CN109234289B - 一种创制抗逆转基因苜蓿的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种创制抗逆转基因苜蓿的方法，在P3300植物表达载体的基础上，构建P3300‑NHX‑CAX植物表达载体，并获得相应的农杆菌转化子，利用双基因/单质粒/单农杆菌共转化的方式，能够获得CAX基因和NHX基因同时表达的转基因苜蓿阳性植株，转化效率为15％；最终获得同时含有CAX基因和NHX基因的转基因苜蓿阳性植株318株，并且目的基因可以在RNA水平上表达，创制抗旱性耐盐性显著增强的转基因苜蓿新种质。为通过多基因聚合转化抗逆基因改良农作物和牧草抗逆性的应用提供有力的理论基础，这对于提高我国农作物和牧草的产量，增加农牧民收入，缓解水资源危机，改良和利用大面积盐碱荒地，促进农牧业生产，保障粮食丰产，具有重大的现实意义。

Description

一种创制抗逆转基因苜蓿的方法
技术领域
本发明属于紫花苜蓿转基因研究技术领域，尤其涉及一种紫花苜蓿抗逆多基因聚合转化方法。
背景技术
松嫩平原是世界三大苏打盐碱地集中分布区之一，面积达239万公顷，其中吉林省有66.70万公顷的盐碱地急需治理。干旱和盐碱化已成为制约作物产量的主要环境因子。特别在吉林省西部地区，受全球气候变化影响和人类生产活动的干扰，土壤干旱和盐碱化已对大多数农作物和牧草的生长构成了现实威胁，严重影响了当地的可持续发展，因此，培育既耐盐碱又抗旱的优良植物品种是干旱半干旱地区农牧业生产和生态环境治理中亟待解决的重要问题。紫花苜蓿(Medicagosativa)作为一种优良的草本植物和饲料作物，具有产量高、品质优良、改良土壤、美化环境等诸多功能，在我国农牧业生产和生态建设中发挥着极其重要的作用。但是，紫花苜蓿通常种植在低盐或非盐渍化土壤中，对盐分比较敏感，其生理耐旱能力也不强，耗水量较大，所以，如何提高紫花苜蓿的抗逆性迫在眉睫。
碱茅属植物(Puccinellia)是生长于盐渍化沼泽地上的一类抗寒、抗旱、耐盐碱多年生禾本科牧草，在漫长进化过程中形成了极强的抗盐碱能力，被誉为盐碱地的先锋植物。
苜蓿抗逆转基因研究虽然已经取得一些进展，但还存在着许多有待解决的问题。目前已获得的许多耐盐转基因苜蓿新材料，大多数还停留在实验室阶段，没有进入生产应用。这主要是由于外源基因的转化频率低、重复性差、随机性大。因此，如何提高转化效率，建立高效智能的转化系统仍然是一个难题。其次，真正获得遗传稳定的转基因植株以及培育真正耐盐碱的转基因苜蓿新品系，是苜蓿抗逆基因工程研究的最终目的。随着植物抗逆基因工程研究的深入，越来越多的功能基因被导入苜蓿中而获得高抗逆性的苜蓿材料，但随着植物抗逆生理机制的进一步研究，发现抗逆性是数量性状并且由多基因控制，其分子机制存在一定的复杂性，而目前苜蓿抗逆转基因研究大都是转入控制单个性状的单基因。因此，应加大紫花苜蓿多基因聚合转化的研究和优良功能基因的发掘。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明将碱茅中分离克隆到的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(NHX)和Ca2+/H+转运蛋白基因(CAX)，通过多基因聚合途径转化紫花苜蓿，最终获得抗旱、耐盐碱能力显著提高的转基因苜蓿新种质。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种创制抗逆转基因苜蓿的方法，包括以下步骤：
(1)碱茅CAX基因和NHX基因克隆
使用Omega公司试剂盒，提取吉农朝鲜碱茅的总RNA，采用反转录RT-PCR结合RACE的方法，克隆CAX基因，具体操作为：
A：将碱茅种子用蒸馏水清洗消毒后，置于一次性无菌培养皿中，放入人工气候箱，15℃恒温暗培养。一周后，将幼苗移栽至沙培介质中，每盆6株，于20℃/15℃(昼/夜)温室中正常生长，待其株高长至约10cm时，用1.5％NaCI溶液预处理，备用。参照北京天根生化公司的TRNzol试剂说明书逐步提取朝鲜碱茅叶片的总RNA，采用1.0％甲醛变性凝胶电检测其质量和浓度。以总RNA为模板，根据试剂盒的操作程序逆转录合成cDNA第一链。
