CN113832182B - 一种水稻Osspear2突变体植株的制备方法 - Google Patents

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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Abstract

本发明公开了一种水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其包括步骤：筛选水稻基因OsSPEAR2的sgRNA靶点序列；根据所述sgRNA靶点序列设计上、下游引物；将所述上游引物和下游引物混合并进行退火处理，形成双链DNA；用限制性内切酶对质粒进行酶切得到线性质粒；用T4DNA连接酶连接所述线性质粒和双链DNA得到连接产物，所述连接产物经转化、筛选得到重组质粒；将所述重组质粒导入相应的浸染细菌中，得到含有重组质粒的浸染细菌，然后用含有重组质粒的浸染细菌侵染水稻愈伤组织；对所述水稻愈伤组织进行诱导获得再生苗，筛选得到转基因阳性植株。本发明获得了一种具有重要应用价值的水稻Osspear2突变体，且所述Osspear2突变体出现花粉败育的现象，对杂交水稻的生产具有重要应用价值。

Description

一种水稻Osspear2突变体植株的制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种水稻Osspear2突变体植株的制备方法。
背景技术
CRISPR/CAS9系统是近年来发展起来的一种基因组DNA编辑技术，其原理是核酸酶Cas9蛋白与单导向RNA(small guide RNA,sgRNA)形成复合体，sgRNA通过碱基互补配对决定靶序列特异性，Cas9蛋白作为核酸酶切割与sgRNA互补的基因组DNA，造成双链DNA损伤，随后通过体内的NHEJ(nonhomologous end joining)修复机制引入基因突变。CRISPR/Cas9技术在设计合成上简便快捷，可同时对多个基因进行编辑，成倍地提高了基因编辑效率，因而成为目前最主要的靶向基因编辑技术，被广泛应用于各种动植物的基因功能研究中。
水稻是世界范围内重要的经济作物和主食来源之一，近年来人口的不断剧增和环境的持续恶化，导致世界粮食问题日益严重，因此培育高产、抗逆的优质水稻品种尤为重要。由于水稻雌雄同株，一旦开花就可完成授粉，所以水稻一般较难杂交，而天然雄性不育株的发现和利用拉开了杂交水稻的序幕。杂种优势是指杂合体在一种或多种性状上优于亲本，是自然界中普遍存在的现象，主要表现在产量增加、器官发达以及抗逆性的提高等方面。杂交水稻被誉为“世界第五大发明”，也是“第二次绿色革命”的象征，而水稻不育系是杂交水稻的核心关键。通过基因工程获得雄性不育系具有极为重要的生产价值，同时对世界粮食生产和粮食危机都有举足轻重的影响，因此水稻的育性研究逐渐成为全球关注的热点。
SPOROCYTELESS(SPL)是有胚植物特有的一个转录抑制因子家族，在植物的发育过程中发挥着不同的作用，目前在陆地植物中发现173个成员。该家族成员的N端都含有一个保守的SPL结构域，C端含有一个乙烯反应元件结合因子相关的两亲性抑制(EAR)结构域，因此被命名为SPL-like,EAR-containing(SPEAR)蛋白。拟南芥、水稻和玉米中分别有5个，6个和8个SPEAR蛋白。
目前已有研究报道，SPEAR基因在拟南芥雄性和雌性生殖器官的形成过程中起关键作用，但水稻中OsSPEAR家族在维持水稻育性方面的功能尚不明晰。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用CRISPR/Cas9技术制备水稻Osspear2突变体植株的方法。
本发明的技术方案如下：
一种水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其中，包括步骤：
筛选水稻基因OsSPEAR2的sgRNA靶点序列，所述sgRNA靶点序列如SEQ ID NO.1所示；
根据所述sgRNA靶点序列设计如SEQ ID NO.2所示的上游引物和如SEQ ID NO.3所示的下游引物；
将所述上游引物和下游引物混合并进行退火处理，形成双链DNA；
用限制性内切酶对质粒进行酶切得到线性质粒；
用T4 DNA连接酶连接所述线性质粒和双链DNA得到连接产物，所述连接产物经转化、筛选得到重组质粒；
将所述重组质粒导入相应的浸染细菌中，得到含有重组质粒的浸染细菌，然后用含有重组质粒的浸染细菌侵染水稻愈伤组织；
