CN113024648B

CN113024648B - 一种玉米的热激转录因子ZmHsf05及其应用

Info

Publication number: CN113024648B
Application number: CN202110250087.8A
Authority: CN
Inventors: 司伟娜; 梁齐志; 江海洋; 宋菲扬; 程振; 龙运; 谢珊珊; 彭晓剑
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2021-03-07
Filing date: 2021-03-07
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2041-03-07
Also published as: CN113024648A

Abstract

本发明公开了一种玉米的热激转录因子ZmHsf05及其应用。所述的热激转录因子ZmHsf05的核苷酸序列如SEQID No.1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQID No.2所示。ZmHsf05基因可被干旱及高温等逆境胁迫诱导高表达。通过农杆菌介导的方法将ZmHsf05基因转入野生型水稻中，结果显示过量表达ZmHsf05基因明显提高了转基因水稻的抗旱能力。

Description

一种玉米的热激转录因子ZmHsf05及其应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一种玉米的热激转录因子ZmHsf05及其应用。

背景技术

随着环境问题日益严峻，大多数国家和地区遭受了不同程度的旱灾(Lesk etal.,2016)。水稻及玉米等禾本科作物需水量较大、对干旱胁迫敏感，全生育期过程都可遭受干旱胁迫，水资源的短缺及不均匀分布，使水资源成为中国、乃至全世界农业生产的限制因素(Wang et al.,2020)。干旱也是影响水稻、玉米等农作物产量及品质的重要因素之一。因此，解析植物响应干旱胁迫的分子机制，发掘耐旱新基因，以及培育耐旱新品种，对于农业生产有重要的理论及实践意义。

植物经受干旱胁迫，会产生系统性的生理生化反应，从而形成了复杂、完整的响应干旱胁迫的作用机制。当植物感受到干旱信号，会通过ABA依赖或者非依赖途径，激活在逆境胁迫中起着承上启下关键作用的转录因子的表达，转录调控下游一系列基因，以应对干旱胁迫。

热激转录因子(heat stress transcription factors,HSFs)是植物逆境应答反应中重要的调控因子(Guo et al.,2016；Ohama et al.,2016)，可转录调控下游众多响应逆境胁迫的基因。植物HSFs蛋白N端具有保守的DNA结合域(DNA binding domain,DBD)和寡聚结构域(oligomerization domain,OD)，其中DBD可特异热激元件(heat stresselements,HSEs)结合。与热激转录因子HSF的命名一致，HSFs早期的功能报道集中于其对植物响应高温胁迫的关键调控作用。后续研究表明，HSFs在干旱、盐及强光等胁迫方面也发挥重要的作用。HSFA3,HSFA4和HSFA9都被报道在干旱胁迫中发挥重要作用。在苹果中，MdHSFA8a可通过提高类黄酮的积累以及加速活性氧的积累，以提高植株在干旱条件下的存活率。并且MdHSFA8a参与ABA诱导的气孔关闭、转录激活ABA信号转导相关基因的表达量(Wang et al.,2020)。

环境问题的日益严峻、水资源的短缺及不均匀分布，使农业生产面临严峻挑战。作为全球四大粮食作物，玉米及水稻的需水量极大，而培育耐旱新种质及品种，对于保障粮食安全有重要意义(Jiang et al.,2018)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于玉米的热激转录因子ZmHsf05及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种玉米的热激转录因子ZmHsf05，所述的玉米的热激转录因子ZmHsf05具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明所述的玉米的热激转录因子ZmHsf05编码的蛋白质，为如下(1)或(2)所述的蛋白质：

(1)由序列表中的SEQI D No.2氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中的SEQI D No.2氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代和/或添加且具有玉米ZmHsf05基因功能由(1)衍生的蛋白质。