B：通过NCBI检索，根据CAX基因编码区序列设计一对引物P1(5-ATGATGGAGTCGGCGGAGAAT-3)和P2(5-CCTAAATCAAGTGACAACGAATGA-3)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，以反转录合成的cDNA单链为模板，进行PCR扩增，反应体系为：DNAtemplate 1μL，P1 1μL，P2 1μL，ddH2O 10μL，PCR-Mix 12μL；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1：30min，30个循环，16℃冷却4min。经琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，与pMD18-T Vector连接过夜，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，测序。
分离克隆得到CAX基因的cDNA序列，全长1299bp，是一个完整开放阅读框，编码含432个氨基酸的蛋白，其蛋白质分子量为：47.39kDa，等电点：4.69，并登陆Genebank：JN172916，命名为PuCAX。
扩增出NHX基因的cDNA序列的方法：
A：将碱茅种子用蒸馏水清洗消毒后，置于一次性无菌培养皿中，放入人工气候箱，15℃恒温暗培养。一周后，将幼苗移栽至沙培介质中，每盆6株，于20℃/15℃(昼/夜)温室中正常生长，待其株高长至约10cm时，用1.5％NaCI溶液预处理，备用。参照北京天根生化公司的TRNzol试剂说明书逐步提取朝鲜碱茅叶片的总RNA，采用1.0％甲醛变性凝胶电检测其质量和浓度。以总RNA为模板，根据试剂盒的操作程序逆转录合成cDNA第一链。
B：通过NCBI检索，根据已发表的NHX基因编码区序列设计一对引物P3(5-ATGGCCACCGCCGACCCAAACCGC-3)和P4(5-TCACTGGCCTTGGAGGAAGGACCT-3)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以反转录合成的cDNA单链为模板，进行PCR扩增，反应体系为：DNA template 1μL，P3 1μL，P4 1μL，ddH2O 10μL，PCR-Mix 12μL；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2：10min，30个循环，16℃冷却4min。经琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，与pMD18-T Vector连接过夜，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，测序；
扩增出NHX基因的cDNA序列，全长2397bp，是一个完整开放阅读框，编码含799个氨基酸的蛋白，其蛋白质分子量为：79.32kDa，等电点：6.37，命名为PuNHX。
(2)表达载体构建以及对紫花苜蓿的聚合转化
以P3300载体为原始载体，采用Gateway技术，构建NHX和CAX基因双价植物表达载体P3300-NHX-CAX，冻融法转化农杆菌，构成双基因/单质粒/单农杆菌聚合转化方式，利用农杆菌介导的遗传转化体系，将NHX和CAX基因同时导入公农5号紫花苜蓿，用草丁膦筛选抗性植株；用PCR法鉴定转基因植株，用半定量RT-PCR法测外源基因在转基因植物中的表达。
具体地，上述利用农杆菌介导的遗传转化体系的具体操作为：采用基于λ噬菌体位点特异重组系统的Gateway技术构建NHX和CAX基因双价植物表达载体P3300-NHX-CAX；根据Invitrogen公司Gateway多克隆试剂盒说明书设计attB接头的上下游引物，采用高保真Prime STARTMHS DNA Polymerase聚合酶扩增NHX和CAX基因的开放阅读框，回收PCR产物并进行BP反应，分别连接入门载体pDONRTM221P1-P5r和pDONRTM221P5-P2；将获得的入门载体与表达载体p3300进行LR反应，获得双价植物表达载体P3300-NHX-CAX，最后测序确保双价载体严格符合要求，冻融法转化农杆菌，选取饱满有光泽的紫花苜蓿种子，依次用75％的酒精表面灭菌30s，0.1％的升汞浸泡震荡灭菌8-10min，无菌水冲洗5遍，然后播种到MS培养基中，7d后以子叶为外植体，经过预培养，用含有目的载体的农杆菌菌液侵染，在愈伤诱导培养基上共培养，然后移入含有头孢霉素的愈伤组织诱导培养基上，14d后继代培养2次，待长出胚状体后，将愈伤组织转移至分化培养基上，30d后将幼苗移至生根培养中，待幼苗长大后移栽室外。
具体地，上述愈伤组织诱导培养基的组成为：MS培养基中含有2mg/L的二氯苯氧乙酸、0.25mg/L的激动素、2g/L水解酪蛋白、2mg/L的草铵膦，分化培养基的组成为：MS培养基中含有1.5mg/L激动素、2mg/L的草铵膦。
由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：