对经过含有重组质粒的浸染细菌侵染的水稻愈伤组织进行诱导获得再生苗，筛选得到转基因阳性植株，即水稻Osspear2突变体植株。
所述水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其中，所述限制性内切酶为BsaI，所述质粒为pCAMBIA1390。
所述水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其中，所述浸染细菌为农杆菌。
所述水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其中，对经过含有重组质粒的浸染细菌侵染的水稻愈伤组织进行诱导获得再生苗的步骤中，采用潮霉素对水稻愈伤组织进行诱导，得到再生苗。
所述水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其中，筛选得到转基因阳性植株的步骤中，采用抗潮霉素基因引物进行筛选，所述抗潮霉素基因引物序列为：
Hyg-F：5′-CTATTTCTTTGCCCTCGGACGAG-3′；
Hyg-R：5′-ATGAAAAAGCCTGAACTCACCG-3′。
所述水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其中，筛选得到转基因阳性植株之后还包括步骤：
对所述转基因阳性植株进行鉴定，所述鉴定是针对sgRNA靶点序列两侧设计引物进行鉴定，鉴定引物序列为：
SPEAR2-test-F:5′-AAGGAATCTTTAAACATACGAACAG-3′
SPEAR2-test-R:5′-GCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAA-3′。
所述水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其中，对所述转基因阳性植株进行鉴定的步骤包括：
以单株转基因阳性植株的DNA为模板，以SPEAR2-test-F和SPEAR2-test-R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
用限制性内切酶Bsa I酶切所述PCR扩增产物得到酶切产物；
电泳检测所述酶切产物确定突变株。
所述水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其中，还包括步骤：
对所述PCR扩增产物进行测序，获得各突变株的突变基因型。
有益效果：本发明构建pCAMBIA1390-OsSPEAR2-sgRNA重组载体，利用农杆菌介导法导入水稻品种日本晴愈伤组织，以潮霉素抗性标记筛选获得阳性转基因植株，测序法分析鉴定突变单株。通过该方法获得了一种具有重要应用价值的水稻Osspear2突变体，与野生型日本晴相比，制备的Osspear2突变体出现花粉败育的现象，对杂交水稻的生产具有重要应用价值。
附图说明
图1为本发明一种水稻Osspear2突变体植株的制备方法流程图。
图2为pCAMBIA1390-OsSPEAR2-sgRNA载体图谱。
图3为CRISPR/Cas9-sgRNA载体示意图。
图4为Osspear2突变体突变序列与野生型日本晴序列比对分析图。
具体实施方式
本发明提供一种水稻Osspear2突变体植株的制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，图1为本发明提供的一种水稻Osspear2突变体植株的制备方法流程图，如图所示，其包括步骤：
S10、筛选水稻基因OsSPEAR2的sgRNA靶点序列，所述sgRNA靶点序列如SEQ IDNO.1所示；
S20、根据所述sgRNA靶点序列设计如SEQ ID NO.2所示的上游引物和如SEQ IDNO.3所示的下游引物；
S30、将所述上游引物和下游引物混合并进行退火处理，形成双链DNA；
S40、用限制性内切酶对质粒进行酶切得到线性质粒；
S50、用T4 DNA连接酶连接所述线性质粒和双链DNA得到连接产物，所述连接产物经转化、筛选得到重组质粒；
S60、将所述重组质粒导入相应的浸染细菌中，得到含有重组质粒的浸染细菌，然后用含有重组质粒的浸染细菌侵染水稻愈伤组织；
S70、对经过含有重组质粒的浸染细菌侵染的水稻愈伤组织进行诱导获得再生苗，筛选得到转基因阳性植株，即水稻Osspear2突变体植株。
通过本实施例方法获得了一种具有重要应用价值的水稻Osspear2突变体，与野生型日本晴相比，制备的Osspear2突变体出现花粉败育的现象，对杂交水稻的生产具有重要应用价值。