本发明的含有所述的玉米的热激转录因子ZmHsf05的植物表达载体和/或重组菌。

本发明的用于克隆所述的玉米的热激转录因子ZmHsf05的引物对，其特征在于：所述的引物对包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明所述的玉米的热激转录因子ZmHsf05、所述的蛋白或所述的植物表达载体或重组菌在a)-b)至少一项中的应用：

a)能够提高植物对PEG引起的干旱胁迫的抗性，增加脯氨酸含量；

b)在植物受到土壤干旱胁迫时，提高植物的存活率。

进一步地，将ZmHsf05基因或者含有上述ZmHsf05基因的植物表达载体和/或重组菌导入目标植物或植物组织，并使ZmHsf05基因过量表达。

本发明的一种所述的抗旱作物品种的培育方法，将ZmHsf05基因转入出发植株中，获得抗旱作物；或者上调出发植株基因组中ZmHsf05基因的表达量，筛选制得抗旱植物。

进一步地，培育方法采用农杆菌介导法和基因枪轰击法。

进一步地，所述的抗旱植物为水稻。

有益效果：本发明首次发现了ZmHsf05在植物抗旱信号中发挥重要的作用，为培育抗旱作物新品种提供了新的基因资源、思路与方向。

附图说明

图1为本发明的ZmHsf05组织特异性表达分析及诱导表达模式分析图；

图2为本发明的实施例6转基因水稻和野生型水稻在受到高渗胁迫前后的表型示意图；

图3为本发明实施例6转基因水稻和野生型水稻在受到高渗胁迫前后的脯氨酸含量图；

图4为本发明实施例6转基因水稻和野生型水稻在干旱前后，以及复水后三天的表型示意图；

图5为本发明实施例转基因水稻和野生型水稻在干旱前后的存活率统计图。

具体实施方式

通过解释以下本申请的优选实施方案，本发明的其他目的和优点将变得清楚。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限值和下限值之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述的范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限值和下限值可独立地包括或排除在范围内。

在植物基因组数据库网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)，得到对玉米ZmHsf05基因的CDS序列全长(SEQ ID No.1)以及蛋白序列(SEQ ID No.2)。

实施例1

本发明的一种玉米的热激转录因子ZmHsf05，所述的玉米的热激转录因子ZmHsf05具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

(1)由序列表中的SEQI D No.2氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在植物受到土壤干旱胁迫时，提高植物的存活率。

将ZmHsf05基因或者含有上述ZmHsf05基因的植物表达载体和/或重组菌导入目标植物或植物组织，并使ZmHsf05基因过量表达。

培育方法采用农杆菌介导法和基因枪轰击法。

所述的抗旱植物为玉米。

一个玉米热激转录因子ZmHsf05基因编码序列

实施例2

玉米热激转录因子ZmHsf05组织表达模式分析

1.玉米叶片total RNA的提取：

将在温度(白/黑)为28℃/22℃，光周期(光/暗)为18/6h的温室中长势优良的B73玉米种苗培养到三叶期，取玉米的根、茎、叶、花丝、雄蕊五个不同组织放入液氮中快速冷冻，并用相关试剂快速对其进行磨样，提取RNA，通过将获得RNA进行反转录合成cDNA后，放入-80℃超低温冰箱中保存备用。