本发明在P3300植物表达载体的基础上，成功构建了P3300-NHX-CAX植物表达载体，酶切反应也进一步验证了目标载体的正确性，同时PCR鉴定结果表明，获得了载体相对应的农杆菌转化子；再通过农杆菌介导法，对公农5号紫花苜蓿进行遗传转化，经PCR鉴定与数理统计分析，利用双基因/单质粒/单农杆菌共转化的方式，能够获得CAX基因和NHX基因同时表达的转基因苜蓿阳性植株，转化效率最高，为15％，最终获得同时含有CAX基因和NHX基因的转基因苜蓿阳性植株，并且目的基因可以在RNA水平上表达；创制的转基因苜蓿具有显著地抗盐能力，同时抗旱性优异，抗旱测试后进行复水测试，转基因苜蓿表现出了更强的长势。
附图说明
图1为P3300-NHX-CAX表达载体图谱；
图2为P3300-NHX-CAX农杆菌转化子的PCR鉴定；
图3为转P3300-NHX-CAX基因苜蓿CAX基因的PCR鉴定
图4为转P3300-NHX-CAX基因苜蓿NHX基因的PCR鉴定
图5为转基因苜蓿CAX基因和NHX基因的半定量RT-PCR
图6至图11为氯化钠胁迫下转基因苜蓿地上地下阳离子含量；
图12至图14为氯化钠胁迫下转基因苜蓿电导率、可溶性糖含量和脯氨酸含量；
图15至图20为干旱与复水条件下转基因苜蓿地上地下阳离子含量；
图21至图23为干旱与复水条件下转基因苜蓿电导率、可溶性糖含量和脯氨酸含量。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种创制抗逆转基因苜蓿的方法，包括以下步骤：
(1)碱茅CAX基因和NHX基因克隆
使用Omega公司试剂盒，提取吉农朝鲜碱茅的总RNA，采用反转录RT-PCR结合RACE的方法，克隆CAX基因，具体操作为：
A：将碱茅种子用蒸馏水清洗消毒后，置于一次性无菌培养皿中，放入人工气候箱，15℃恒温暗培养。一周后，将幼苗移栽至沙培介质中，每盆6株，于20℃/15℃(昼/夜)温室中正常生长，待其株高长至约10cm时，用1.5％NaCI溶液预处理，备用。参照北京天根生化公司的TRNzol试剂说明书逐步提取朝鲜碱茅叶片的总RNA，采用1.0％甲醛变性凝胶电检测其质量和浓度。以总RNA为模板，根据试剂盒的操作程序逆转录合成cDNA第一链。
B：通过NCBI检索，根据CAX基因编码区序列设计一对全长引物P1(5-ATGATGGAGTCGGCGGAGAAT-3)和P2(5-CCTAAATCAAGTGACAACGAATGA-3)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，以反转录合成的cDNA单链为模板，进行PCR扩增，反应体系为：DNAtemplate 1μL，P1 1μL，P2 1μL，ddH2O 10μL，PCR-Mix 12μL；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1：30min，30个循环，16℃冷却4min。经琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，与pMD18-T Vector连接过夜，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，测序。
分离克隆得到CAX基因的cDNA序列，全长1299bp，是一个完整开放阅读框，编码含432个氨基酸的蛋白，其蛋白质分子量为：47.39kDa，等电点：4.69，并登陆Genebank：JN172916，命名为PuCAX。
扩增出NHX基因的cDNA序列的方法：
A：将碱茅种子用蒸馏水清洗消毒后，置于一次性无菌培养皿中，放入人工气候箱，15℃恒温暗培养。一周后，将幼苗移栽至沙培介质中，每盆6株，于20℃/15℃(昼/夜)温室中正常生长，待其株高长至约10cm时，用1.5％NaCI溶液预处理，备用。参照北京天根生化公司的TRNzol试剂说明书逐步提取朝鲜碱茅叶片的总RNA，采用1.0％甲醛变性凝胶电检测其质量和浓度。以总RNA为模板，根据试剂盒的操作程序逆转录合成cDNA第一链。
B：通过NCBI检索，根据已发表的NHX基因编码区序列设计一对引物P3(5-ATGGCCACCGCCGACCCAAACCGC-3)和P4(5-TCACTGGCCTTGGAGGAAGGACCT-3)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以反转录合成的cDNA单链为模板，进行PCR扩增，反应体系为：DNAtemplate 1μL，P3 1μL，P4 1μL，ddH2O 10μL，PCR-Mix12μL；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2：10min，30个循环，16℃冷却4min。经琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，与pMD18-TVector连接过夜，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，测序。
