CN110964729A - 一种普通小麦基因TaSNX1的克隆方法、应用及应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因克隆技术领域，公开了一种普通小麦基因TaSNX1的克隆方法，提取小麦总RNA，并合成小麦cDNA；以小麦cDNA为模板PCR扩增TaSNX1基因全长cDNA；回收并纯化扩增产物中目的片段并测序鉴定，又公开上述制备方法制备的小麦基因TaSNX1的应用；还公开其应用方法，先构建出重组植物表达载体，载体上连接有小麦基因TaSNX1的全长克隆和GFP标签，然后将所述重组表达载体T‑P转化入植物体内，得到转化植株，利用转化植株研究小麦基因TaSNX1的功能。本发明，克隆得到的小麦TaSNX1基因的全长cDNA序列和改造后的带GFP标签的pCambia1301+GFP双元载体，构建TaSNX1过表达重组载体T‑P，然后以农杆菌为媒介通过花絮侵染法转化拟南芥，并通过检测获得阳性突变体植株即构建成TaSNX1拟南芥过表达株系。

Description

一种普通小麦基因TaSNX1的克隆方法、应用及应用方法
技术领域
本发明涉及基因克隆技术领域，具体是一种普通小麦基因TaSNX1的克隆方法、应用及应用方法。
背景技术
磷是植物生长和发育过程中所必需的大量元素之一，在植物的糖分代谢、能量代谢、光合作用、酶促反应等过程中起关键作用；同时也是核酸、植物激素和卵磷脂的重要组成成分，在很大程度上决定了作物的产量与品质。研究磷在植物体中的具体作用机制对提高农作物的产量和品质具有重要意义。
小麦是我国主要的粮食作物之一，需求量大，施用磷肥对提高小麦的产量具有举足轻重的作用。土壤中利用效率最低的基本元素就是磷元素，作物的产量也因为缺磷而受到很大的损失。世界最大的小麦主产国就是中国，而我国栽培历史已经有几千年，我国小麦主产区主要在黄淮流域。而我们主产小麦的土壤大多数是偏碱性的黏土，因此土壤中的磷元素很大一部分以无效磷的形成存在，使得我国主产区的农作物处在缺磷状态。小麦作为我国主要的粮食作物，面临磷胁迫的问题急需解决。因此，开展小麦磷利用效率相关的基础与应用研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种普通小麦基因TaSNX1的克隆方法、应用及应用方法，获得了小麦基因TaSNX1的克隆，提供了小麦基因TaSNX1的克隆在研究植物磷调控机制和遗传改良中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种普通小麦基因TaSNX1的克隆方法，包括如下步骤：
(1)提取小麦总RNA，并合成小麦cDNA；
(2)以小麦cDNA为模板PCR扩增TaSNX1基因全长cDNA；
(3)回收并纯化(2)的扩增产物中目的片段并测序鉴定，即为普通小麦基因TaSNX1编码序列。
作为本发明进一步的方案：步驟(2)中，PCR扩增所用引物序列如下：
TaSNX1上游引物：5’-GCTCTAGAATGATCTCCGCGGAGAGG-3’；
TaSNX1下游引物：5’-GGGTCGACATGAACTGGAACACGCCTC-3’。
上述制备方法制备的小麦基因TaSNX1在研究植物磷调控机制和遗传改良上的应用。
一种普通小麦基因TaSNX1的应用方法，包括如下步骤：先构建出重组植物表达载体，载体上连接有小麦基因TaSNX1的全长克隆和GFP标签，然后将所述重组表达载体T-P转化入植物体内，得到转化植株，利用转化植株研究小麦基因TaSNX1的功能。
作为本发明进一步的方案：具体步骤如下：
S1、T-TaSNX1重组质粒的构建：连接所述小麦基因TaSNX1的克隆与pMD-18T载体，对纯化的基因TaSNX1的克隆加A尾，得到带A尾的目的基因；然后将带A尾的目的基因与pMD-18T载体连接，得到重组质粒T-TaSNX1；
S2、改进的重组植物表达载体T-P的构建：利用XbaI和Xhol两种内切酶分别对重组质粒T-TaSNX1和pCambia1301+GFP双元载体进行双酶切，分别得到重组质粒T-TaSNX1双酶切产物和pCambia1301+GFP载体双酶切产物；利用T4 DNA连接酶对重组质粒T-TaSNX1双酶切产物和pCambia1301+GFP载体双酶切产物进行连接，得到改进的重组植物表达载体T-P；
S3、农杆菌侵染植物体：种植野生型植物体，制备农杆菌感受态细胞，然后用重组表达载体T-P转化农杆菌感受态细胞，利用阳性农杆菌转化细胞侵染植物体，得到能有效克隆小麦TaSNX1基因的转基因植物体。
作为本发明进一步的方案：所述农杆菌为农杆菌GV3101。
作为本发明进一步的方案：所述植物体为拟南芥或者小麦。
