-A：CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG作为内参引物进行相对定量分析。结果表明：GhCIPK6基因在体细胞胚胎发生的不同时期均能高量表达(图1)。

实施例2：GhCIPK6基因超量表达载体的构建

A.超量表达载体的构建

将克隆到pDONR^TM221上的GhCIPK6用LR反应(Invitrogen)将其重组至植物表达载体pK2GW7.0(其中：LR酶购自Invitrogen公司，美国；室温下反应4小时，载体构建图谱见图2；中间载体pK2GW7.0来自比利时根特大学)，用反应产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10。10-12小时后挑取单克隆进行PCR阳性检测，引物选用35S-S：CCACTATCCTTCGCAAGACCCT和GhCIPK6-RT-A：AATCAAGCCACAGTCGAGTTCTC，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。阳性单克隆扩繁并提取质粒，即获得用于转化的超表达质粒pK2GW7.0-GhCIPK6。

B.利用载体转化农杆菌

将构建的pK2GW7.0-GhCIPK6载体转化农杆菌菌株EHA105，挑取单克隆菌落接于含100mg/L壮观霉素的LB液体培养基中于150rpm，28℃摇24h，分别用特异引物对菌液进行阳性检测(所述的引物序列见实施例2)，阳性菌液用20％甘油于-70℃下保存。

实施例3 GhCIPK6基因的遗传转化及筛选鉴定

A.农杆菌介导的遗传转化

供试材料为陆地棉品系(YZ1),选择饱满一致YZ1种子，剥去种皮，用0.1％升汞溶液杀菌10-12min，期间不断摇动，再用无菌水冲洗种子3次，将种子置于MS培养基表面。30℃暗培养1天后扶苗，继续暗培养4-5天。

从超低温冰箱内取出保存的含有目标基因(即本发明克隆的GhCIPK6基因)的EHA105菌株的甘油管在冰上融化，接10μl于2ml含100mg/L壮观霉素的LB液体中，28℃震荡培养1天，活化好的菌液接20ul于15-20ml含100mg/L壮观霉素的新鲜液体LB中，于28℃震荡培养过夜，吸取1ml浑浊菌液于2ml无菌离心管，8000-10000rpm离心30s收集菌体，用20ml含50mg/L乙酰丁香酮(AS)的MGL培养基(具体成分见后描述)重新悬浮菌体，28℃振荡培养30-40min，用于侵染下胚轴。

农杆菌介导的棉花下胚轴的转化具体步骤如下：

(1)在超净工作台中，取30株无菌苗，在无菌滤纸上将下胚轴切成0.5-0.8cm小段接入50ml无菌锥形瓶，加入活化好的含有目标载体pK2GW7.0-GhCIPK6的EHA105农杆菌菌液中，侵染10min，期间摇动数次；

(2)倒去菌液，将下胚轴置于无菌滤纸上吸干表面菌液，置于超净工作台吹10-15min后接入不含抗生素的2，4-D诱导培养基(具体成分见后面描述)上，在19℃黑暗条件下共培养48-60h；

(3)共培养结束后将下胚轴切段接入含卡那霉素(100mg/L)和头孢霉素(100mg/L)的2，4D的诱导培养基(具体成分见后面描述)，在28℃弱光下培养；

(4)3周后转入含抗生素吲哚丁酸(IBA)诱导培养基(具体成分见后面描述)连续继代至出现胚性愈伤组织；

(5)将胚性愈伤组织陆续接入胚分化培养基(具体成分见后面描述)继代至体细胞胚成熟，将成熟的子叶胚接入生根培养基(具体成分见后面描述)上萌发，直至获得完整植株。

本实施例中所用的培养配方：

MGL培养基：胰蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，MgSO₄﹒7H₂O 0.1g/L，KH₂PO₄ 0.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1g/L，用蒸馏水补充至1L。

2，4-D诱导培养基：以MS为基础培养基，添加2,4-D 0.1mg/L，细胞激动素(KT)0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L。调pH至5.9。

IBA诱导培养基：以MS为基础培养基，添加IBA0.5mg/L，KT 0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L。调pH至5.9。

胚分化培养基：以MS为基础培养基，添加1.9g/L KNO₃，KT 0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Gln 1.0g/L，Asn 0.5g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L。调pH至5.9。

