CN113980979B

CN113980979B - 一种可调控烟叶钾含量的NtLHY1基因及其应用

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Publication number: CN113980979B
Application number: CN202111391727.3A
Authority: CN
Inventors: 焦芳婵; 高玉龙; 王丙武; 赵璐; 隋学艺; 宋中邦; 孔光辉; 张谊寒; 吴兴富; 李永平
Original assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Current assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority date: 2021-11-19
Filing date: 2021-11-19
Publication date: 2024-02-09
Anticipated expiration: 2041-11-19
Also published as: CN113980979A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，涉及调控烟叶钾含量的基因，具体涉及一种可调控烟叶钾含量的NtLHY1基因及其应用。本发明提供一种调控烟叶钾含量的NtLHY1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。还提供一种基于所述调控烟叶钾含量的NtLHY1基因的应用，通过CRISPR/cas9敲除该基因后烟叶钾含量与对照相比显著降低，可见NtLHY1基因参与了烟草钾含量的调控。本发明明确了NtLHY1基因对烟叶钾含量的调控功能，为解析烟草钾离子含量的分子调控提机制供了新的证据，也为通过基因表达调控培育钾含量提高的烟草提供新的思路。

Description

一种可调控烟叶钾含量的NtLHY1基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，涉及调控烟叶钾含量的基因，具体涉及一种可调控烟叶钾含量的NtLHY1基因及其应用。

背景技术

烟草是我国重要的叶用性经济作物，烟叶钾含量的高低严重影响着烟叶经济价值的大小。烟叶中的钾离子参与烟叶的生理生化反应，与烟株的抗逆性关系密切，对于烟草农业来说，它还影响着烟叶的内在品质和工业可用性，因此通常把钾含量作为衡量烟叶品质的重要指标。钾对烟叶成熟度、香吃味、燃烧性、安全性等方面均有重要影响，烟叶钾含量提高可以改善烟叶的组织结构，使烟叶结构细腻，而且还能提高烟叶外观色泽，使烟叶呈深橘黄色，香气足，吃味好，富有弹性和韧性，填充性增强；另外钾还可以增强烟叶糖类、色素类、芳香类物质的合成积累，因而钾含量越高，往往烟叶的质量越优。

针对我国烟叶钾含量偏低问题，传统的栽培施肥措施效果并不理想。有研究认为：高钾施用量增加了上部叶中的烟碱含量，如文献胡国松,王志彬,王凌,韩锦峰,穆琳.烤烟烟碱累积特点及部分营养元素对烟碱含量的影响[J].河南农业科学,1999(01):10-14.。也有研究认为：施钾对烟草农艺性状和烟碱含量的影响，结果发现，施钾可提高烟叶中钾含量，促进植株生长，降低烟叶中烟碱含量，如文献舒海燕,杨铁钊,曹刚强,凌华,田保明.烟叶钾含量与烟株农艺性状和烟碱含量的相关分析[J].中国农学通报,2007(02):275-278.。因此，单独依靠栽培施肥措施并不能有效的控制烟叶中的钾含量，因而目前的研究中，着重通过发掘烟草中与钾吸收转运相关基因，达到提高烟叶钾含量的目的。

LHY(Late elongated hypocotyl)是MYB类转录因子，主要调节植物开花时间。如文献，韩慧.鹰嘴豆LATE ELONGATED HYPOCOTYL(LHY)基因的克隆、序列分析及原核重组体构建[D].新疆:新疆农业大学,2014.DOI:10.7666/d.Y2697752.，其是从新疆的一种经济作物鹰嘴豆中克隆生物节律钟LHY的cDNA全长序列，进行序列信息学分析，研究其RNA的相对表达量以及原核表达载体构建，有助于探索光周期途径鹰嘴豆成花的分子调控机制，可作为鹰嘴豆花期调控分子育种的目标基因。或者，类似拟南芥LHY基因突变体表现提早开花表型，如文献，尹晟,傅钰,龙鸿.拟南芥LHY基因超表达与成花转变[J].天津农学院学报,28(2):6.，其揭示了LHY超表达植株可能通过调控miR156和SPL3的表达量来调控成花转变。此外，现有技术中也有利用LHY来增大植物产量的研究，如专利文件CN104903444B-对植物赋予高产性的核酸、制备产量增加的转基因植物的方法、使植物的产量增大的方法，其中揭示了利用具有抑制LHY基因及CCA1基因的转录活性的核酸具有增大水稻、玉米等植物的产量。

虽然在现有技术中利用LHY在调节植物花期或增大产量等作用，但是LHY在调控钾离子含量方面的研究还未见相关报道。

发明内容

为弥补上述领域存在的不足及空白，本发明为调控烟叶钾离子含量并结合LHY克隆鉴定了一个烟草NtLHY1基因，CRISPR/cas9编辑该基因发现，该基因在调控烟草钾离子含量方面发挥功能；并提供了一种可调控烟叶钾含量的NtLHY1基因的应用。本发明研究结果对于解析烟草钾离子含量的分子调控具有重要的参考，也为通过基因表达调控培育钾含量提高的烟草提供新的思路。

本发明请求保护的技术方案如下：

一种可调控烟叶钾含量的NtLHY1基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

一种可调控烟叶钾含量的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；或根据所述的NtLHY1基因编码为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白。