作为本发明再进一步的方案：S3中挑取阳性农杆菌转化细胞侵染植物体后，筛选出含有TaSNX1基因的植物体，用于研究小麦基因TaSNX1的克隆在植物体磷调控机制和遗传改良中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明获得了普通小麦基因TaSNX1的克隆，利用克隆得到的小麦TaSNX1基因的全长cDNA序列和改造后的带GFP标签的pCambia1301+GFP双元载体，构建TaSNX1过表达重组载体T-P，然后以农杆菌为媒介通过花絮侵染法转化拟南芥，并通过检测获得阳性突变体植株即构建成TaSNX1拟南芥过表达株系。
附图说明
图1为小麦总RNA的电泳检测图；
其中M泳道为DL2000 Marker；1-6泳道为小麦总RNA样品；
图2为小麦cDNA的电泳检测图；
其中，M泳道为DL2000 Marker；1-6泳道为小麦cDNA样品
图3为目的基因TaSNX1的全长cDNA克隆；
其中，M泳道为DL2000 Marker；1和2泳道均为TaSNX1 cDNA基因全长；
图4为重组质粒T-TaSNX1双酶切产物的电泳图；
其中，M泳道为DL2000 Marker；1泳道为重组质粒T-TaSNX1载体双酶切产物；
图5为潮霉素筛选图片；
图6为转基因植株的蛋白Western Blotting检测结果
图7为转基因拟南芥OXSNX1-1与野生型拟南芥在不同磷条件下幼苗期的生长状况；
A：正常磷(+P；625μM)；B:缺磷；(-P；0μM)
图8为转基因拟南芥OXSNX1-2与野生型拟南芥在不同磷条件下幼苗期的生长状况；
A：正常磷(+P；625μM)；B:缺磷；(-P；0μM)
图9为7天MS中的拟南芥根部TaSNX1基因表达heatmap；
图10为7天MS中的拟南芥地上部TaSNX1基因的相对表达量。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供的一种普通小麦基因TaSNX1的克隆方法、应用及应用方法，包括以下实施例。
下述实施例中所用材料和试剂如下：
材料：郑麦9023(ZM9023)、拟南芥哥伦比亚型Arabidopsis thaliana(ecotypecolumbia)、农杆菌GV3101、pMDTM18/19-T Vector(TAKARA)、E.cloi DH5α、改造的pCambia1301+GFP双元载体。
实施例1
一种普通小麦基因TaSNX1编码序列的克隆，所述普通小麦基因TaSNX1编码序列的克隆是按照以下方法获得的：
(1)提取小麦总RNA，并合成小麦cDNA；
A1，提取小麦总RNA：方法采用Trizol法提取小麦总RNA。
A2，小麦总RNA的质量检测：
①浓度的测定：取1μL RNA溶液在NanoDrop2000上进行检测，A260/A280和A260/A230测量值会检测RNA的纯度和完整性。结果显示其A260/280值在1.8～2.0之间，A260/230值大于2.0，RNA样品纯度符合下一步实验要求。
②RNA的琼脂糖凝胶电泳检测：
1％的琼脂糖电泳检测RNA，125V电压下20min，照胶仪上进行成像检测，图1为小麦总RNA的电泳检测图。
A3，去除小麦总RNA中的基因组DNA：在RNase-free的离心管中利用RNA纯化试剂盒去除基因组DNA，试剂的添加情况如表1所示。
表1去除DNA的试剂加入量
Figure BDA0002276438630000041
Figure BDA0002276438630000051
A4，小麦cDNA的合成：
a.在RNase-free的离心管中加入下列表2中的试剂：
表2 RNA模板变性的试剂加入量
物质 用量
4×gDNAwiper Mix 2μL
Total RNA 1μL
RNase free ddH2O to 8 μL
用移液器将混合液轻轻吹打并混匀。42℃，2min。(模板RNA Total RNA：1pg-500ng)
b.在第1步反应管中直接加入5×HiScriptIIqRT SuperMixII：
5×HiScript II qRT SuperMix II
第一步的反应液 8μL
Total 10μL
用移液器将混合液轻轻吹打并混匀。
c.按下列条件进行第一链cDNA合成反应
25℃ 10min
50℃ 30min
85℃ 5min
得到小麦cDNA，放于-80℃保存。
(2)以小麦cDNA为模板PCR扩增TaSNX1基因全长cDNA。
表3 TaSNX1全长引物序列
Figure BDA0002276438630000061
以小麦cDNA为模板PCR扩增TaSNX1基因全长，PCR管中所加的体系如表4所示。
表4 T8SNX1基因全长PCR体系
primer F 2μL
primer R 2μL
dNTP Mix，2.5mM 4 μL
10×Pfu PCR Buffer 5μL
Pfu DNA Polymerase 0.5μL
Template DNA ＜1μg
RNase-Free Water up to 50μL