生根培养基：以1/2MS为基础培养基，添加葡萄糖15g/L，Phytagel 2.5g/L，用蒸馏水补充至1L。调pH为5.9。

上述培养基配方中所述的基础MS培养基配方为:大量元素(KNO₃ 1.9g/L，NH₄NO₃1.65g/L，KH₂PO₄0.17g/L，MgSO₄﹒7H₂O 0.37g/L，CaCl₂﹒2H₂O 0.44g/L)，微量元素(KI0.83mg/L，H₃BO₃ 6.2mg/LMnSO₄﹒4H₂O 22.3mg/L，ZnSO_4﹒7H₂O 8.6mg/L，Na₂MoO₄﹒2H₂O0.25mg/L，CuSO₄﹒5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂ 0.025mg/L)，铁盐(Na₂﹒EDTA 37.3mg/L，FeSO₄ ﹒7H₂0 27.8mg/L)，有机成分(肌醇100mg/L，Gly 2mg/L，VB₁ 0.1mg/L，VB₆ 0.5mg/L，VB₅0.5mg/L)。

B.转基因植株的鉴定

(1)转基因植株阳性检测及纯系检测

提取转基因植株幼嫩叶片的基因组DNA，DNA抽提采用天根生化(北京)科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取(具体操作步骤见该试剂盒的说明书)，以35s启动子正向引物35S-S：CCACTATCCTTCGCAAGACCCT和目的基因反向引物GhCIPK6-RT-A：AATCAAGCCACAGTCGAGTTCTC进行PCR检测是否有相应T-DNA插入。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28个循环；72℃延伸5min。

将收取的T₁代的种子剥去种皮，用0.1％升汞溶液杀菌10-12min，期间不断摇动，用无菌水冲洗3次，将种子置于棉花无菌苗培养基(含100mg/L卡那霉素)表面。30℃暗培养1天后扶苗，转移至光照室(光照强度为3000Lux，15h光照/9h黑暗)培养，5-6天观察是否有抗性分离(若有长侧根的转基因植株鉴定为阳性转基因植株)。之后每一代单株保留自交种进行筛选直至不发生抗性分离的即为转基因纯系，用作下一步表型分析和功能鉴定。

(2)转基因植株的拷贝数检测：

棉花基因组DNA的提取：

1)称取0.1-0.2g转基因棉花植株的幼嫩叶片，加入200uL DNA抽提缓冲液，磨样机打60s频率60Hz，磨匀后补加600uL DNA抽提缓冲液立即混匀，离心5min(室温，11000rpm)。

2)弃上清，加入GP1，即DNA抽提试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司产品)700uL，混匀。65℃水浴40min，中间每隔几分钟颠倒混匀一次，离心8min(室温，11000rpm)。

3)取上清加入到新的离心管中，加酚氯仿800uL，轻摇20min，离心8min(室温，12000rpm)。

4)取上清，加入800uL氯仿，轻摇15min，离心8min(室温，12000rpm)。

5)将上一步所得上层水相转入新的离心管中，加入700uL的GP2，充分混匀。

6)将混匀的液体转入吸附柱CB3中(可分多次加入)，12000rpm离心30sec，弃掉废液。

7)向吸附柱CB3中加入500uL的缓冲液GD(DNA抽提试剂盒自带，天根生化科技(北京)有限公司)，12000rpm离心30sec，弃掉废液。

8)向吸附柱CB3中加入600uL的PW(使用前检查是否加无水乙醇)，12000rpm离心30sec，弃掉废液。再重复一遍。然后空离心2min；将吸附柱置于室温晾干。

9)将吸附柱CB3转移到新的1.5mL的离心管中，向吸附膜中间部位加入60uL洗脱液TE,室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将DNA收集到离心管中。

DNA酶切及电泳分离DNA

1)在200μl微量离心管中加入15-20μg DNA样品，80U限制性内切酶(HindIII-HF)，8μl相应的CutSmart Buffer，在旋涡器上混匀并稍微离心后放于37℃酶切72h。

2)于DYY-Ⅲ34A型电泳槽中制备0.8％的0.5×TBE琼脂糖凝胶；向每个样品中加入2μl上样缓冲液，混匀后稍微离心后点样；在0.5×TBE电泳缓冲液中250V高压电泳10分钟，再在40V电泳12～14h。