一种可调控烟叶钾含量的NtLHY1基因的应用，其特征在于，使用所述的NtLHY1基因或所述的蛋白在调控烟草钾离子含量中的应用。

一种利用CRISPR/cas9技术敲除所述NtLHY1基因编辑后的烟草，或通过过表达所述NtLHY1基因编辑后的烟草。

优选的，利用CRISPR/cas9技术敲除所述NtLHY1基因并测量编辑后的烟草钾含量得应用中，包括以下过程：

(1)根据所述NtLHY1基因的基因组序列设计靶位点为：

sgRNA:CGTAGCAGCTCCCTCATCAC；

(2)根据步骤(1)中的靶位点设计引物，得到靶位点引物，所述靶位点引物的序列为：

P1：ATTGCGTAGCAGCTCCCTCATCAC；

P2：AAACGTGATGAGGGAGCTGCTACG；

(3)根据步骤(1)中的所述靶位点，在靶位点两侧设计编辑材料的检测引物，得到检测引物，所述检测引物序列为：

NtLHY1-SdF：TTCCATAGAGACACCCAGCTCC；

NtLHY1-SdR：TTGCAAAGACTTTCCTGGGGAC；

(4)制备dsDNA：根据步骤(2)中的所述的靶位点引物通过退火形成互补DNAoligo，得到dsDNA；

(5)酶切pHSE401载体得到酶切产物，将所述酶切产物与步骤(4)中得到的dsDNA进行连接，得到连接产物；

(6)测序验证：将步骤(5)中得到的连接产物转化为大肠杆菌，筛选阳性克隆并进行菌落PCR检测；经PCR检测验证正确的阳性克隆菌株培养扩增后进一步进行测序分析，得到所述CRISPR/cas9载体；

(7)获得编辑材料：利用叶盘法将所述CRISPR/cas9载体转化野生型烟草，利用步骤(3)中的检测引物扩增编辑材料，通过测序获得发生突变材料，突变材料自交后获得纯合突变株系；

(8)测定钾含量：将步骤(7)中的纯合突变体种植于温室，在烟草株开花期，取叶位叶片来检测烟叶钾含量。

优选的，在第(4)步制备dsDNA时，具体反应体系为：包括P1 20μL，P2 20μL，10×Annealing buffer 5μL，灭菌双蒸水5μL；退火程序为：95℃，5min；90℃，1min；80℃，1min；70℃，1min；60℃，1min；50℃，1min；40℃，1min；30℃，1min；20℃，1min；10℃，1min。

优选的，所述酶切产物制备过程包括：利用BsaI酶对pHSE401载体进行酶切，酶切体系包括：质粒5μL，10×buffer 5μL，Bsa I 2μL，灭菌双蒸水38μL；在37℃，酶切1h；酶切后对酶切产物进行电泳检测分析，11520bp条带即为所述酶切产物。

优选的，所述连接产物制备过程包括：利用T4DNA连接酶将所述酶切产物与步骤(4)所制备dsDNA进行连接；连接体系包括：所述酶切产物3μL，所述dsDNA产物10μL，T4 DNAbuffer 2μL，T4 DNA连接酶1μL，灭菌双蒸水4μL；在16℃，过夜连接反应，最终得到所述连接产物。

优选的，在所述第(6)测序验证步骤中，所述菌落PCR检测时，所用引物设计序列为：

U6-26p-F：TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC；

U6-26p-R：AAACCGATTCATCGCAACCAATTC。

优选的，在所述步骤(7)获得编辑材料中，所述叶盘法包括：将得到的所述CRISPR/cas9载体先通过农杆菌转化，得到含有目标载体的农杆菌克隆；再进行烟草转化，将得到的所述含有目标载体的农杆菌克隆培育得到含目标载体的农杆菌LB液体培养基悬浮菌液，加入切片后的无菌野生型烟草叶进行培养后，将培养后的所述无菌野生烟草叶片转入分化培养基中进行培养；待芽长至3～5cm时，切取芽，将切取的芽诱导生根，生根后移植于灭菌的营养土中，得到多株T0代转基因烟草幼苗，即所述CRISPR/cas9载体转化后的野生型烟草。

优选的，在所述第(8)测定钾含量中，是指利用YC/T 173-2003的方法检测烟叶钾含量。

本发明通过系统研究，首次证明了烟草NtLHY1基因在调控烟叶钾含量中的功能。利用CRISPR/cas9编辑材料后的烟草相比含有SEQ ID NO.1序列的烟草叶片钾含量显著降低，降低23％左右。通过本发明研究，表明NtLHY1是烟草钾离子含量的正调控因子，为通过分子手段提高烟叶钾含量提供了新的基因资源。

附图说明

图1为引物对U6-26p-F/U6-26p-R检测CRISPR/cas9载体构建成功电泳图。图中，泳道从左到右分别是：(1)DL2000 DNA Marker(Takara)，(2-3)以质粒DNA为模板的PCR产物。DL2000 DNA Marker(Takara)条带从上到下分别是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；扩增产物大小400bp左右。

图2为引物对NtLHY1-SdF/NtLHY1-SdR扩增编辑材料检测突变位点检测PCR电泳图。图中，泳道从左到右分别是：(1)是DL2000 DNA Marker(Takara)、(2-3)是以提取DNA为模板的PCR产物。DL2000 DNA Marker(Takara)条带从上到下分别是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；扩增大小为606bp。