按照下列程序开始扩增：94℃变性5min，然后94℃变性45s，58℃退火35s，72℃延伸30s，32个循环，最后延伸步骤为72℃ 10min。扩增产物为TaSNX1基因的全长cDNA，作为目的基因TaSNX1。
(3)回收并纯化S12的扩增产物中目的基因TaSNX1(1215 bp)，该目的基因TaSNX1即为小麦基因TaSNX1编码序列的克隆。
取50μl S13中PCR反应产物，用DM2000 DNA-Marker为参照，在1％琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统扫描成像。目的基因TaSNX1的全长cDNA克隆如图2所示，图2结果显示在1％的琼脂糖凝胶中大约1215 bp左右有一条单一的清晰的条带，与TaSNX1大小相近，为TaSNX1的产物，可以用于下一步纯化步骤。纯化具体步骤按DNA纯化回收试剂盒说明书进行。
本发明还提供了一种所述的小麦基因TaSNX1的克隆在研究植物体磷调控机制中的应用，先构建出改进的重组植物表达载体，载体上连接有小麦基因TaSNX1的全长克隆和GFP标签，然后将所述重组表达载体T-P转化入植物体内，得到转化植株，利用转化植株研究小麦基因TaSNX1在植物磷调控机制和遗传改良中的应用。具体步骤如下：
S1，T-TaSNX1重组质粒的构建
连接目的基因TaSNX1与pMD18-T载体：扩增所用的酶为Pfu DNA Polymerase，由于扩增产物末端不含A碱基，为方便与T载体相连需要利用Taq DNA polymerase 0.2μL，10×pcr buffer 2μL，dNTP 0.5μL，产物17.3μL的20μL反应体系于72℃延伸30min对产物的末端加入A碱基。
目的基因TaSNX1与pMD18-T载体连接，连接体系如表5所示：
表5 TaSNX1与pMD18-T载体连接体系
pMDl8-T载体 1μL
Solution I 5μL
PCR回收产物 4μL
Total 10μL
最后将其混和均匀后16℃过夜连接，得到重组质粒T-TaSNX1。将所述重组质粒T-TaSNX1转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中保存，使用时提取重组质粒T-TaSNX1。
S11，制备大肠杆菌DH5α感受态细胞：大肠杆菌DH5α感受态细胞按照常规分子实验方法进行，-80℃保存备用。
S12，T-TaSNX1重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞：S12步骤按照常规分子实验方法进行。
S13，菌落PCR鉴定，质粒双酶切鉴定
选取得到的重组质粒T-TaSNX1，对重组质粒T-TaSNX1按表6进行菌落PCR鉴定；同时进行双酶切鉴定，其中酶切位点为：Xbal，Xhol。重组质粒T-TaSNX1的双酶切鉴定如图3所示。
表6阳性克隆的菌落PCR鉴定体系如下：
2×Taq Master Mix 10μL
primer F 1μL
primer R 1μL
菌样 1μL
ddH2O 7μL
PCR扩增程序为94℃5min，94℃30sec，58℃35sec，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。
S14，提取质粒、质粒PCR鉴定及测序
挑取划线菌阳性菌落进行过夜培养，然后按照质粒小量制备试剂盒质粒提取说明书提质粒，取3μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，同时送公司测序，测序结果也证明该产物与TaSNX1的序列一样，所以可以用于下一步实验。
S2，重组表达载体T-P的构建
选取测序正确的重组质粒T-TaSNX1，对重组质粒T-TaSNX1和pCambia1301-GFP载体进行双酶切，其中酶切位点为：Xbal，Xhol。
表7重组质粒T-P的连接体系
试剂名称 加入体积(each)
酶切回收P1301载体 2μL
酶切回收目的基因片段 5μL
T4 DNA Ligase 1μL
5×T4 DNA Ligase Buffer 2μL
Total 10μL
16℃连接过夜，将连接产物转入到已制备的感受态细胞中。将单克隆挑出后进行菌落PCR，在含有相应的抗生素的LB液体培养基中接种阳性克隆菌落并摇菌，37℃，220rpm培养12小时左右。
(2)重组表达载体T-P的菌落PCR验证
提取大肠杆菌DH5α感受态细胞中重组表达载体T-P，进行菌落PCR鉴定，图4为重组表达载体T-P的菌落PCR鉴定结果；然后将重组载体T-P的单克隆接种到含有相应抗生素的LB液体培养基中摇菌，37℃，220rpm培养过夜，提取质粒，得到重组载体T-P备用。
S3，农杆菌侵染拟南芥
S31，种植野生型拟南芥
按常规方法种植野生型拟南芥，备用。
S32，制备农杆菌感受态细胞