扩增出NHX基因的eDNA序列，全长2397bp，是一个完整开放阅读框，编码含799个氨基酸的蛋白，其蛋白质分子量为：79.32kDa，等电点：6.37，命名为PuNHX。
(2)表达载体构建以及对紫花苜蓿的聚合转化
以P3300载体为原始载体，采用Gateway技术，构建NHX和CAX基因双价植物表达载体P3300-NHX-CAX，冻融法转化农杆菌，构成双基因/单质粒/单农杆菌聚合转化方式，利用农杆菌介导的遗传转化体系，将NHX和CAX基因同时导入公农5号紫花苜蓿，用草丁膦筛选抗性植株；用PCR法鉴定转基因植株，用半定量RT-PCR法测外源基因在转基因植物中的表达，其中，P3300-NHX-CAX表达载体图谱如图1所示，P3300-NHX-CAX农杆菌转化子的PCR鉴定如图2所示(上：NHX基因；下：CAX基因)，用PCR法鉴定转基因植株，用半定量RT-PCR法测外源基因在转基因植物中的表达，检测结果如图3至图5所示。
具体地，上述利用农杆菌介导的遗传转化体系的具体操作为：采用基于λ噬菌体位点特异重组系统的Gateway技术构建NHX和CAX基因双价植物表达载体P3300-NHX-CAX；根据Invitrogen公司Gateway多克隆试剂盒说明书设计attB接头的上下游引物，采用高保真Prime STARTMHS DNA Polymerase聚合酶扩增NHX和CAX基因的开放阅读框，回收PCR产物并进行BP反应，分别连接入门载体pDONRTM221P1-P5r和pDONRTM221P5-P2；将获得的入门载体与表达载体p3300进行LR反应，获得双价植物表达载体P3300-NHX-CAX，最后测序确保双价载体严格符合要求，冻融法转化农杆菌，选取饱满有光泽的紫花苜蓿种子，依次用75％的酒精表面灭菌30s，0.1％的升汞浸泡震荡灭菌8-10min，无菌水冲洗5遍，然后播种到MS培养基中，7d后以子叶为外植体，经过预培养，用含有目的载体的农杆菌菌液侵染，在愈伤诱导培养基上共培养，然后移入含有头孢霉素的愈伤组织诱导培养基上，14d后继代培养2次，待长出胚状体后，将愈伤组织转移至分化培养基上，30d后将幼苗移至生根培养中，待幼苗长大后移栽室外。
具体地，上述愈伤组织诱导培养基的组成为：MS培养基中含有2mg/L的二氯苯氧乙酸、0.25mg/L的激动素、2g/L水解酪蛋白、2mg/L的草铵膦，分化培养基的组成为：MS培养基中含有1.5mg/L激动素、2mg/L的草铵膦。
测试方法：
耐盐性：将萌发后的各系列转基因紫花苜蓿T1代种子，移入蛭石中用Hoagland营养液培养30d后，在0、50、100、150、200和250mmol/LNaCl下处理10d，取样测定植株各部位的鲜重和干重，参考《现代植物生理学实验指南》提供的方法测定各部位的Na+、K+和Ca2+含量，并测定叶片相对质膜透性，可溶性糖和脯氨酸的含量。
耐旱性：将转基因植株移至土壤中进行盆栽实验，用1/8Hoagland营养液浇灌，保持最大田间持水量30d，然后停止浇水，直到所有植株都出现严重的干旱胁迫症状(萎蔫)，再恢复浇水至最大田间持水量继续培养7d。在水分胁迫期间，每隔2天定时(9-10a.m.)监测土壤含水量，测定植株植株各部位的Na+、K+和Ca2+含量、叶片相对质膜透性、可溶性糖和脯氨酸的含量；在水分胁迫初期、后期和恢复浇水7d分别测定植株鲜重和干重。
实验结果：
耐盐性：如图6至图13所示，随着氯化钠浓度的增加，转基因苜蓿[OE(C+N)]的株高、地上部和地下部干重显著高于野生型苜蓿(WT)，可以积累更多的钠离子，钾离子含量逐渐降低，钙离子含量逐渐增加，与半定量RT-PCR的结果相一致，转CAX基因和NHX基因苜蓿表现出更强的耐盐性。同时转基因植株的相对电导率显著低于野生型对照，细胞膜损伤较小，体内积聚更多的脯氨酸和可溶性糖，进一步表明转基因苜蓿具有显著地抗盐能力。
表1 盐胁迫下转基因植株的生物学性状
Figure BSA0000174268170000081