图3为CRISPR/cas9编辑材料突变信息。

图4为CRISPR/cas9编辑材料测序峰图。

图5为编辑材料与对照烟叶钾离子含量，NtLHY1-CP为编辑材料，CK为对照。

具体实施方式

下面结合实施例进一步描述本发明，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

若未特别说明，以下实施例中使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可；使用的实验方法和实验条件均为本领域常规的实验方法和实验条件，可参考相关实验手册(例如《分子克隆实验指南》)、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有科学技术用语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。

本发明根据烟草基因组测序数据库信息，分离到NtLHY1基因，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示，序列长度为2304bp，编码的氨基酸序列如序列SEQ ID NO：2所示，长度为767氨基酸。

本发明利用CRISPR/cas9技术敲除NtLHY1基因后，可显著降低烟叶钾离子含量。

本发明的烟草NtLHY1基因是烟草钾离子含量正调控因子，通过基因工程技术过表达该基因可达到提高烟叶钾离子含量的效果，从而在提高烟叶钾离子含量中发挥重要作用。

因此，本发明的第一个目的是提供烟草NtLHY1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供所述的烟草NtLHY1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供了所述的烟草NtLHY1基因在调控烟叶钾含量方面的功能，即敲除NtLHY1基因可以降低烟叶钾含量。

本发明的第四个目的是提供了通过分子调控手段，利用所述的烟草NtLHY1基因提高或降低烟草钾含量方面的应用。

实施例1 NtLHY1基因的克隆

1.1实验材料

1.1.1供试菌株

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α，本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

1.1.2供试烟草品种

烟草：云烟87，本实验室保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

1.1.3供试试剂

Phusion高保真扩增酶反应体系，5×Phusion HF反应缓冲液、dNTP、Tris-HCl(PH8)、EDTA、20％SDS、β巯基乙醇、无水乙醇、异丙醇、DNA提取液、10×TAE，以上试剂均采购自生工生物科技(上海)有限公司(http://www.sangon.com)。High-Fidelity DNAPolymerase采自广州胜创生物科技有限公司。/>-Blunt II-TOPO购自Invitrogen公司。

1.1.4供试培养基

LB液体培养基：含有卡那霉素100mg/L和利福平25mg/L。以上培养基都在121℃，20min条件下湿热灭菌。

1.1.5实验仪器

致微(厦门)仪器有限公司GI-54DS自动压力蒸汽灭菌器。上海精宏实验设备有限公司DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱，DNP-90-52电热恒温培养箱。台苏州安泰空气技术有限公司SW-CJ-2FD超净工作台。北京赛多利斯科学仪器有限公司SQP电子分析天平。BackmanOptima L-XP制备型超速离心机。北京鼎昊源科技有限公司HR220 MiniSmart迷你离心机。Eppendorf Centrifuge-54188冷冻离心机。MX-S可调式和固定式混匀仪。卡尤迪生物科技H203-100C加热制冷型金属浴。BIO-RAD Thermal Cycler PCR仪。Milli-Q超纯水系统Millipore。上海医用分析仪器厂TGL-16G制冰机。北京大龙兴创实验仪器有限公司，Bandelin Sonopuls HD 2070超声破碎仪。北京六一仪器厂DYY-12电泳仪。Alliance4.7Chroma Uvitec凝胶成像仪。上海知信ZX-S22双孔不锈钢恒温水浴锅。pro扩增仪。

1.2实验方法

(1)根据烟草行业基因组测序数据库(研究院内部数据)、茄科数据库(https://solgenomics.net/)及拟南芥同源基因，获得烟草NtLHY1基因序列CDS序列信息，设计克隆基因引物，如下所示：

SEQ ID NO：	名称	序列(5’→3’)
			3	NtLHY1-F	ATGGACTCTTATTCCTCTGGAGAG
4	NtLHY1-R	TCAAATAGAAGCTTCTCCTTCCAAG

(2)提取烟草叶片组织RNA，反转录得到第一链cDNA；

(3)以反转录得到的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10μL，10mMdNTP 1μL，2U的High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。PCR反应在/>pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，59℃，30秒，72℃，60秒，35个循环；72℃延伸7分钟；回收和纯化PCR产物；该步骤中所用正反向引物为NtLHY1-F/NtLHY1-R。

(4)纯化产物与载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μL saltsolution、1μL-Blunt II-TOPO(Invitrogen)混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测，筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。

实施例2利用CRISPR/cas9敲除NtLHY1基因降低烟叶钾含量

2.1实验材料

2.1.1供试菌株

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α。农杆菌(Agrobacterium)感受态细胞C58C1。以上生物材料本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

2.1.2供试烟草品种

烟草：野生型烟草云烟87，本实验室保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

2.1.3供试试剂

pHSE401载体、pK2GW7载体、Trans-T1感受态细胞、质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒、植物RNA提取试剂盒、植物基因组提取试剂盒均购白北京全式金生物技术有限公司；LBA4404感受态细胞、CRISPR/Cas9植物表达载体南本实验室保存；LRClonaseTMⅡ enzyme Mix、反转录酶M.MLV、RNA酶抑制剂购自美国Promega公司；T4 DNA连接酶、Bsa I限制性内切酶购自纽英伦生物技术(北京)有限公司；DNeasy Plant Mini Kit购自德国QIAGEN公司；SYBR～Premix Ex Taq II购白宝生物工程(大连)有限公司；Annealing Buffer for DNA Oligos(10x)购自上海碧云天生物技术有限公司；MS粉购自美国PHytoTechnology Laboratories公司；蔗糖、琼脂购自重庆鼎国生物技术有限公司；氨苄青霉素(Ampicillin)、卡那霉素(Kanamycin)、利福平(Rifampicin)等抗生素购自北京索莱宝科技有限公司；引物合成和测序均由北京华大基因科技股份有限公司完成。