2.引物设计：

根据ZmHsf05的cDNA序列全长，利用oligo7软件设计荧光定量试验的引物：

qPCR-ZmHsf05-F：5’-GAGTGCCGCCAACAATA-3’；

qPCR-ZmHsf05-R：5’-CCACCTTTCTGAAGCCATA-3’。

用PCR对其特异性进行检测，在确保PCR特异性扩增前提下，方可使用。以玉米内参基因为荧光定量试验的阳性对照，内参基因基因的引物为：

ZmActin-F：5’-GGGATTGCCGATCGTATGAG-3’；

ZmActin-R：5’-GAGCCACCGATCCAGACACT-3’。

3.荧光定量PCR：

荧光定量PCR反应体系如下：

PCR反应参数如下：

反应结束后，对产物进行加热，获得产物的溶解曲线。采用2^–ΔΔCT法对获得的信号和数据进行处理(图1)。

实施例3

ZmHsf05基因诱导表达模式分析

将在温度(白/黑)为28℃/22℃，光周期(光/暗)为18/6h的温室中长势优良的B73玉米种苗培养到三叶期，分别其进行各种模拟环境胁迫的处理。

1.将三叶期玉米放入42℃光照培养箱中处理，分别在0h,1h,3h,6h,12h,24h对玉米叶片取样，-80℃冰箱储存备用。

2.将100μmol/L ABA喷洒在玉米叶片表面，在喷洒处理后0h,1h,3h,6h,12h,24h对玉米进行取样，快速冷冻在液氮中，-80℃冰箱储存备用。

3.同样的，将浓度20％的PEG6000和0.2mol/L的NaCl分别浇灌到玉米中，在0h,1h,3h,6h,12h,24h进行玉米叶片的取样，将样品迅速置于液氮中，-80℃冰箱储存。

以上处理每个样品取三株玉米进行混合样品，重复三到四次。后续RNA提取及定量方法与实施案例2一致(图1)。

实施例4

ZmHsf05克隆

根据玉米基因组网站上公布的Hsf05基因的CDS序列，设计PCR扩增该片段的引物。

引物序列如下：

ZmHsf05-Kpn I F:GGGGTACCATGAGCCACGGGAACGGGAT

ZmHsf05-Xba I R:GCTCTAGACTAATGTCTGGGTCCATGTTGTTTC

以玉米叶片total RNA反转录第1链cDNA为模板，用上游引物和下游引物进行PCR扩增，PCR反应体系如表1所示：

表1

PCR反应条件为：预变性：98℃10min；变性：98℃10s；退火：55℃40s延伸：72℃65s，30个循环；总延伸：72℃10min。

反应结束后，吸取PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳(图3)，在凝胶成像系统中检测和切胶后，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，将DNA回收结果进行测序。

实施例5

玉米ZmHsf05基因的过表达载体的构建

将测序正确的目的基因片段ZmHsf05与1301a载体片段，用T4DNA连接酶进行连接，16℃连接1-2h，连接体系如表2所示：

表2

取5～10μL的构建好的载体pCAMBIA1301a-Hsf05质粒轻轻导入100μL EHA105农杆菌感受态细胞中，进行农杆菌的转化。

实施例6

将植物过表达载体pCAMBIA1301a–ZmSWEET4a转化野生型水稻

1.中花11(ZH11)水稻种子剥壳，利用50％次氯酸钠和0.1％吐温的消毒灭菌，用灭菌水反复洗涤5～8遍，将水稻种子表面的消毒水

2.将种子铺在提前准备好的诱导培养基上，盖好盖子之后，置于28～30℃的全光照培养室诱导15d左右，诱导愈伤组织形成。

3.将含有重组质粒ZmHsf05-p1301a的农杆菌菌株加入到含有50mg/L Rif和50mg/L Kan的5mL的YEP培养基中，在28℃，220r/min的摇床中培养18～20h。

4.按1:50的比例将菌液转接到共培养培养基中(加入50mg/L Rif和50mg/L Kan)，培养至菌液OD600＝1.0。离心后，共培养液体培养基重新悬浮菌体至OD600＝0.6。

5.待诱导的愈伤组织长出时，选取长势良好的水稻愈伤组织转移到无菌瓶中，加入农杆菌菌液(使菌液完全浸泡愈伤组织)，在28℃，130-150rpm/min摇床上缓慢震荡培养半个小时。

取出愈伤并清除表面的菌液，将愈伤组织移到共培养固体培养基上，22℃黑暗环境培养3～5d。

6.将愈伤组织用灭菌水冲洗干净，再用灭菌的滤纸吸干其表面水分，放入0.5g/L的羧苄青霉素溶液中，用手摇晃30min左右。夹出愈伤组织，用灭菌的滤纸将表面的水分吸干，放置在超净工作台中晾干10min。然后移到固体筛选培养基上(含有50mg/L Rif和0.5g/L羧苄青霉素)，放置到30℃全光照的无菌组培室一个月左右，若使愈伤组织能够继续生长，即表示转基因的侵染步骤已经完成。