下面通过具体实施例对本发明一种水稻Osspear2突变体植株的制备方法做进一步的解释说明：
实施例1
1、登录到网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html，筛选水稻基因SPL-like,EAR-containing protein 2(SPEAR2：LOC_Os01g11430)的sgRNA靶点序列，所述sgRNA靶点序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：5′-TGCAGTCGAGGTCCGCCGC-3′，所述序列3′端的PAM(原间隔序列临近基序)序列为CGC。
2、根据所述sgRNA靶点序列设计如SEQ ID NO.2所示的上游引物和如SEQ ID NO.3所示的下游引物，其中，SEQ ID NO.2所示的上游引物序列具体为：sgRNA-F：5′-ggcgTGCAGTCGAGGTCCGCCGC-3′；SEQ ID NO.3所示的下游引物序列具体为：下游引物sgRNA-R：5′-aaacGCGGCGGACCTCGACTGCA-3′。
3、分别取上下游引物sgRNA-F和sgRNA-R(终浓度10μM)5μL混合，65℃退火5min后温度缓慢降至室温，形成互补双链DNA，直接用于后续载体的构建。
4、使用Takara宝日医生物技术(北京)有限公司的限制性内切酶Bsa I酶切CRISPR/Cas9表达载体pCAMBIA1390质粒。载体2μg，限制性内切酶2μL，10x buffer 4μL，加dd water至50μL。37℃酶切4h后80℃热处理10min使酶失活；
5、使用天根生化科技(北京)有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将上述酶切产物纯化回收；
6、将所述纯化的酶切产物2μL，互补双链DNA 6μL，T4 DNA连接酶1μL，10x buffer2μL，加dd water至20μL，16℃连接过夜得到连接产物(重组质粒)，所述连接产物的图谱如图2所示，其中，CRISPR/Cas9-sgRNA载体如图3所示。
7、转化大肠杆菌；
7.1、将10μL所述连接产物接入100μL大肠杆菌感受态，混匀，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴5min；
7.2、接种于LB液体培养基，混匀，37℃振荡培养1h；
7.3、转接于LB固体培养基基(含50mg/L卡那霉素)，37℃倒置培养12～16h；
7.4、挑取菌落至LB液体培养基(含卡那霉素)中，37℃振荡培养12～16h。12000rpm离心2min，去上清液，收集菌体以用于质粒提取。
8、提取质粒：按照生产商(天根生化科技有限公司)提供的质粒小量提取试剂盒(货号DP-103-03)中的说明方法提取；
9、凝胶电泳及测序：质粒样品通过琼脂糖凝胶电泳鉴定浓度后，送测序服务公司进行测序，测序引物如下：OsU3-F(5′-AAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATC-3′)。
实施例2
农杆菌介导水稻愈伤组织遗传转化：
1、在质粒序列鉴定正确后，将质粒转化农杆菌，具体步骤如下：
取-80℃保存的农杆菌感受态GV3101于冰上融化；
将4μL质粒加入100μL感受态中，混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min；
加入600μL AB液体培养基，28℃、200rpm震荡避光培养2h；
将上述菌液涂布于AB固体培养基(含卡那霉素、利福平、潮霉素)，28℃倒置培养至形成单菌落。
2、转化愈伤组织：通过农杆菌转化法进行转化，具体步骤为：
1)种子消毒
①水稻成熟种子去壳后置75％乙醇1min，弃乙醇，用无菌水清洗5次；
②在每50mL的2.5％次氯酸钠溶液中滴1滴吐温20混匀，然后放入乙醇处理过的水稻种子，浸泡15min，无菌水清洗5次；
2)种子的接种和愈伤组织诱导
将灭菌后的成熟种子平摆于诱导培养基上，在常光照、32℃条件下培养5-8d。
3)浸染液的制备
刮取AB培养基上的农杆菌，用AAM重悬农杆菌，用AAM稀释至OD600为0.1。
4)愈伤组织侵染和共培养
①取出诱导5-8d的水稻愈伤组织，切去胚乳和芽鞘,将生长状态良好的愈伤组织置于浸染液中，浸泡5-8min；取出愈伤组织，置灭菌滤纸上，吸取愈伤组织表面的侵染液。
②在2N6-AS培养基上铺一层无菌滤纸，并用AAM浸湿，将浸染后的愈伤组织均匀平放于2N6-AS培养基；在25℃、黑暗条件下共培养3d。