2.1.4供试培养基

LB液体培养基：含有卡那霉素100mg/L和利福平25mg/L。所述MS培养基含有6-BA/6-苄氨基嘌呤/α-萘乙酸(0.02mg/L)、NAA(2mg/L)。分化培养基：含有6-BA/6-苄氨基嘌呤(0.5mg/L)、NAA/α-萘乙酸(0.1mg/L)、潮霉素(20mg/L)、头孢霉素(500mg/L)的MS培养基。以上培养基都在121℃，20min条件下湿热灭菌。

2.1.5实验仪器

致微(厦门)仪器有限公司GI-54DS自动压力蒸汽灭菌器。上海精宏实验设备有限公司DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱，DNP-90-52电热恒温培养箱。台苏州安泰空气技术有限公司SW-CJ-2FD超净工作台。北京赛多利斯科学仪器有限公司SQP电子分析天平。BackmanOptima L-XP制备型超速离心机。北京鼎昊源科技有限公司HR220 MiniSmart迷你离心机。Eppendorf Centrifuge-54188冷冻离心机。MX-S可调式和固定式混匀仪。卡尤迪生物科技H203-100C加热制冷型金属浴。BIO-RAD Thermal Cycler PCR仪。Milli-Q超纯水系统Millipore。上海医用分析仪器厂TGL-16G制冰机。北京大龙兴创实验仪器有限公司，Bandelin Sonopuls HD 2070超声破碎仪。北京六一仪器厂DYY-12电泳仪。Alliance4.7Chroma Uvitec凝胶成像仪。上海知信ZX-S22双孔不锈钢恒温水浴锅。

2.2实验方法

2.2.1构建CRISPR/cas9载体

(1)根据NtLHY1基因组序列设计靶位点，如下：

sgRNA:CGTAGCAGCTCCCTCATCAC；

具体的，根据NtLHY1基因序列，利用在线工具ZiFiTTargeter Version4.2纠选择合适的靶位点，筛选要求为：①靶位点主要包括20个碱基，并且这20个碱基后面是NGG(N为任意碱基)3个碱基的PAM区(Protospacer adjacent motif，PAM)；②靶位点尽量选择在基因编码区的前端。

(2)根据步骤(1)中的靶位点设计引物，得到靶位点引物，所述靶位点引物为：

SEQ ID NO：	名称	序列(5’→3’)
			5	P1	ATTGCGTAGCAGCTCCCTCATCAC
6	P2	AAACGTGATGAGGGAGCTGCTACG

(3)根据步骤(1)中的靶位点，在靶位点两侧设计编辑材料的检测引物，得到检测引物，所述检测引物为：

SEQ ID NO：	名称	序列(5’→3’)
			7	NtLHY1-SdF	TTCCATAGAGACACCCAGCTCC
8	NtLHY1-SdR	TTGCAAAGACTTTCCTGGGGAC

扩增长度为606bp。

(4)制备dsDNA：根据步骤(2)中的得到的靶位点引物通过退火形成互补DNAoligo，得到dsDNA；具体反应体系为：反应体系50μL，包括P1 20μL，P2 20μL，10×Annealingbuffer 5μL，灭菌双蒸水5μL。退火程序为：95℃，5min；90℃，1min；80℃，1min；70℃，1min；60℃，1min；50℃，1min；40℃，1min；30℃，1min；20℃，1min；10℃，1min。

具体步骤为：利用BsaI酶对pHSE401载体进行酶切，酶切体系50μL，包括：质粒5μL，10×buffer 5μL，Bsa I 2μL，灭菌双蒸水38μL，37℃酶切1h；

酶切后对酶切产物进行电泳检测分析，可见1200bp和11520bp两个条带，回收11520bp的酶切产物备用；

利用T4DNA连接酶将所回收的大片段酶切产物与步骤(4)所制备dsDNA进行连接，连接体系20μL：所回收载体酶切产物3μL，退火所形成dsDNA产物10μL，T4 DNA buffer 2μL，T4 DNA连接酶1μL，灭菌双蒸水4μL，16℃过夜连接，得到连接产物；

(6)测序验证：将步骤(5)中得到的连接产物转化为大肠杆菌，筛选阳性克隆(pHSE401载体抗性为卡那霉素)并进行菌落PCR检测；所述菌落PCR检测时，所用引物设计为:

SEQ ID NO：	名称	序列(5’→3’)
			9	U6-26p-F	TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC
10	U6-26p-R	AAACCGATTCATCGCAACCAATTC

PCR体系如下：

PCR程序如下：

其中，退火温度根据引物自身温度调整。然后将PCR产物取出，用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。经PCR检测验证正确的阳性克隆菌株培养扩增后进一步进行测序分析，如图1所示，引物对U6-26p-F/U6-26p-R检测CRISPR/cas9载体构建成功电泳图，得到pHSE401-LHY1载体，扩增产物大小400bp左右；测序时所用引物为上述U6-26p-F。