按常规方法制备农杆菌GV3101感受态细胞，置于-80℃冰箱保存备用。
S33，用重组表达载体T-P转化农杆菌感受态细胞
①取农杆菌感受态细胞置于冰上，加入2μL重组表达载体T-P，混匀放在液氮中速冻，然后放在冰上冰浴。②42℃热激90s，加入800μL无抗生素的LB液体培养基，28℃，160rpm培养4h。③5000r/min离心3min，去上清，剩余部分混匀，涂在含有Rif和相应抗体的LB平板上，28℃培养。④随机挑选单菌落进行划线生长，28℃培养。⑤对阳性菌落进行PCR鉴定，挑取得到阳性克隆的转化农杆菌。
S34，采用花絮侵染法，将挑取得到阳性克隆的转化农杆菌侵染拟南芥
①将含有阳性克隆的转化农杆菌接种于10mL含有利福平及相应抗性的LB液体培养液中，28℃，200rpm震荡培养过夜。②5000rpm离心10min，弃上清，收集菌体。③用200mLMS盐溶液(1/2MS，5％蔗糖，200μL/L Silwet L-77，PH5.8)悬浮菌体。④将提前一天浇透水的拟南芥花序浸入上述悬浮液30s后，套上保鲜袋置于黑暗中保湿1天后，放到光照培养架上正常培养至收种。⑤在相应抗性MS培养基上筛选收取的T1代种子的突变体，作为能有效克隆小麦TaSNX1基因的转基因植物体，筛选步骤如下：a.抗生素筛选：收取成熟的T1代种子并在相应的潮霉素抗性MS培养基上筛选转基因植株；图5为转基因植株的抗生素筛选图；在含有潮霉素的MS培养基上不是转基因的种子都不发芽，只有转基因的种子才能正常生长。b.转基因拟南芥蛋白水平上的检测：取约100mg拟南芥上述筛选出来的转基因植株提取总蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后通过转膜、封闭、孵育抗体，进行AP显色。图6为转基因植株的蛋白检测结果。
为了验证本发明方法的可行性，我们参照实施例1的方法制备了T1代转基因拟南芥幼苗，并研究了磷胁迫对转基因拟南芥形态的影响，如下：
A5 1/2MS培养基中培养转基因拟南芥
1.1将消毒完成的拟南芥均匀铺在1/2MS培养基平板上，后在生化培养箱中长至5天后，将幼苗转移至处理培养基中，其中1/2MS正常磷和缺磷培养基的磷源为KH2PO4，正常磷为625μM、缺磷为不加KH2PO4，其它成分都一样。培养条件为每天16/8的光照/黑暗，温度为23℃。培养7天后分地上地下部分取样，做两部分处理，一部分用于检测其生理性状；一部分液氮迅速冷冻储存，用于后期RNA的提取，也可以放于-80℃冰箱备用。配方如下。
1/2MS培养基：称取2.615g成品MS盐(phytoTechnology，美国)放于1L玻璃三角瓶中，加入0.34g MES(Amresco,美国)，20g蔗糖(20％)和8.5g琼脂，加入大约800mL超纯水，用1mM KOH将pH调整至5.85，最后用超纯水定容至1L。
1/2MS正常对照培养基：称取0.305g缺N、P、K大量元素的成品MS盐(phytoTechnology，美国)放于1L玻璃三角瓶中，分别加入5mL 100×KNO3，5mL100×NH4NO3，5mL 100×KH2PO4的母液，0.43g MES,20g蔗糖和8.5g琼脂，加入大约800mL超纯水，用1mM KOH将pH调整至5.85，最后用超纯水定容至1L。
1/2MS缺磷处理培养基：称取0.305g缺N、P、K大量元素的成品MS盐(phytoTechnology，美国)放于1L玻璃三角瓶中，分别加入5mL 100×KNO3，5mL 100×NH4NO3，5mL 100×K2SO4的母液，0.43g MES，20g蔗糖和8.5g琼脂，加入大约800mL超纯水，用1mM KOH将pH调整至5.85，最后用超纯水定容至1L。
MS培养基N、P、K大量母液的配置参考表4
表4 MS大量100×母液
Table 3-1MS medium macronutrient stock(100×)
组分 配方(g/L) 终浓度(mM)
KNO3 190 18.79
NH4NO3 165 20.61
KH2PO4 17 1.25
K2SO4 10.88 0.625
1.2转基因拟南芥在幼苗期不同磷条件下的生长状况
在不同磷条件下的1/2MS培养基上生长7天后进行观察，分别取根和地上部分别液氮速冻，-80℃保存。结果如图7和8所示，图7,8为转基因拟南芥与野生型拟南芥在不同磷条件下幼苗期的生长状况，其中图7,8A为正常磷(625μM)处理结果、图7,8B为缺磷处理结果，其中，OXSNX1-1,2表示转基因拟南芥，WT表示野生型拟南芥。幼苗期转基因与野生型拟南芥在不同磷条件下的生长状况显示：TaSNX1基因的过表达抑制主根的伸长，缺磷磷水平下，过表达型拟南芥主根明显短于野生型；过表达和野生型植株根系在缺磷条件下相比正常磷表现更为发达，具体表现为侧根增多，主根变短，综上所述，过表达拟南芥植株在低磷胁迫时能通过改变根部形状如侧根密度变大，主根较野生型变长来应对，对植物的生长发育具有重要作用。
