CN113337539A

CN113337539A - 一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法

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Publication number: CN113337539A
Application number: CN202110583896.0A
Authority: CN
Inventors: 金双侠; 张献龙; 余露; 王琼琼
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-05-27
Filing date: 2021-05-27
Publication date: 2021-09-03

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，且公开了一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，所述该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。该适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，通过对含有棉花内源启动子pGhU6‑7的pRGEB32‑GhU6.7‑NPTⅡ载体进行改造，以BeYDV双生病毒中复制子元件为载体，将sgRNA序列构建在复制环内，构建了在棉花中具有基因编辑功能的载体BeYDV‑Cas9，选取GhCLA为目标基因验证BeYDV‑Cas9在棉花中的应用，并且设计1个靶标，利用农杆菌介导的遗传转化将BeYDV‑Cas9基因编辑系统导入棉花基因组，对转基因植株进行Sanger测序，检测本发明在异源四倍体棉花基因组中的编辑效率类型，从而有效的解决了传统的CRISPR‑Cas9系统在对陆地棉进行基因编辑时无能为力，且并无可行有效编辑工具的问题。

Description

一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体为一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法。

背景技术

CRISPR/Cas系统(Clustered regularlyinterspaced short palindromicrepeats/CRISPRassociated protein)是细菌和古菌在抵御外来病毒和噬菌体入侵的过程中不断迚化而来的一种获得性免疫防御机制，CRISPR/Cas9系统是目前应用最多最广泛的基因编辑系统，能够高效特异和灵活的识别靶基因中的特定位点，然而，随着研究的不断深入，CRISPR/Cas9也暴露了比较严重的脱靶效应(Hsu et al 2014)、PAM序列的限制导致其切割位点较少及基因编辑后后代不易纯合等缺陷，因此需要改造CRISPR/Cas9系统，降低其脱靶效应，提高基因编辑精准度，扩大靶标位点范围，寻找新的基因编辑系统。

Geminivirus是一类拥有众多成员的植物病毒，它们的基因组由2.5-3kb 的单链环状DNA组成，能浸染大多数单子叶和双子叶植物，并且能被改造成 HDR所需的供体分子，当Geminivirus浸染植物细胞后，它们具有快速浸染、增殖、转录、表达而不整合入植物基因组的特点，从使得细胞内以滚环复制的方式产生大量的供体分子，数量可高达数百至数千拷贝，一次，将生病毒在植物体内滚环复制提供大量sgRNA模板，可大量增加植物体内的Cas9蛋白和sgRNA含量可以有效的促进在植物基因组中精确高编辑。

目前，BeYDV介导的基因编辑系统系统在很多物种中被报道，但是在异源四倍体棉花中尚无报道，陆地棉是一种广泛种植的异源四倍体(AtDt)，其基因组中的许多基因具有高度同源性，并且基因组比较复杂及庞大，传统的 CRISPR-Cas9系统在需要对某些特定基因进行编辑及功能分析时无能为力，其并无可行而又有效的精准编辑工具，为棉花基因组功能分析，作物遗传改良和新品种选育提供重要技术支持，因此难以满足社会需求，故而提出一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法来解决上述中所提出的问题。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，具备可精准编辑基因等优点，解决了传统的CRISPR-Cas9系统在对陆地棉进行基因编辑时无能为力，且并无可行有效编辑工具的问题。

(二)技术方案

为实现上述可精准编辑基因的目的，本发明提供如下技术方案：一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，所述该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，所述该载体的核苷酸序列如SEQID NO:2所示，该载体通过下列步骤制备获得：

1)、获得目的序列复制子元件(BeSRL)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO： 3所示，具体地，该目的序列通过以下步骤制备获得：

(1)、利用XbaⅠ对SEQ ID NO：1所示的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ(序列表SEQ ID NO：1)载体进行酶切；

(2)、与复制子序列元件BeSRL目的序列进行连接；

(3)、通过测序验证，得到如SEQ ID NO：4所示的适用于陆地棉的基因敲入的基础载体BeYDV-pRGEB32-1；

2)、获得目的序列复制子元件(ULIR)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO： 5所示，具体地，该目的序列通过以下步骤制备获得：

(1)、Afe I对SEQ ID NO：4所示的BeYDV-pRGEB32-1载体进行酶切；

(2)、与复制子序列元件BeSRL目的序列进行连接；

(3)、通过测序验证，得到如SEQ ID NO：2所示的适用于陆地棉的基因敲入的高效转化载体BeYDV-Cas9。

优选的，所述的载体BeYDV-Cas9在陆地棉基因组编辑中的应用。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，具备以下有益效果：