利用叶盘法将所述CRISPR/cas9载体转化野生型烟草，利用步骤(3)中的检测引物扩增编辑材料，通过测序获得发生突变材料，突变材料自交后获得纯合突变株系。

为了便于理解本发明，这里对叶盘法进行说明。叶盘法是一种简单易行的植物细胞转化、选择与再生的方法。植物细胞利用Ti转化常用的方法。具体做法是:先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒，再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片，即叶盘。为了对叶盘进行接种处理，需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4～5min,然后用滤纸吸干，放在看护培养基上进行培养，注意需将叶子背面接触培养基。所谓看护培养基，是特定的固体培养基上均匀分布一层胡萝卜细胞或其他细胞的悬浮液，然后覆盖一层滤纸即成。叶盘在看护培养基上培养两天后，转移到含有适当抗生素的选择培养基上进行培养。经过数周后，叶盘周围会长出愈伤组织并分化出幼苗。对这些幼苗的进一步检测可以确定它们是否含外源基因以及外源基因的表达情况。叶盘法实际上是对共培养法加以改进后而创立的一种转化方法。用农杆菌感染叶片外植体并短期共培养。在培养过程中，农杆菌的vir基因被诱导，它的活化可以启动T-DNA向植物细胞的转移。共培养后，也要进行转化的外植体的筛选、愈伤组织的培养、诱导分化等步骤，以得到再生植株。叶盘法由于不需进行原生质体操作等，方法简单，获得转化植株也更快，是用植物外植体为材料进行转基因的一个良好途径。

2.2.2农杆菌转化

将农杆菌感受态细胞C58C1溶解后加入2.2.1构建CRISPR/cas9载体步骤(6)中得到的载体pHSE401-LHY1进行农杆菌转化，得到含有目标载体的农杆菌克隆。具体为：从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞(C58C1)，放置冰上溶解后加入载体pHSE401-LHY1 4μL；液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟，再冰浴2分钟，向混合物中加入1mL LB液体培养基，28℃、220rpm培养3～4小时；培养物涂布于含有卡那霉素100mg/L和利福平25mg/L的LB固体培养基上，28℃倒置培养2～3天，可见含有目标载体的农杆菌克隆。

2.2.3烟草转化

将得到的含有目标载体的农杆菌克隆经划线接种后，在含有卡那霉素和利福平的LB培养基中进行扩繁，得到含目标载体的农杆菌LB液体培养基悬浮菌液；具体为：挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有卡那霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2-3天；刮取划线菌斑接菌于含有卡那霉素和利福平的LB培养基中，28℃，220rpm震荡培养，菌液浓度达到OD＝0.5～0.8时进行侵染。

取野生型烟草叶片利用乙醇和HgCl₂处理后用无菌水进行冲洗，并吸去烟草叶片表面液体，得到无菌野生型烟草叶片；具体为：将野生型烟草叶片置于500mL广口瓶中，加入适量75％乙醇，漂洗1min；弃乙醇，加入0.1％的HgCl₂溶液，置摇床上室温振荡15～30分钟；弃溶液，用无菌水冲洗6遍。

将得到的无菌野生型烟草叶片切成小片后，放入含目标载体的农杆菌LB液体培养基悬浮菌液中进行培养后，将烟草叶片转入分化培养基中进行培养，直至烟草叶片切口处逐渐形成愈伤组织并分化出芽；具体为：将得到的无菌野生型烟草叶片取出，用无菌吸水纸洗去表面液体，取无菌叶片用剪刀切成1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的农杆菌LB液体培养基悬浮菌液中，静置15～20min；取出烟草叶片，用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-BA(0.02mg/L)、NAA(2mg/L)的MS培养基中25℃暗培养两天；将烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，分化培养基为含有6-BA(0.5mg/L)、NAA(0.1mg/L)、潮霉素(20mg/L)、头孢霉素(500mg/L)的MS培养基，每2～3周继代一次，切口处逐渐形成愈伤组织，最后分化出芽。待芽长至3～5cm时，切取芽，将切取的芽诱导生根，生根后移植于灭菌的营养土中，得到多株T0代转基因烟草幼苗；具体为；将长至3～5cm的芽切下，转入MS培养基诱导生根，生根后的转基因植株由生根培养基中取出，用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中。

2.2.4测序筛选编辑材料

待转基因植株在营养土中的T0代转基因烟草幼苗生长1周后，选取叶片提取DNA，经扩增后得扩增产物，扩增产物纯化后利用正向引物测序，经对测序结果进行分析，获得一株NtLHY1基因在编辑位点缺失1个碱基T的编辑材料；种植该编辑材料得T1代植株，通过测序筛选纯合突变单株并收种，获得具有NtLHY1纯合突变的T2代烟草种子。

具体为：待T0代转基因苗生长1周左右，选取20株烟苗取叶片并利用DNeasy PlantMini Kit(QIAGEN)提取DNA，利用2.2.1构建CRISPR/cas9载体中的步骤(3)中设计的引物NtLHY1-SdF/SdR进行扩增(如图2所示，编辑材料突变位点检测PCR电泳图，扩增大小为606bp)，扩增产物纯化后利用正向引物测序。如图3所示，为CRISPR/cas9编辑材料突变信息，对测序结果分析，获得一株NtLHY1基因缺失1个碱基T的编辑材料。种植该编辑材料T1代植株，通过测序筛选纯合突变单株(如图4所示，为CRISPR/cas9编辑材料测序峰图)并收种获得T2代种子。