7.挑出长势良好的愈伤组织移至分化培养基上，放置到30℃的无菌组培室，培养40d直到愈伤组织分化长出幼苗。

8.在每块愈伤组织中选取一株长势较好的幼苗移至生根培养基中生长，在全光照无菌的组培室中培养20d左右。等到水稻幼苗株高达到25-30cm左右，根系生长良好的时候，即可揭掉组培瓶的封口膜，加入适量的无菌水，炼化幼苗7d天左右。然后将幼苗移至装有土的育苗盆中，待幼苗生长状态良好后将其移至大田中生长。

实施例7

玉米Hsf05基因的转基因水稻筛选

1.组织化学染色：

将不同拟南芥株系的幼苗叶片剪成0.5-1.0cm长度，浸泡于Gus染色液中，于37℃水浴锅中染色12h，用75％的乙醇脱色去除叶绿素，然后进行观察。

2.PCR分子验证：

首先根据CTAB法进提取ZmSWEET4a转基因拟南芥叶片的DNA：以野生型拟南芥DNA作为对照，使用目的基因过表达载体的引物，对转基因拟南芥的植株DNA进行PCR筛选。

实施例8

ZmHsf05基因过水稻渗透胁迫表型分析及生理指标的测定

1.使用水稻营养液种植水稻，三周龄水稻苗用20％浓度的聚乙二醇6000(PEG6000)模拟干旱处理12h，然后用水稻营养液进行恢复培养5d。(图2)

2.生理指标测定

(1)脯氨酸含量测定：

使用脯氨酸含量测定试剂盒，测定了25％PEG6000模拟干旱0h、3h、6h三个时间点转基因水稻三个株系和野生型水稻中Pro的量。(图3)

实施例9

ZmHsf05基因过量表达水稻干旱处理

在营养土中种植水稻，待水稻长到三周龄的时候停止浇水进行干旱处理，干旱7d后出现表型，复水恢复培养3d，拍照记录。(图4)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 一种玉米的热激转录因子ZmHsf05及其应用

<130> 2020

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1080

<212> DNA

<213> 人工序列(玉米热激转录因子ZmHsf05的核苷酸序列)

<400> 1

atgagccacg ggaacgggat gttgaattct gtcaaggtgg agaggtggcc agcagcagtc 60

gctgcaaatg gccagcctag gccgatggat gtgctccacg acggcagctc gccgccgttc 120

cttaccaaga cgtatgacat ggttgatgac ccaaccacga acgccgttgt gtcatggagt 180

gccgccaaca atagctttgt agtttgggat cctcatatct ttgggacggt gctgctgcca 240

aggtacttca agcacaacaa cttctccagc tttgttcggc agctcaatac ttatggcttc 300

agaaaggtgg atcctgacag atgggaattt gctaatgagg agtttctgag aggtcagagg 360

cacctcctca aaaacattag gcgtcggaaa cctccacact catctccaaa tcaacaatct 420

cttggctctt acctcgaggt aggacacttt ggatatgaag aagagattga tcagctgaag 480

agggataaac agctcttgat ggctgaggta gtgaagctga ggcaggagca ccaaaatact 540

agatcagatc tacaggccat ggaagagaaa ttacaagata ccgagcagaa gcagcagcag 600

atgatggcat tcatggcacg cgtcatgcag aaccctgatt tcatgcgtca gctgatctcc 660

cagcgggaga tgaggaagga gctcgaggat gccatctcga agaagagaag gcgccgcatt 720

gaccagggac atgaagctgg tagcatgggc actggttcta gcctggagca agggccacag 780

ggagtgtttg aaccgcagga gccggtggaa tcactcgcca acggtgtgcc atctgatctg 840

gagagttcgt ctgttgaggc gaagggattg gaggttcgac agggtgtttc ttcaggtggt 900

tctgagcatc tgaatggcag gccaagcgga gagttaaatg atgatttctg ggaggacctt 960

ctgcacgagg ggggacttgg tgcagatgca ggcaatgctg ttggtcagga tgatatgaac 1020

atggacatgg acccagatgt tagcctgcct caactgaaac aacatggacc cagacattag 1080

<210> 2

<211> 359

<212> PRT

<213> 人工序列(玉米的热激转录因子ZmHsf05编码的蛋白质的氨基酸序列)