1、该适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，通过对含有棉花内源启动子pGhU6-7的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体进行改造，以BeYDV双生病毒中复制子元件为载体，将sgRNA序列构建在复制环内，构建了在棉花中具有基因编辑功能的载体BeYDV-Cas9，选取GhCLA为目标基因验证BeYDV-Cas9在棉花中的应用，并且设计1个靶标，利用农杆菌介导的遗传转化将BeYDV-Cas9 基因编辑系统导入棉花基因组，对转基因植株进行Sanger测序，检测本发明在异源四倍体棉花基因组中的编辑效率类型，达到了具有较高编辑效率和特异性的效果。

2、该适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，通过合成菜豆黄矮病毒的复制子元件BeSRL，利用Xba I对SEQ ID NO：1所示的pRGEB32-GhU6.7-NPT Ⅱ载体进行酶切，与复制子序列元件BeSRL目的序列进行连接，通过测序验证，得到如SEQ ID NO：4所示的适用于陆地棉的基因编辑的中间载体 BeYDV-pRGEB32-1，以及利用Afe I对SEQ ID NO：2所示的BeYDV-pRGEB32-1 载体进行酶切，与复制子序列元件BeSRL目的序列进行连接，通过测序验证，得到如SEQ ID NO：2所示的适用于陆地棉的基因敲入的高效转化载体 BeYDV-Cas9，该发明在棉花中的基因编辑效率达到95％，并且在棉花中的基因编辑类型小片段插入和片段缺失，其具备较好的适用性，从而有效的解决了传统的CRISPR-Cas9系统在对陆地棉进行基因编辑时无能为力，且并无可行有效编辑工具的问题。

附图说明

图1为本发明提出的一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法中载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ的载体图；

图2为本发明提出的一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法中表达载体BeYDV-Cas9的构建图；

图3为本发明提出的一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法中中间载体BeYDV-pRGEB32-1的构建图；

图4为本发明提出的一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法中基因编辑载体BeYDV-Cas9-sgRNA构建示意图；

图5为本发明提出的一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法中载体BeYDV-Cas9-sgRNA的遗传转化图；

图6为本发明提出的一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法中基因编辑载体BeYDV-Cas9-sgRNA的编辑检测图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-6，一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，该载体的核苷酸序列如 SEQ IDNO:2所示，该载体通过下列步骤制备获得：

(2)、与复制子序列元件BeSRL目的序列进行连接；

(1)、Afe I对SEQ ID NO：4所示的BeYDV-pRGEB32-1载体进行酶切；

(2)、与复制子序列元件BeSRL目的序列进行连接；

(3)、通过测序验证，得到如SEQ ID NO：2所示的适用于陆地棉的基因敲入的高效转化载体BeYDV-Cas9，而载体BeYDV-Cas9为在陆地棉基因组编辑中的应用。

序列表SEQ ID NO：1是本发明的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体的核苷酸序列，序列长度为16241bp；

序列表SEQ ID NO：2是陆地棉基因组高效精确基因编辑载体BeYDV-Cas9 的核苷酸序列，序列长度为18272bp；

序列表SEQ ID NO：3是菜豆黄矮病毒的复制子元件BeSRL的核苷酸序列，序列长度为1637bp；

序列表SEQ ID NO：4是中间载体BeYDV-pRGEB32-1的核苷酸序列，序列长度为17908bp；

序列表SEQ ID NO：5是菜豆黄矮病毒的复制子元件ULIR的核苷酸序列，序列长度为365bp；

并且，附图标记中图5中的字母编号分别是：a、下胚轴共培养阶段；b、转到含有卡那霉素的选择培养基上的茎段；c、在选择培养基上两端膨大的茎段；d、在分化培养基里的愈伤组织；e、在生根培养基表现白化上的小苗子； g.具有白化表型的转基因苗子。

实施例1：菜豆黄矮病毒的复制子元件BeSRL和ULIR目的序列的获得

查阅文献DNA Replicons for Plant Genome Engineering从中获取菜豆黄矮病毒的复制子元件BeSRL(序列表如SEQ ID NO：3)和ULIR目的序列(序列表如SEQ ID NO：5)，然后经过公司(GenScript)合成。

实施例2：转化载体BeYDV-Cas9的构建

1、利用限制性内切酶Xba I酶切pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体，连接黄矮病毒的复制子元件BeSRL

将pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ(序列表见SEQ ID NO：1)进行Sbf I酶切，酶切体系见表2，37℃酶切5小时，凝胶电泳观察酶切条带是否正确，然后利用凝胶回收试剂盒(武汉华信阳光生物科技有限公司)将酶切产物纯化，酶切体系见表1。