DNA变性及转膜

1)切胶：停止电泳，拿出胶板，上端切去点样孔，两边距点样孔0.5cm左右，下端沿溴酚蓝处边缘切开，切左上角以示方位。

2)变性：酸变性15min，碱变性20min，变性期间不时的温和晃动胶块。

3)搭盐桥：一块洗净的20×30cm瓷盘，倒入碱转液，把干净玻璃板横放于盘上，调平衡后用碱转液湿润玻璃板，把搭盐桥的滤纸平整地铺在玻板上，使纸的两端自然下垂到盘中，用玻棒赶尽玻板与纸之间的气包后，再按同样的方法铺上第二层滤纸，将胶的正面朝上放于滤纸中央，赶尽气泡，用X光片条将胶的四周约0.5cm宽处与滤纸隔开，使碱转液必须经过凝胶进入吸水纸，以保证胶中的DNA充分转移到尼龙膜上。取与胶块等大的尼龙膜准确放于胶上，赶尽气泡，在尼龙膜上放两张等大的滤纸，再放约10cm厚的吸水纸，再放一个玻璃板及约500g的重物，调水平，印记18-24h。

4)将转好的尼龙膜用2×SSC浸泡15min，重复一次，捞出后用滤纸吸干水分，再用干净的滤纸包好，于80℃烘干2h后用保鲜膜包好放在-20℃保存。

Southern杂交

1)预杂交：将预杂交的尼龙膜用2×SSC浸泡15-30min，取出尼龙膜装入杂交管中，赶尽气泡，在杂交管中加入25ml预杂交液，并于42℃预杂交，保持低速转动，几分钟后检查是否漏液。若不漏加入320ul/403ul鲑鱼精。

2)杂交：吸取500ul杂交管中的杂交液于一新离心管中，加入探针，在98℃变性5分钟后，立即置于冰上3min。将变性好的探针加入杂交管中,充分混匀，42℃杂交10～12h。

3)洗膜：2×SSC+0.1％SDS于室温洗2次，每次15min；0.1×SSC+0.1％SDS于68℃洗3次，前2次15min，第3次10min；Washing Buffer洗1次，2～3min；马来酸缓冲液洗1次，2～3min；用马来酸缓冲液将10×Blocking Solution稀释成1×Blocking Solution，取其中80ml用来封阻背景，常温轻摇1h后弃掉溶液；试剂盒中4号管(Anti-AP)，用前12000rmp，离心5min，取2ul加入20ml的1×Blocking Solution，将配好的Blocking Solution加入杂交管中，37℃杂交炉轻摇40min，之后取出尼龙膜，在瓷盘中用500ml的Washing Buffer清洗3次，每次15min。

压膜及显影

1)将尼龙膜用检测缓冲液漂洗，室温3～5分钟。

2)压膜：将足够大的自封袋剪开，平铺于桌面，吸取800ul的CSPD均匀地滴在塑料袋上，取出尼龙膜将DNA面朝下，置于自封袋上，压好膜，用封口机封口，防止气泡的产生。室温孵育10min后将膜置于37℃孵育5-10min，以增强化学发光反应。

3)压磷屏：将膜的DNA面朝上放置于磷屏中，放入1张X光片，盖好磷屏，曝光10～20min。

4)显影：将X光片浸入显影液中，反复几次后，用水冲洗干净X光片，浸入定影液中5min，冲洗干净即可。

转基因株系拷贝数鉴定结果见图3。

(3)转基因植株表达量检测

取T3代转基因棉花植株主茎倒一叶提取RNA，RNA的抽提用常规异硫氰酸胍法。cDNA的合成是以2μg总RNA为模版，与1μl 500μg/ml oligo-dT(15)引物(购自Promega公司)，DEPC-water混合，总体积为14μl；然后70℃变性5min冰上骤冷；再加入10μl含有5μl RTbuffer，1.25μl 10mM dNTP，1.75μl DEPC-water，1μl Ribonuclease Inhibitor(购自Promega公司，美国)，和1μl SuperscriptⅢ反转录酶(购自Invitrogen公司，美国)的混合液；42℃温浴1h合成第一链；反应结束后70℃处理15min使SuperscriptⅢ反转录酶失活。每份cDNA稀释到200μl后于-20℃保存待用。以上述反转录合成的cDNA为模板，用实施例1中的引物进行特异PCR扩增，棉花GhUb7(GenBank登陆号：DQ116441)基因作为内参对照进行相对定量分析。