5)抗性愈伤的筛选
①将愈伤组织用抑菌液清洗5次，每次浸泡6min左右；倒去洗涤液，将愈伤组织移到无菌滤纸上，尽量蘸干愈伤组织表面的液体；
②将愈伤组织均匀平放于N6D+培养基(含羧苄青霉素和潮霉素)上，32℃、常光照条件下培养，直到新的愈伤组织长出。
6)分化再生
弃除老的愈伤组织，直接将新生的愈伤组织移到RE培养基(含羧苄青霉素和潮霉素)，32℃、常光照培养，7d左右可见绿点，14d可分化出芽。
7)生根培养
将2cm左右的再生芽转入HF培养基(含羧苄青霉素和潮霉素)，由同一粒种子来源的再生苗为一个株系。
8)炼苗及移栽
将生根良好的再生苗从HF培养基中移出，在自来水中培养3-5d，然后种入土中。
实施例3
OsSPEAR2基因突变体筛选鉴定
1、采用TPS法提取转基因植株基因组DNA，TPS提取液配制方法如表1所示：
表1 TPS提取液
试剂 1L体系
1M Tris-HCl(pH8.0) 100mL
0.5M EDTA(pH8.0) 20mL
2M KCl 500mL
dd water 380mL
①剪取一小片水稻叶片放入2mL离心管中，放入小钢珠，加入500μLTPS提取液充分打碎。
②将离心管至于70℃水浴锅中30min后，12000rpm，10min。
③提取上清液转移到新的离心管之中，加入等体积的异丙醇，充分混匀后静置30min后，12000rpm，10min。
④弃上清，加入1mL的75％乙醇清洗，12000rpm，5min。
⑤弃上清，干燥沉淀加入50μL dd水。
2、以提取的上述转基因植株基因组DNA为模板，进行PCR扩增筛选转基因植株，反应添加物体系如表2所示，反应条件体系如表3所示：
表2 PCR反应添加物体系
试剂 20μL体系
2x Tap Master Mix 10μL
DNA模板 1μL
引物1(终浓度10μM) 0.4μL
引物2(终浓度10μM) 0.4μL
dd water 8.2μL
表2中，引物1为抗潮霉素基因引物，其包括如SEQ ID NO.4所示的上游引物序列Hyg-F：5′-CTATTTCTTTGCCCTCGGACGAG-3′，和如SEQ ID NO.5所示的下游引物序列Hyg-R：5′-ATGAAAAAGCCTGAACTCACCG-3′。
表2中，引物2为针对sgRNA靶点序列两侧进行鉴定设计的鉴定引物，包括如SEQ IDNO.6的上游引物序列SPEAR2-test-F:5′-AAGGAATCTTTAAACATACGAACAG-3′，和如SEQ IDNO.7的下游引物序列SPEAR2-test-R:5′-GCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAA-3′。
表3 PCR反应条件体系
步骤 温度 时间
预变性 95℃ 3min
变性 95℃ 30s
退火 58℃ 30s
延伸 72℃ 40s
终止延伸 72℃ 5min
Figure BDA0003259148820000101
表3中，变性、退火和延伸为35个循环。
3)、使用Takara宝日医生物技术(北京)有限公司的限制性内切酶Bsa I酶切上述PCR产物，酶切体系如表4所示：
试剂 20μL体系
PCR产物 10μL
10x buffer 2μL
Bsa I 1μL
dd water 7μL
4)、将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析，将测得的OsSPEAR2基因突变体序列与野生型日本晴序列进行比对分析，结果如图4所示，从图4可以看出，本发明可以获得多种突变基因型的Osspear2突变株。
综上所述，本发明构建pCAMBIA1390-OsSPEAR2-sgRNA重组载体，利用农杆菌介导法导入水稻品种日本晴愈伤组织，以潮霉素抗性标记筛选获得阳性转基因植株，测序法分析鉴定突变单株。通过该方法获得了一种具有重要应用价值的水稻Osspear2突变体，与野生型日本晴相比，制备的Osspear2突变体出现花粉败育的现象，对杂交水稻的生产具有重要应用价值。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 一种水稻Osspear2突变体植株的制备方法
<160> 7
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 1
tgcagtcgag gtccgccgc 19
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 2