表1限制性内切酶Sbf I酶切pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体

试剂	100μL
		载体	10μg
10X cut smart Buffer	10μL
		Sbf I	4μL
ddH2O	up to 100μL

在酶切后的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体上设计引物，其中：

正向引物为：CCGAATTTGTGGACCTTAGCGCGTGCATGCCTG；

反向引物为：GCGTGCATGCCTGCA ACCCGAATTTGTGGACCGAG；

将扩增后的BeSRL序列与酶切后的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体在37℃水浴中通过In-fusion连接(表2)反应30分钟后至常温，转化到大肠杆菌感受态，挑取阳性克隆进行测序，测序正确后得到BeYDV-pRGEB32-1(序列表见 SEQ ID NO：4)中间载体。

表2 In-fusion连接反应体系

试剂	3.5μL
		目的片段	1μL
线性载体	1μL
		Exanse	0.5μL
CE Buffer	1μL

37℃水浴30min，冰上放置5min，可-20℃保存。

2、将BeYDV-pRGEB32-1中间载体酶切后连接黄矮病毒的复制子元件ULIR

1)、将步骤1中阳性克隆测序正确的BeYDV-pRGEB32-1(序列表见SEQ ID NO：4)中间载体利用限制性内切酶Afe I酶切，连接黄矮病毒的复制子元件 ULIR，将BeYDV-pRGEB32-1(序列表见SEQ ID NO：4))进行Afe I酶切，酶切体系见表3，37℃酶切5小时，凝胶电泳观察酶切条带是否正确，然后利用凝胶回收试剂盒(武汉华信阳光生物科技有限公司)将酶切产物纯化，酶切体系见表3。

在酶切后的BeYDV-pRGEB32-1载体上设计引物，其中：

正向引物为：TTACGCCAAAGCGCTtagcagaaggcatgttgttgtgac；

反向引物为：GACGGTACCGGATCCgagggtcgtacgaataattcg；

将扩增后的ULIR序列与酶切后的BeYDV-pRGEB32-1载体在37℃水浴中通过In-fusion连接反应30分钟后至常温，转化到大肠杆菌感受态，挑取阳性克隆进行测序。

表3限制性内切酶Afe I酶切BeYDV-pRGEB32-1载体

实施例3：BeYDV-Cas9-sgRNA载体的构建

1.GhCLA基因的sgRNA设计

选择陆地棉1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(Cloroplasto alterados，CLA) Gh_D10G017610基因为验证基因；

利用在线软件CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR) (Lei etal 2014)在基因外显子区域设计sgRNA靶标序列，最终该基因选择1 个sgRNA用来构建基因敲入系统植物表达载体，sgRNA的序列见表4。

表4 sgRNA的序列

sgRNA	序列
		sgRNA1	gagagctgctgacaagtatcacgg

2.sgRNA与BeYDV-Cas9-KI-RFP载体的连接

插入BeYDV-Cas9-KI-RFP载体的靶标序列为sgRNA1-gRNA，该两个靶标片段由公司(GenScript)合成，利用BsaI酶切BeYDV-Cas9，将公司合成的 sgRNA1+gRNA片段通过In-fusion连接(表2)分别连接到BeYDV-Cas9载体的BsaI酶切位点处，转化到大肠杆菌感受态，挑取阳性克隆进行测序，测序正确后得到BeYDV-Cas9-sgRNA载体。

实施例4：农杆菌介导的遗传转化

具体步骤如下：

A、将剥好的棉花种子(品种为Jin668，专利申请号201510833618.0)用 0.1％升汞杀菌，无菌水清洗数次后放入无菌苗培养基中，28℃暗培养1天，挑去种皮，将苗扶正，在28℃，暗培养4-5d；

B、将下胚轴切成小茎段，用活化后的农杆菌侵染，弃菌液，并吹干；

C、将下胚轴平铺在放有滤纸的共培养培养基中，于20℃，暗培养1-2d；

D、将下胚轴转入到附加2，4-D的愈伤组织诱导培养基中，放入光照培养室，20-30d左右用新鲜愈伤组织诱导培养基继代培养一次；

E、当愈伤组织长成米粒状颗粒，转入分化培养基中，进一步分化成胚状体；

F、将分化出的小苗继代到生根培养基中，直至长成生根良好健康的小苗；

G、将小苗转到清水中，进行炼苗，一周左右后，转移到到温室。

转化所用的培养基组分及配比：

无菌苗萌发培养基：1/2MS大量元素，15g/L葡萄糖，2.5g/L的Phytagel； pH:6.1-6.2。

愈伤组织诱导培养基：MSB+24-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+3％Glucose+0.3％Phytagel；pH:5.85-5.95。