对得到的具有NtLHY1纯合突变的T2代烟草种子在温室进行种植，得到T2代烟草株系，利用YC/T 173-2003的方法检测植株烟叶钾含量；具体为：在温室种植得到的突变体株系与野生型烟草植株对照，在烟株开花期，取9-11叶位叶片(从下部计算)，杀青烘干，利用YC/T173-2003的方法检测烟叶钾含量。

对得到的具有NtLHY1纯合突变的T2代烟草种子在温室进行种植，得到T2代烟草株系，利用YC/T 173-2003的方法检测植株烟叶钾含量；具体为：在温室种植得到的突变体株系与野生型烟草植株对照，在烟株开花期，取9-11叶位叶片(从下部计算)，杀青烘干，利用YC/T173-2003的方法检测烟叶钾含量。YC/T 173-2003是指烟草及烟草制品中钾的测定，也称火焰光度法。

如图5所示，NtLHY1-CP为编辑材料，CK为对照；编辑材料的T2代烟草NtLHY1-CP，与含有SEQ ID NO.1序列的烟草叶片CK相比，钾含量显著降低，降低23％左右。

除上述具体实施过程外，这里需要注意的是，本发明还提供了一种利用CRISPR/cas9技术敲除所述NtLHY1基因编辑后的烟草，其烟叶钾含量显著降低；当然还可以获得通过过表达所述NtLHY1基因编辑后的烟草。

以上描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

序列表

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 一种可调控烟叶钾含量的NtLHY1基因及其应用

<130> 20211118

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2304

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggactctt attcctctgg agaggaactt gttgttaaga caaggaaacc ttataccatc 60

actaagcaac gagagcgatg gacagaggag gaacacaata gattcctaga agccttgaaa 120

ctctatgggc gtgcttggca gcgcatagaa gaacacatag gaacaaaaac tgccgtgcag 180

atcagaagtc atgcgcaaaa attctttaca aagttagaaa aggaggctgt tataaaggga 240

gtcccaataa gtcaagcact tgacattgaa attcctcctc cgcgacctaa aaggaaacca 300

agtaatcctt atcctcgtaa gaccagcgta gcagctccct catcacaggt gggaataaaa 360

gatggaaaat tatcaacacc tttttcttcc atctgtgagg ataggaactt atttgacctg 420

gagaaagaac cgattactga gaaacctggt agaaacgaga agctgggcag tgtacaagaa 480

aaccagaaca agaaaaattg ctcccaaggg ttcgctcttt tcaaggaagg tgcttctgcc 540

ccctccctgt ccccaggaaa gtctttgcaa acacttgcag aacctgcagg atcatgcact 600

ttaaatgagt ctttgcctgc cactaaagga gtgattaacc atgatgtaac agctaaatct 660

tttcttactg ttggatccaa agagcatcaa aagttgaata tactcgacgc taaacagtcc 720

tttcaaagta acagctcttg taacaccttc aacgagggga aatcttgcca atcgaatgag 780

aagttggcac aagatgagaa aaaagatcaa ccgagtcagc cagatcattt tgggaaattc 840

tcaagaaatg atatgcaagt gccacaccac tatccaagac atgtcccagt gcatattctt 900

gatggggcct taggggtgag tggtgctcaa acaaccccag atatgtttta tcctgaatct 960

gtaagtcacc agataggtgg cgtccaggga ctctcaaatt tgtataccaa ccctacttca 1020

tctgccacat ctgagcacca tagtaatgct gcaatgtctt ccattcatca gtcatttcct 1080

tgtttccacc ctaacttcac ccctattcat gatccagatg attaccgatc gtttcttcaa 1140

ctctcctcca ctttctccag ccttatattt tctgcgttat tgcaaaaccc agcagcacat 1200

gctgcagcaa gttttgcagc tagcttttgg ccttatgcaa atatggaagc tccagtagat 1260

tctccaacag gtaacactgc aagccagatt aattcagctc ctagtatggc agcaattgct 1320

accgccactg tagcagctgc aactgcatgg tgggcagccc atgggctcct accattgtgt 1380

tcgccatttc atagcagttc tacccgtgtt cctacatctg caacatcaat gcaagtggat 1440

ccctgtcaac ctagtgtagg caagaatgaa ggaagagagg gatctcataa ttctccccat 1500

gctcaacaaa ccgtcccaga ttgctctgaa gctttgcaag aacatcattc tgcttctgag 1560

ttgcctactt cgccatcgtc agaatcggag gacagtgaag gtaggaagct aaaaactggg 1620

ttaaccgcta atgatactga gcaaggcgct gcagtcactg aaattcatga gccaaacaca 1680

ggaaacggaa gaaaacaggt agaccgttct tcctgtggtt ccaacacacc ttcaagtagt 1740

gatttggaga cagatgcttt ggagaaggat gagaaaggga aagaagagcc tcaagaacct 1800

aatgttaacc ttctagctgg agatgctggg aatcggcgtg gtaggaattg catcagtcca 1860

aatgattttt ggaaagaagt ctccgaaggg ggacggatag cgttccaggc tcttttcacc 1920

agagagaagt tgcctcaaag cttttctcct tcaaatgatc tgaaaaataa gggaaaaatc 1980

aatcttgaaa acgttaagga aaagccagac gagaaaggtc taagtggatc gcagttagac 2040

cttattgatc aggcatccga tatgtgttcc agtcatcaag cagtggaaga taatgtgtta 2100

gtaattggca acaaagaaga tgctgaaaaa tgcctgccaa taatggaact tggacaagta 2160

aggttgaaag ctcgccgtac tggatttaaa ccttacaaga ggtgctcatt ggaggccaaa 2220

gatagcaggg tgacaagttc aagctgtcaa gacgaggaaa aaagcgccaa gagacttcgc 2280

ttggaaggag aagcttctat ttga 2304

<210> 2

<211> 767

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asp Ser Tyr Ser Ser Gly Glu Glu Leu Val Val Lys Thr Arg Lys