ggcgtgcagt cgaggtccgc cgc 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 3
aaacgcggcg gacctcgact gca 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 4
ctatttcttt gccctcggac gag 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 5
atgaaaaagc ctgaactcac cg 22
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 6
aaggaatctt taaacatacg aacag 25
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 7
gcaccgactc ggtgccactt tttcaa 26

Claims (7)

1.一种水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其特征在于，包括步骤：
筛选水稻基因OsSPEAR2的sgRNA靶点序列，所述水稻基因OsSPEAR2的基因座为LOC_Os01g11430，所述sgRNA靶点序列如SEQ ID NO.1所示；
根据所述sgRNA靶点序列设计如SEQ ID NO.2所示的上游引物和如SEQ ID NO.3所示的下游引物；
将所述上游引物和下游引物混合并进行退火处理，形成双链DNA；
用限制性内切酶对质粒进行酶切得到线性质粒；
用T4 DNA连接酶连接所述线性质粒和双链DNA得到连接产物，所述连接产物经转化、筛选得到重组质粒；
将所述重组质粒导入浸染细菌中，所述浸染细菌为农杆菌，得到含有重组质粒的浸染细菌，然后用含有重组质粒的浸染细菌侵染水稻愈伤组织；
对经过含有重组质粒的浸染细菌侵染的水稻愈伤组织进行诱导获得再生苗，筛选得到转基因阳性植株，即水稻Osspear2突变体植株。
2.根据权利要求1所述水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其特征在于，所述限制性内切酶为Bsa I，所述质粒为pCAMBIA1390。
3.根据权利要求1所述水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其特征在于，对经过含有重组质粒的浸染细菌侵染的水稻愈伤组织进行诱导获得再生苗的步骤中，采用潮霉素对水稻愈伤组织进行诱导，得到再生苗。
4.根据权利要求3所述水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其特征在于，筛选得到转基因阳性植株的步骤中，采用抗潮霉素基因引物进行筛选，所述抗潮霉素基因引物序列为：
Hyg-F：5′-CTATTTCTTTGCCCTCGGACGAG-3′；
Hyg-R：5′-ATGAAAAAGCCTGAACTCACCG-3′。
5.根据权利要求1所述水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其特征在于，筛选得到转基因阳性植株之后还包括步骤：
对所述转基因阳性植株进行鉴定，所述鉴定是针对sgRNA靶点序列两侧设计引物进行鉴定，鉴定引物序列为：
SPEAR2-test-F:5′-AAGGAATCTTTAAACATACGAACAG-3′
SPEAR2-test-R:5′-GCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAA-3′。
6.根据权利要求5所述水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其特征在于，对所述转基因阳性植株进行鉴定的步骤包括：
以单株转基因阳性植株的DNA为模板，以SPEAR2-test-F和SPEAR2-test-R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
用限制性内切酶Bsa I酶切所述PCR扩增产物得到酶切产物；
电泳检测所述酶切产物确定突变株。
7.根据权利要求6所述水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其特征在于，还包括步骤：
对所述PCR扩增产物进行测序，获得各突变株的突变基因型。
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