农杆菌活化培养基：胰化蛋白胨5g/L+NaCl 5g/L+MgSO4.7H2O 0.1 g/L+KH2PO4+0.25g/L+甘露醇5g/L+甘氨酸1.0g/L；pH:5.85-5.95。

共培养培养基：MSB+2，4-D 0.1mg/l+KT 0.1mg/l+50mg/l AS+3％ Glucose+0.25％Phytagel，pH5.8。

选择培养基：MSB+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+3％Glucose+0.3％ Phytagel，卡那霉素50mg/L和头孢霉素400mg/L；pH:5.85-5.95。

分化培养基：分化培养基：MSB培养基中去掉NH4NO3，将KNO3用量加倍+Gln 1.0g/L+Asn 0.5g/L+IBA 0.5mg/L+KT 0.15mg/L+3％Glucose+0.25％ Phytagel，pH:6.1-6.2。

生根培养基：1/2MS无机盐+B5有机物，15g/L葡萄糖，2.5g/L的 Phytagel；pH:5.90-5.95；

MSB的成分如下：MS培养基+B5维生素。

实施例5：BeYDV-Cas9-sgRNA对在转基因棉花植株中基因编辑检测中的应用

(1)Sanger测序检测编辑效率

提取的棉花嫩叶阳性基因组DNA【天根生化(北京)科技有限公司】，以阳性DNA为模板，扩增GhCLA(Gh_D10G017610)靶标序列，然后将PCR片段连入pGEM-T easy载体(购自北京普洛麦格生物技术有限公司)，将连接产物热激转化大肠杆菌感受态TOP10，挑取的单克隆进行阳性检测并进行Sanger 测序，将测序结果与靶标序列比对，总计送300个单克隆测序，统计每个靶点被编辑情况，共有286个样品被编辑，编辑类型为片段插入和片段缺失，其中片段缺失占91％，测序结果见图6。

本发明在棉花中首次成功建立了适应于棉花基因组特性的Be-YDV介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统，该系统显示出较高的编辑效率和很高的特异性，它将成为棉花功能基因组研究新的重要的技术手段。

工作原理：该适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，通过对含有棉花内源启动子pGhU6-7的pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体进行改造，以BeYDV双生病毒中复制子元件为载体，将sgRNA序列构建在复制环内，构建了在棉花中具有基因编辑功能的载体BeYDV-Cas9，选取GhCLA为目标基因验证 BeYDV-Cas9在棉花中的应用，并且设计1个靶标，利用农杆菌介导的遗传转化将BeYDV-Cas9基因编辑系统导入棉花基因组，对转基因植株进行Sanger 测序，检测本发明在异源四倍体棉花基因组中的编辑效率类型，达到了具有较高编辑效率和特异性的效果。

综上所述，该适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，通过合成菜豆黄矮病毒的复制子元件BeSRL，利用Xba I对SEQ ID NO：1所示的 pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ载体进行酶切，与复制子序列元件BeSRL目的序列进行连接，通过测序验证，得到如SEQ ID NO：4所示的适用于陆地棉的基因编辑的中间载体BeYDV-pRGEB32-1，以及利用Afe I对SEQ ID NO：2所示的 BeYDV-pRGEB32-1载体进行酶切，与复制子序列元件BeSRL目的序列进行连接，通过测序验证，得到如SEQ ID NO：2所示的适用于陆地棉的基因敲入的高效转化载体BeYDV-Cas9，该发明在棉花中的基因编辑效率达到95％，并且在棉花中的基因编辑类型小片段插入和片段缺失，其具备较好的适用性，从而有效的解决了传统的CRISPR-Cas9系统在对陆地棉进行基因编辑时无能为力，且并无可行有效编辑工具的问题。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，其特征在于：所述该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，其特征在于：所述该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，该载体通过下列步骤制备获得：

1)、获得目的序列复制子元件(BeSRL)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，具体地，该目的序列通过以下步骤制备获得：

(2)、与复制子序列元件BeSRL目的序列进行连接；

2)、获得目的序列复制子元件(ULIR)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示，具体地，该目的序列通过以下步骤制备获得：

(1)、Afe I对SEQ ID NO：4所示的BeYDV-pRGEB32-1载体进行酶切；

(2)、与复制子序列元件BeSRL目的序列进行连接；

3.根据权利要求1或2所述的一种适用于陆地棉的基因精准高效编辑的方法，其特征在于：所述的载体BeYDV-Cas9在陆地棉基因组编辑中的应用。