1 5 10 15

Pro Tyr Thr Ile Thr Lys Gln Arg Glu Arg Trp Thr Glu Glu Glu His

20 25 30

Asn Arg Phe Leu Glu Ala Leu Lys Leu Tyr Gly Arg Ala Trp Gln Arg

35 40 45

Ile Glu Glu His Ile Gly Thr Lys Thr Ala Val Gln Ile Arg Ser His

50 55 60

Ala Gln Lys Phe Phe Thr Lys Leu Glu Lys Glu Ala Val Ile Lys Gly

65 70 75 80

Val Pro Ile Ser Gln Ala Leu Asp Ile Glu Ile Pro Pro Pro Arg Pro

85 90 95

Lys Arg Lys Pro Ser Asn Pro Tyr Pro Arg Lys Thr Ser Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Ser Gln Val Gly Ile Lys Asp Gly Lys Leu Ser Thr Pro Phe

115 120 125

Ser Ser Ile Cys Glu Asp Arg Asn Leu Phe Asp Leu Glu Lys Glu Pro

130 135 140

Ile Thr Glu Lys Pro Gly Arg Asn Glu Lys Leu Gly Ser Val Gln Glu

145 150 155 160

Asn Gln Asn Lys Lys Asn Cys Ser Gln Gly Phe Ala Leu Phe Lys Glu

165 170 175

Gly Ala Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Leu Gln Thr Leu

180 185 190

Ala Glu Pro Ala Gly Ser Cys Thr Leu Asn Glu Ser Leu Pro Ala Thr

195 200 205

Lys Gly Val Ile Asn His Asp Val Thr Ala Lys Ser Phe Leu Thr Val

210 215 220

Gly Ser Lys Glu His Gln Lys Leu Asn Ile Leu Asp Ala Lys Gln Ser

225 230 235 240

Phe Gln Ser Asn Ser Ser Cys Asn Thr Phe Asn Glu Gly Lys Ser Cys

245 250 255

Gln Ser Asn Glu Lys Leu Ala Gln Asp Glu Lys Lys Asp Gln Pro Ser

260 265 270

Gln Pro Asp His Phe Gly Lys Phe Ser Arg Asn Asp Met Gln Val Pro

275 280 285

His His Tyr Pro Arg His Val Pro Val His Ile Leu Asp Gly Ala Leu

290 295 300

Gly Val Ser Gly Ala Gln Thr Thr Pro Asp Met Phe Tyr Pro Glu Ser

305 310 315 320

Val Ser His Gln Ile Gly Gly Val Gln Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Thr