结果表明：本发明克隆的GhCIPK6基因在两个株系中高量表达。后续的功能验证研究中选取具有高量表达的株系系OE24及OE35进行进一步分析(见图5)。

实施例4：利用转基因棉花对GhCIPK6基因进行功能验证

具体步骤如下：

A.GhCIPK6超表达株系水分利用效率鉴定

将以上实施例制备得到的转基因纯系材料OE24、OE35及阴性对照(Null)和野生型材料(WT)四个株系的种子进行筛选，挑取健康饱满的种子各30粒在28度培养箱中进行催芽，待胚根长出至2cm左右时移栽到营养土中，每个株系10钵，每钵播种两粒正常萌发的种子，放入28℃培养箱中进行萌发。营养土准备：将有机质和蛭石适量比例混匀，每小钵称取220g，浇足量的营养液(常规)，最终保证每钵营养土重450g，充分吸水后的营养土用于萌发。待幼苗出土至子叶平展后，每钵保留一株健康的幼苗，另外一株拔去。将保鲜袋套在营养钵表面并封口防止水分蒸发，幼苗继续生长直到水分消耗完毕，植株开始出现萎蔫时统一取样，称取营养土的重量确定水分的消耗量，将取的地上部分样品至于80℃烘箱中烘干至衡重，称量干重。通过计算单位干物质的耗水量来评估水分利用效率，最终结果使用EXCEL软件进行统计分析和差异显著性检测，结果见图6，超表达株系的水分利用效率显著高于野生型及阴性对照，单位干物质耗水量较野生型植株比，OE24和OE35分别减少了14.6％和13.5％。

B.GhCIPK6超表达株系可溶性糖含量测定

将转基因纯系材料OE24、OE35及阴性对照(Null)和野生型材料(WT)四个株系的材料种植于转基因试验田，每个株系各20株，待植株生长至开花期时，分别选取向光侧同一部位的叶片，每个株系4个生物学重复，样品取完后迅速放入液氮中冻存。在实验室条件下用液氮将样品研磨后每份样品称取0.1g，加入1ml蒸馏水，置于水浴锅中80℃下水浴提取30min，期间混匀数次。

将提取好的样品取出冷却至室温，离心后取上清，将上清稀释10倍，以葡萄糖配置梯度标准溶液，将标准溶液和样品稀释液各取100ul，加入硫酸蒽酮溶液(100ml98％硫酸溶液中加入0.2蒽酮)200ul，混匀后将样品至于90℃水浴10min，水浴完成后取200ul加入酶标板中，用酶标仪检测630nm下的吸光值，根据标准曲线换算出可溶性糖含量，数据结果使用EXCEL软件进行统计分析和差异显著性检测，结果见图7。与野生型及Null比较，超表达GhCIPK6可以显著提高可溶性糖的含量，较野生型相比，OE24和OE25株系的可溶性糖的含量分别为野生型植株的3.33倍和3.39倍。

主要参考文献

1.郭三堆等，中国转基因棉花研发应用二十年.中国农业科学2015(17):3372-3387；

2.Tripathi V,Parasuraman B,Laxmi A,Chattopadhyay D:CIPK6,a CBL-interacting protein kinase is required for development and salt tolerance inplants.The Plant journal:for cell and molecular biology 2009,58(5):778-790；

3.Zhou L,Lan W,Chen B,Fang W,Luan S:A calcium sensor-regulatedprotein kinase,CALCINEURIN B-LIKE PROTEIN-INTERACTING PROTEIN KINASE19,isrequired for pollen tube growth and polarity.Plant physiology 2015,167(4):1351-1360.

4.LEE KW,Chen PW,YU SM:Metabolic adaptation to sugar/O2 deficiencyfor anaerobic germination and seedling growth in rice.Plant,cell&environment2014,37(10):2234-2244；

5.Bertorello AM,Zhu JK:SIK1/SOS2 networks:decoding sodium signals viacalcium-responsive protein kinase pathways.Pflugers Archiv:European journalof physiology 2009,458(3):613-619；

6.Chen X,Huang Q,Zhang F,Wang B,Wang J,Zheng J:ZmCIPK21,a maize CBL-interacting kinase,enhances salt stress tolerance in Arabidopsisthaliana.International journal of molecular sciences 2014,15(8):14819-14834；

7.Mogami J,Fujita Y,Yoshida T,Tsukiori Y,Nakagami H,Nomura Y,FujiwaraT,Nishida S,Yanagisawa S,Ishida T et al:Two Distinct Families of ProteinKinases Are Required for Plant Growth under High External Mg2+Concentrationsin Arabidopsis.Plant physiology 2015,167(3):1039-1057；

8.Rodriguez-Medina C,Boissinot S,Chapuis S,Gereige D,Rastegar M,Erdinger M,Revers F,Ziegler-Graff V,Brault V:A protein kinase binds the C-terminal domain of the readthrough protein of Turnip yellows virus andregulates virus accumulation.Virology 2015,486:44-53；