<400> 2

Met Ser His Gly Asn Gly Met Leu Asn Ser Val Lys Val Glu Arg Trp

1 5 10 15

Pro Ala Ala Val Ala Ala Asn Gly Gln Pro Arg Pro Met Asp Val Leu

20 25 30

His Asp Gly Ser Ser Pro Pro Phe Leu Thr Lys Thr Tyr Asp Met Val

35 40 45

Asp Asp Pro Thr Thr Asn Ala Val Val Ser Trp Ser Ala Ala Asn Asn

50 55 60

Ser Phe Val Val Trp Asp Pro His Ile Phe Gly Thr Val Leu Leu Pro

65 70 75 80

Arg Tyr Phe Lys His Asn Asn Phe Ser Ser Phe Val Arg Gln Leu Asn

85 90 95

Thr Tyr Gly Phe Arg Lys Val Asp Pro Asp Arg Trp Glu Phe Ala Asn

100 105 110

Glu Glu Phe Leu Arg Gly Gln Arg His Leu Leu Lys Asn Ile Arg Arg

115 120 125

Arg Lys Pro Pro His Ser Ser Pro Asn Gln Gln Ser Leu Gly Ser Tyr

130 135 140

Leu Glu Val Gly His Phe Gly Tyr Glu Glu Glu Ile Asp Gln Leu Lys

145 150 155 160

Arg Asp Lys Gln Leu Leu Met Ala Glu Val Val Lys Leu Arg Gln Glu

165 170 175

His Gln Asn Thr Arg Ser Asp Leu Gln Ala Met Glu Glu Lys Leu Gln

180 185 190

Asp Thr Glu Gln Lys Gln Gln Gln Met Met Ala Phe Met Ala Arg Val

195 200 205

Met Gln Asn Pro Asp Phe Met Arg Gln Leu Ile Ser Gln Arg Glu Met

210 215 220

Arg Lys Glu Leu Glu Asp Ala Ile Ser Lys Lys Arg Arg Arg Arg Ile

225 230 235 240

Asp Gln Gly His Glu Ala Gly Ser Met Gly Thr Gly Ser Ser Leu Glu

245 250 255

Gln Gly Pro Gln Gly Val Phe Glu Pro Gln Glu Pro Val Glu Ser Leu

260 265 270

Ala Asn Gly Val Pro Ser Asp Leu Glu Ser Ser Ser Val Glu Ala Lys

275 280 285

Gly Leu Glu Val Arg Gln Gly Val Ser Ser Gly Gly Ser Glu His Leu

290 295 300

Asn Gly Arg Pro Ser Gly Glu Leu Asn Asp Asp Phe Trp Glu Asp Leu

305 310 315 320

Leu His Glu Gly Gly Leu Gly Ala Asp Ala Gly Asn Ala Val Gly Gln

325 330 335

Asp Asp Met Asn Met Asp Met Asp Pro Asp Val Ser Leu Pro Gln Leu

340 345 350

Lys Gln His Gly Pro Arg His

355

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(上游引物)

<400> 3

atgagccacg ggaacgggat 20

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(下游引物)

<400> 4

ctaatgtctg ggtccatgtt gtttc 25

Claims

1.一种过量表达玉米的热激转录因子ZmHsf05在a)或b)至少一项中的应用：

b)在植物受到土壤干旱胁迫时，提高植物的存活率。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将ZmHsf05基因或者含有上述ZmHsf05基因的植物表达载体和/或重组菌导入目标植物或植物组织，并使ZmHsf05基因过量表达。

3.一种抗旱作物品种的培育方法，其特征在于：将权利要求1所述的ZmHsf05基因转入出发植株中，获得抗旱作物；或者上调出发植株基因组中ZmHsf05基因的表达量，筛选制得抗旱植物。

4.根据权利要求3所述的抗旱作物品种的培育方法，其特征在于：培育方法采用农杆菌介导法和基因枪轰击法。

5.根据权利要求3所述的抗旱作物品种的培育方法，其特征在于：所述的抗旱植物为水稻。