325 330 335

Asn Pro Thr Ser Ser Ala Thr Ser Glu His His Ser Asn Ala Ala Met

340 345 350

Ser Ser Ile His Gln Ser Phe Pro Cys Phe His Pro Asn Phe Thr Pro

355 360 365

Ile His Asp Pro Asp Asp Tyr Arg Ser Phe Leu Gln Leu Ser Ser Thr

370 375 380

Phe Ser Ser Leu Ile Phe Ser Ala Leu Leu Gln Asn Pro Ala Ala His

385 390 395 400

Ala Ala Ala Ser Phe Ala Ala Ser Phe Trp Pro Tyr Ala Asn Met Glu

405 410 415

Ala Pro Val Asp Ser Pro Thr Gly Asn Thr Ala Ser Gln Ile Asn Ser

420 425 430

Ala Pro Ser Met Ala Ala Ile Ala Thr Ala Thr Val Ala Ala Ala Thr

435 440 445

Ala Trp Trp Ala Ala His Gly Leu Leu Pro Leu Cys Ser Pro Phe His

450 455 460

Ser Ser Ser Thr Arg Val Pro Thr Ser Ala Thr Ser Met Gln Val Asp

465 470 475 480

Pro Cys Gln Pro Ser Val Gly Lys Asn Glu Gly Arg Glu Gly Ser His

485 490 495

Asn Ser Pro His Ala Gln Gln Thr Val Pro Asp Cys Ser Glu Ala Leu

500 505 510

Gln Glu His His Ser Ala Ser Glu Leu Pro Thr Ser Pro Ser Ser Glu

515 520 525

Ser Glu Asp Ser Glu Gly Arg Lys Leu Lys Thr Gly Leu Thr Ala Asn

530 535 540

Asp Thr Glu Gln Gly Ala Ala Val Thr Glu Ile His Glu Pro Asn Thr

545 550 555 560

Gly Asn Gly Arg Lys Gln Val Asp Arg Ser Ser Cys Gly Ser Asn Thr

565 570 575

Pro Ser Ser Ser Asp Leu Glu Thr Asp Ala Leu Glu Lys Asp Glu Lys

580 585 590

Gly Lys Glu Glu Pro Gln Glu Pro Asn Val Asn Leu Leu Ala Gly Asp

595 600 605

Ala Gly Asn Arg Arg Gly Arg Asn Cys Ile Ser Pro Asn Asp Phe Trp

610 615 620

Lys Glu Val Ser Glu Gly Gly Arg Ile Ala Phe Gln Ala Leu Phe Thr

625 630 635 640

Arg Glu Lys Leu Pro Gln Ser Phe Ser Pro Ser Asn Asp Leu Lys Asn

645 650 655

Lys Gly Lys Ile Asn Leu Glu Asn Val Lys Glu Lys Pro Asp Glu Lys

660 665 670

Gly Leu Ser Gly Ser Gln Leu Asp Leu Ile Asp Gln Ala Ser Asp Met

675 680 685

Cys Ser Ser His Gln Ala Val Glu Asp Asn Val Leu Val Ile Gly Asn

690 695 700

Lys Glu Asp Ala Glu Lys Cys Leu Pro Ile Met Glu Leu Gly Gln Val

705 710 715 720

Arg Leu Lys Ala Arg Arg Thr Gly Phe Lys Pro Tyr Lys Arg Cys Ser

725 730 735

Leu Glu Ala Lys Asp Ser Arg Val Thr Ser Ser Ser Cys Gln Asp Glu

740 745 750

Glu Lys Ser Ala Lys Arg Leu Arg Leu Glu Gly Glu Ala Ser Ile

755 760 765

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggactctt attcctctgg agag 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaaatagaa gcttctcctt ccaag 25

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

attgcgtagc agctccctca tcac 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaacgtgatg agggagctgc tacg 24

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttccatagag acacccagct cc 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttgcaaagac tttcctgggg ac 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgtcccagga ttagaatgat taggc 25

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaaccgattc atcgcaacca attc 24

Claims

1.一种调控烟叶钾含量的NtLHY1基因的应用，其特征在于，所述NtLHY1基因的序列如序列1所示，所述应用为使用NtLHY1基因或其编码的蛋白在调控烟叶钾离子含量中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用CRISPR/cas9技术敲除所述NtLHY1基因并测量编辑后的烟叶钾含量的应用，包括以下过程：

（1）根据所述NtLHY1基因的基因组序列设计靶位点为：

CGTAGCAGCTCCCTCATCAC；

（2）根据步骤（1）中的靶位点设计引物，得到靶位点引物，所述靶位点引物的序列为：

P1：ATTGCGTAGCAGCTCCCTCATCAC；

P2：AAACGTGATGAGGGAGCTGCTACG；

（3）根据步骤（1）中的所述靶位点，在靶位点两侧设计编辑材料的检测引物，得到检测引物，所述检测引物序列为：

NtLHY1-SdF：TTCCATAGAGACACCCAGCTCC；

NtLHY1-SdR：TTGCAAAGACTTTCCTGGGGAC；

（4）制备dsDNA：根据步骤（2）中的所述的靶位点引物通过退火形成互补DNA oligo，得到dsDNA；

（5）酶切pHSE401载体得到酶切产物，将所述酶切产物与步骤（4）中得到的dsDNA进行连接，得到连接产物；

（6）测序验证：将步骤（5）中得到的连接产物转化为大肠杆菌，筛选阳性克隆并进行菌落PCR检测；经PCR检测验证正确的阳性克隆菌株培养扩增后进一步进行测序分析，得到CRISPR/cas9载体；

（7）获得编辑材料：利用叶盘法将所述CRISPR/cas9载体转化野生型烟草，利用步骤（3）中的检测引物扩增编辑材料，通过测序获得发生突变材料，突变材料自交后获得纯合突变株系；

（8）测定钾含量：将步骤（7）中的纯合突变体种植于温室，在烟草株开花期，取叶位叶片来检测烟叶钾含量。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在第（4）步制备dsDNA时，具体反应体系为：包括P1 20μL，P2 20μL，10×Annealing buffer 5μL，灭菌双蒸水5μL；退火程序为：95℃，5min；90℃，1 min；80℃，1 min；70℃，1 min；60℃，1 min；50℃，1min；40℃，1 min；30℃，1min；20℃，1 min；10℃，1 min。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述酶切产物制备过程包括：利用BsaI酶对pHSE401载体进行酶切，酶切体系包括：质粒 5μL，10×buffer 5μL，Bsa I 2μL，灭菌双蒸水38μL；在37℃，酶切1h；酶切后对酶切产物进行电泳检测分析， 11520bp条带即为所述酶切产物。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述连接产物制备过程包括：利用T4DNA连接酶将所述酶切产物与步骤(4)所制备dsDNA进行连接；连接体系包括：所述酶切产物 3μL，所述dsDNA产物 10μL，T4 DNA buffer 2μL，T4 DNA 连接酶 1μL，灭菌双蒸水 4μL；在16℃，过夜连接反应，最终得到所述连接产物。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在所述第（6）测序验证步骤中，所述菌落PCR检测时，所用引物设计序列为：

U6-26p-F：TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC；

U6-26p-R：AAACCGATTCATCGCAACCAATTC。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在所述第（8）测定钾含量中，是指利用YC/T173-2003的方法检测烟叶钾含量。