9.Kang HK,Yang SH,Lee YP,Park YI,Kim SH:A tobacco CBL-interactingprotein kinase homolog is involved in phosphorylation of the N-terminaldomain of the cucumber mosaic virus polymerase 2a protein.Bioscience,biotechnology,and biochemistry 2012,76(11):2101-2106；

10.Liu LL,Ren HM,Chen LQ,Wang Y,Wu WH:A protein kinase,calcineurin B-like protein-interacting protein Kinase9,interacts with calcium sensorcalcineurin B-like Protein3 and regulates potassium homeostasis under low-potassium stress in Arabidopsis.Plant physiology 2013,161(1):266-277；

11.Wang XP,Chen LM,Liu WX,Shen L,Wang FL,Zhou Y,Zhang Z,Wu WH,Wang Y:AtKC1 and CIPK23synergistically modulate AKT1-mediated low potassium stressresponses in Arabidopsis.Plant physiology 2016；

12.Pandey GK,Kanwar P,Singh A,Steinhorst L,Pandey A,Yadav AK,Tokas I,Sanyal SK,Kim BG,Lee SC et al:Calcineurin B-Like Protein-Interacting ProteinKinase CIPK21 Regulates Osmotic and Salt Stress Responses inArabidopsis.Plant physiology 2015,169(1):780-792；

13.Kimura S,Kawarazaki T,Nibori H,Michikawa M,Imai A,Kaya H,KuchitsuK:The CBL-interacting protein kinase CIPK26 is a novel interactor ofArabidopsis NADPH oxidase AtRbohF that negatively modulates its ROS-producingactivity in a heterologous expression system.Journal of Biochemistry 2012,153(2):191-195；

14.Drerup MM,Schlucking K,Hashimoto K,Manishankar P,Steinhorst L,Kuchitsu K,Kudla J:The Calcineurin B-like calcium sensors CBL1 and CBL9together with their interacting protein kinase CIPK26 regulate theArabidopsis NADPH oxidase RBOHF.Molecular plant 2013,6(2):559-569；

15.Xiang Y,Huang Y,Xiong L:Characterization of stress-responsive CIPKgenes in rice for stress tolerance improvement.Plant physiology 2007,144(3):1416-1428。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 超表达GhCIPK6基因提高植物水分利用效率促进可溶性糖积累

<141> 2018-09-10

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1296

<212> DNA

<213> 棉花(Gossypium hirsutum)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1296)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1296)

<400> 1

atg gcg gac aaa gct aaa acc gaa aac cca tct tta ctc cat gga aaa 48

Met Ala Asp Lys Ala Lys Thr Glu Asn Pro Ser Leu Leu His Gly Lys

1 5 10 15

tac gag ctt ggc cgt atg ttg ggt cat gga acc ttc gcc aaa gtc tac 96

Tyr Glu Leu Gly Arg Met Leu Gly His Gly Thr Phe Ala Lys Val Tyr

20 25 30

cat gcg aag aac ctt caa aca ggg aag aat gtc gcc atg aaa gtg gtg 144

His Ala Lys Asn Leu Gln Thr Gly Lys Asn Val Ala Met Lys Val Val

35 40 45

ggc aaa gag aaa gtg atc caa gtc ggg atg atg gag cag atc aag cga 192

Gly Lys Glu Lys Val Ile Gln Val Gly Met Met Glu Gln Ile Lys Arg

50 55 60

gag atc tcc gtc atg aaa atg gtg aaa cac ccc aac atc gtc gag ctg 240

Glu Ile Ser Val Met Lys Met Val Lys His Pro Asn Ile Val Glu Leu

65 70 75 80

cac gaa gtg atg gcg agc aag tcc aag att tac ttc gcc atg gag ctc 288

His Glu Val Met Ala Ser Lys Ser Lys Ile Tyr Phe Ala Met Glu Leu

85 90 95

gtc cgc ggc ggc gag ctc ttc tcg aaa atc gcc aaa ggt cgt ctc aag 336

Val Arg Gly Gly Glu Leu Phe Ser Lys Ile Ala Lys Gly Arg Leu Lys

100 105 110

gaa gac gct gcc agg gtt tac ttc cag cag ctc gtt tcc gcc gtc gat 384

Glu Asp Ala Ala Arg Val Tyr Phe Gln Gln Leu Val Ser Ala Val Asp

115 120 125

ttc tgc cac agc cgc ggc gtt tac cac cgt gat ttg aag ccg gag aat 432

Phe Cys His Ser Arg Gly Val Tyr His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn

130 135 140

ctt ctc tta gac gaa gaa ggc aac ttg aag gtc acc gat ttc gga ctc 480

Leu Leu Leu Asp Glu Glu Gly Asn Leu Lys Val Thr Asp Phe Gly Leu

145 150 155 160

agc gct ttc acg gaa cat ttg aaa caa gac ggg ttg ttg cac acg act 528

Ser Ala Phe Thr Glu His Leu Lys Gln Asp Gly Leu Leu His Thr Thr

165 170 175

tgc gga acg ccg gcg tat gtg gcg ccg gaa gtc att gga aaa aaa ggg 576

Cys Gly Thr Pro Ala Tyr Val Ala Pro Glu Val Ile Gly Lys Lys Gly

180 185 190

tac gac gga gcc aag gcg gat att tgg tct tgt ggg gtg att tta tac 624

Tyr Asp Gly Ala Lys Ala Asp Ile Trp Ser Cys Gly Val Ile Leu Tyr

195 200 205

gtt ctt ctc gcc ggg ttt tta ccg ttt caa gat gat aac ttg gtg gcg 672

Val Leu Leu Ala Gly Phe Leu Pro Phe Gln Asp Asp Asn Leu Val Ala

210 215 220

atg tat aag aag att tac aga gga gat ttc aag tgt ccg cca tgg ttc 720

Met Tyr Lys Lys Ile Tyr Arg Gly Asp Phe Lys Cys Pro Pro Trp Phe

225 230 235 240

tca cct gaa gct cgg agg cta ata tcc aag ctt tta gac ccg aac ccg 768

Ser Pro Glu Ala Arg Arg Leu Ile Ser Lys Leu Leu Asp Pro Asn Pro

245 250 255

aaa acc cga atc gcc atc tcc aag atc acg gaa tca tct tgg ttc aaa 816

Lys Thr Arg Ile Ala Ile Ser Lys Ile Thr Glu Ser Ser Trp Phe Lys

260 265 270

aaa tca atc ccc aag act aaa aca act aag gaa gaa ata gaa ttc gaa 864

Lys Ser Ile Pro Lys Thr Lys Thr Thr Lys Glu Glu Ile Glu Phe Glu

275 280 285

gca ttc aat gga gag aaa tct tct aaa ccc gag acc tta aac gca ttc 912

Ala Phe Asn Gly Glu Lys Ser Ser Lys Pro Glu Thr Leu Asn Ala Phe

290 295 300

cac ata att tca ttg tcg gaa ggc ttc gat tta tct ccg ttg ttc gaa 960

His Ile Ile Ser Leu Ser Glu Gly Phe Asp Leu Ser Pro Leu Phe Glu

305 310 315 320

gag aaa aag agg gaa gag aaa gag gag ttg agg ttc gcc acg acg agg 1008

Glu Lys Lys Arg Glu Glu Lys Glu Glu Leu Arg Phe Ala Thr Thr Arg

325 330 335

ccg gca agc agc gtg ata tcg agg ctc gaa gag gtg gcc aaa tcg ggg 1056

Pro Ala Ser Ser Val Ile Ser Arg Leu Glu Glu Val Ala Lys Ser Gly

340 345 350

aag ttc agc gtc aaa aag agc gag tgt aag gtg agg ttg cag ggt caa 1104

Lys Phe Ser Val Lys Lys Ser Glu Cys Lys Val Arg Leu Gln Gly Gln

355 360 365

gaa tgt ggg agg aaa ggt aaa ctt gcc att gct gcc gat ata ttt gcg 1152

Glu Cys Gly Arg Lys Gly Lys Leu Ala Ile Ala Ala Asp Ile Phe Ala

370 375 380

gtg acg ccg tcg ttc ttg gtg gtg gaa gtt aaa aag gac cat ggc gac 1200

Val Thr Pro Ser Phe Leu Val Val Glu Val Lys Lys Asp His Gly Asp

385 390 395 400

aca ttc gag tac aat cag ttt tgc agt aaa gag ctc cgg ccg gcg ctt 1248

Thr Phe Glu Tyr Asn Gln Phe Cys Ser Lys Glu Leu Arg Pro Ala Leu

405 410 415

aaa gac atc cta tgg acg tcg ccg ccc gag aac tcg act gtg gct tga 1296

Lys Asp Ile Leu Trp Thr Ser Pro Pro Glu Asn Ser Thr Val Ala

420 425 430

<210> 2

<211> 431

<212> PRT