1.3转基因拟南芥中TaSNX1基因的qRT-PCR检测
提取拟南芥RNA，反转录成cDNA，后续用于荧光定量。并用拟南芥actin2引物检测cDNA的完整性，引物序列见表5。琼脂糖凝胶电泳结果显示，在108bp左右有一条清晰的条带，证明cDNA完整性较好，可以用于下一步实验。
表5拟南芥看家基因actin2的引物序列
Figure BDA0002276438630000111
Figure BDA0002276438630000121
荧光定量检测TaSNX1基因的相对表达量。所用试剂盒为TIAGENG公司的QuantiFast SYBR Green PCR试剂盒，按说明书进行qRT-PCR扩增，所用引物为表9的引物序列。每个混合样品重复3次，计算各个基因的相对表达量，计算公式为：目的基因＝2-ΔΔCt。图9和图10为7天1/2MS培养基中的拟南芥根部TaSNX1基因的相对表达量的结果，TaSNX1的荧光定量结果显示：OXSNX1-1缺磷浓度处理的拟南芥基因表达比正常磷基因高，缺磷根部的基因表达要比叶部高。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110>申请人
<120>一种普通小麦基因TaSNX1的克隆方法、应用及应用方法
<160>6
<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
gctctagaat gatctccgcg gagagg 26
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
gggtcgacat gaactggaac acgcctc 27
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
aggaaggatc tgtacggtaa c 21
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
tgtgaacgat tcctggac 18
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>5
gagccaatgc tttcaggcag 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>6
gctcgtacct cttcgtagcc 20
序列表
<110> 河南农业大学 河南科技学院
<120> 一种普通小麦基因TaSNX1的克隆方法、应用及应用方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctctagaat gatctccgcg gagagg 26
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggtcgacat gaactggaac acgcctc 27
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggaaggatc tgtacggtaa c 21
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtgaacgat tcctggac 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagccaatgc tttcaggcag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctcgtacct cttcgtagcc 20

Claims (8)

1.一种普通小麦基因TaSNX1的克隆方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取小麦总RNA，并合成小麦cDNA；
（2）以小麦cDNA为模板PCR扩增TaSNX1基因全长cDNA；
（3）回收并纯化（2）的扩增产物中目的片段并测序鉴定，即为普通小麦基因TaSNX1编码序列。
2.根据权利要求1所述的一种普通小麦基因TaSNX1的克隆方法，其特征在于，步驟（2）中，PCR扩增所用引物序列如下：
TaSNX1上游引物：5’-GCTCTAGAATGATCTCCGCGGAGAGG-3’；
TaSNX1下游引物：5’-GGGTCGACATGAACTGGAACACGCCTC-3’。
3.权利要求1或2中制备的小麦基因TaSNX1在研究植物磷调控机制和遗传改良上的应用。
4.一种普通小麦基因TaSNX1的应用方法，其特征在于，先构建出重组植物表达载体，载体上连接有小麦基因TaSNX1的全长克隆和GFP标签，然后将所述重组表达载体T-P转化入植物体内，得到转化植株，利用转化植株研究小麦基因TaSNX1的功能。