耐旱性：如图11至图18所示，随着干旱胁迫时间的延长，转基因苜蓿[OE(C+N)]的株高、地上部和地下部干重显著高于野生型苜蓿(WT)。与盐胁迫不同，转基因苜蓿植株体内积累更多的钠离子、钾离子、钙离子、脯氨酸和可溶性糖，转CAX基因和NHX基因苜蓿表现出更强的抗旱性。转基因植株的相对电导率显著低于野生型对照，细胞膜损伤程度更小，抗旱性显著增强。同时复水后转基因植株也表现出更强的长势。
表2 干旱胁迫下转基因植株的生物学性状
Figure BSA0000174268170000082
Figure BSA0000174268170000091
由实验可知，通过聚合转化碱茅CAX基因和NHX基因，可以显著增强转基因苜蓿的耐盐性和抗旱性，利用基因工程提高苜蓿抗逆性是一条行之有效的育种途径。
本发明为今后通过多基因聚合转化抗逆基因改良农作物和牧草抗逆性的应用提供有力的理论基础和实践依据。这对于提高我国农作物和牧草的产量，增加农牧民收入，缓解水资源危机，改良和利用大面积盐碱荒地，促进农牧业生产，保障粮食丰产，具有重大的现实意义。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Figure ISA0000174268190000011
Figure ISA0000174268190000021
Figure ISA0000174268190000031
Figure ISA0000174268190000041
Figure ISA0000174268190000051

Claims (3)

1.一种创制抗逆转基因苜蓿的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)碱茅CAX基因和NHX基因克隆
使用Omega公司试剂盒，提取吉农朝鲜碱茅的总RNA，采用反转录RT-PCR结合RACE的方法，克隆CAX基因和NHX基因；
分离克隆得到CAX基因的cDNA序列，全长1299bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，是一个完整开放阅读框，编码含432个氨基酸的蛋白，其蛋白质分子量为：47.39kDa，等电点：4.69，并登陆Genebank：JN172916，命名为PuCAX；所述Genebank：JN172916，命名为PuCAX的序列为CAX基因的cDNA序列；
扩增出NHX基因的cDNA序列，全长2397bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，是一个完整开放阅读框，编码含798个氨基酸的蛋白，其蛋白质分子量为：79.32kDa，等电点：6.37，命名为PuNHX；
(2)表达载体构建以及对紫花苜蓿的聚合转化
以P3300载体为原始载体，采用Gateway技术，构建NHX和CAX基因双价植物表达载体P3300-NHX-CAX，冻融法转化农杆菌，构成双基因/单质粒/单农杆菌聚合转化方式，利用农杆菌介导的遗传转化体系，将NHX和CAX基因同时导入公农5号紫花苜蓿，用草丁膦筛选抗性植株。
2.根据权利要求1所述的一种创制抗逆转基因苜蓿的方法，其特征在于，上述利用农杆菌介导的遗传转化体系的具体操作为：采用基于λ噬菌体位点特异重组系统的Gateway技术构建NHX和CAX基因双价植物表达载体P3300-NHX-CAX；根据Invitrogen公司Gateway多克隆试剂盒说明书设计attB接头的上下游引物，采用高保真Prime STARTMHS DNA Polymerase聚合酶扩增NHX和CAX基因的开放阅读框，回收PCR产物并进行BP反应，分别连接入门载体pDONRTM221P1-P5r和pDONRTM221P5-P2；将获得的入门载体与表达载体p3300进行LR反应，获得双价植物表达载体P3300-NHX-CAX，最后测序确保双价载体严格符合要求，冻融法转化农杆菌，选取饱满有光泽的紫花苜蓿种子，依次用75％的酒精表面灭菌30s，0.1％的升汞浸泡震荡灭菌8-10min，无菌水冲洗5遍，然后播种到MS培养基中，7d后以子叶为外植体，经过预培养，用含有目的载体的农杆菌菌液侵染，在愈伤诱导培养基上共培养，然后移入含有头孢霉素的愈伤组织诱导培养基上，14d后继代培养2次，待长出胚状体后，将愈伤组织转移至分化培养基上，30d后将幼苗移至生根培养中，待幼苗长大后移栽室外。
3.根据权利要求2所述的一种创制抗逆转基因苜蓿的方法，其特征在于，上述愈伤组织诱导培养基的组成为：MS培养基中含有2mg/L的二氯苯氧乙酸、0.25mg/L的激动素、2g/L水解酪蛋白、2mg/L的草铵膦，分化培养基的组成为：MS培养基中含有1.5mg/L激动素、2mg/L的草铵膦。
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