5.根据权利要求4所述的一种普通小麦基因TaSNX1的应用方法，其特征在于，具体步骤如下：
S1、T-TaSNX1重组质粒的构建：连接所述小麦基因TaSNX1的克隆与pMD-18T载体，对纯化的基因TaSNX1的克隆加A尾，得到带A尾的目的基因；然后将带A尾的目的基因与pMD-18T载体连接，得到重组质粒 T-TaSNX1；
S2、改进的重组植物表达载体T-P的构建：利用XbaI和Xhol两种内切酶分别对重组质粒T-TaSNX1和pCambia1301+GFP双元载体进行双酶切，分别得到重组质粒T-TaSNX1双酶切产物和pCambia1301+GFP载体双酶切产物；利用T4 DNA连接酶对重组质粒T-TaSNX1双酶切产物和pCambia1301+GFP载体双酶切产物进行连接，得到改进的重组植物表达载体T-P；
S3、农杆菌侵染植物体：种植野生型植物体，制备农杆菌感受态细胞，然后用重组表达载体T-P转化农杆菌感受态细胞，利用阳性农杆菌转化细胞侵染植物体，得到能有效克隆小麦TaSNX1基因的转基因植物体。
6.根据权利要求5所述的一种普通小麦基因TaSNX1的应用方法，其特征在于，所述农杆菌为农杆菌GV3101。
7.根据权利要求5所述的一种普通小麦基因TaSNX1的应用方法，其特征在于，所述植物体为拟南芥或者小麦。
8.根据权利要求5所述的一种普通小麦基因TaSNX1的应用方法，其特征在于，S3中挑取阳性农杆菌转化细胞侵染植物体后，筛选出含有TaSNX1基因的植物体。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111896506A (zh) * 2020-06-29 2020-11-06 贵州省水稻研究所 一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016127075A2 (en) * 2015-02-06 2016-08-11 New York University Transgenic plants and a transient transformation system for genome-wide transcription factor target discovery
CN108795927A (zh) * 2018-07-02 2018-11-13 河南农业大学 普通小麦基因TaSPX3编码序列的克隆及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016127075A2 (en) * 2015-02-06 2016-08-11 New York University Transgenic plants and a transient transformation system for genome-wide transcription factor target discovery
CN108795927A (zh) * 2018-07-02 2018-11-13 河南农业大学 普通小麦基因TaSPX3编码序列的克隆及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK: "PREDICTED: Aegilops tauschii subsp. tauschii sorting nexin 1 (LOC109743881), mRNA，NCBI Reference Sequence: XM_020302965.1", 《GENBANK》 *
WILLIAM O. SLADE ET AL.: "Exogenous Auxin Elicits Changes in the Arabidopsis thaliana Root Proteome in a Time-Dependent Manner", 《PROTEOMES》 *
YANYAN CUI ET AL.: "BLOS1, a putative BLOC-1 subunit, interacts with SNX1 and modulates root growth in Arabidopsis", 《JOURNAL OF CELL SCIENCE》 *
林德立: "小麦TaSNX1基因功能分析和低LOX酶活遗传改良", 《中国知网硕士电子期刊》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111896506A (zh) * 2020-06-29 2020-11-06 贵州省水稻研究所 一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法

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