CN111718935B - 葡萄circSIZ1在调控植物生长发育和盐胁迫抗性中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了葡萄circSIZ1在调控植物生长发育和盐胁迫抗性中的用途，属于生物技术领域。本发明的circSIZ1是来源于SUMO E3连接酶基因的circRNA，circSIZ1全长433bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。circSIZ1在盐胁迫处理后的表达量呈现上升趋势。在烟草中过表达circSIZ1，促进了根系的生长发育，另外转基因植株的抗盐性显著提高。本发明为今后利用基因工程技术提高植物抗逆性提供理论依据，具有很大的应用价值。

Description

葡萄circSIZ1在调控植物生长发育和盐胁迫抗性中的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及葡萄circSIZ1在调控植物生长发育和盐胁迫抗性中的用途。

背景技术

环状RNA(circular RNA，circRNA)指通过反式剪接形成的共价闭合环形RNA分子。高通量测序技术和生物信息学工具的结合揭示了circRNA在多种生物中广泛存在。circRNA具备高稳定性、序列保守性及组织特异性等特征。在过去的五年中，植物中进行circRNA的鉴定报道共涉及逾20个植物物种，包括单子叶植物水稻、玉米、大麦、小麦、高粱、谷子、二穗短柄草、毛竹和灵芝，双子叶植物拟南芥、烟草、辣椒、番茄、白菜、土豆、大豆、花生、猕猴桃、枸橘、梨、葡萄、香橙、沙棘、杨树、棉花和茶。大量报道发现植物circRNA具有时空表达特异性，且在低温、高温、干旱、低氮、铜毒害以及病原体入侵等多种胁迫过程中均存在显著差异表达，暗示其在植物生长发育和胁迫响应过程中发挥重要功能。截止目前，有4项报道通过转基因实验分别证实circRNA影响拟南芥生长发育和番茄果实颜色形成，3项报道通过转基因实验证实circRNA参与植物胁迫抗性反应，包括拟南芥干旱响应、葡萄冷胁迫响应和水稻稻瘟病抗性产生过程。但截止目前，circRNA是否在植物盐胁迫响应中发挥作用仍然缺乏转基因证据支持。

葡萄是我国重要的藤本落叶果树。由于盲目过量施肥和不合理灌溉，葡萄园土壤盐渍化日趋严重。尤其在葡萄设施栽培过程中，由于设施土壤缺少雨水淋洗，导致可溶性盐含量普遍偏高，设施栽培3-5年便会出现次生盐渍化问题。盐渍化土壤造成的葡萄生理障碍问题越来越明显，严重影响葡萄正常生长发育、果实产量和品质，严重时需要刨树。

circRNA作为非编码RNA研究领域的新热点，但目前尚没有关于葡萄circRNA在调控植物生长发育和盐胁迫抗性中的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供葡萄circSIZ1在调控植物生长发育和盐胁迫抗性中的用途，为提高葡萄抗盐性提供了新的方向，对培育抗盐植物品种具有重要意义。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供葡萄circSIZ1在如下(1)-(3)至少一项中的用途：

(1)调控植物抗盐性；

(2)培育抗盐性植物；

(3)调控植物生长发育。

上述用途中，所述葡萄circSIZ1的核苷酸序列为如下a)-c)任一项所述：

a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

b)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列；

c)能与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

上述用途中，所述植物优选为烟草。

本发明的第二方面，提供含有葡萄circSIZ1的表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在如下(1)-(3)至少一项中的用途：

(1)调控植物抗盐性；

(2)培育抗盐性植物；

(3)调控植物生长发育。

本发明的第三方面，提供一种促进植物生长发育和/或提高盐胁迫抗性的方法，包括用如下a)-c)任一项所述的葡萄circSIZ1转化植物并使所述葡萄circSIZ1在所述植物中表达的步骤；

a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

b)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列；

c)能与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

本发明的第四方面，提供一种培育抗盐植物的方法，包括以下步骤：

获取葡萄circSIZ1序列，构建葡萄circSIZ1过表达载体，将所述葡萄circSIZ1过表达载体导入到目标植株中，获得抗盐性提高的葡萄circSIZ1转基因植株。

优选的，所述获取葡萄circSIZ1基因的方法为PCR扩增法，用于验证葡萄circSIZ1全长基因的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

优选的，构建葡萄circSIZ1过表达载体所用的转化载体为pHB。

优选的，所述目标植株为烟草。

本发明的有益效果：

针对目前植物circRNA研究基础薄弱的现状，本发明从葡萄中克隆了一个全新的circRNA，即circSIZ1。通过转基因实验证实circSIZ1参与抗盐性，扩展了我们对植物抗盐性产生的认知，为获得高抗盐性植株提供理论依据，具有很大的应用价值。

附图说明

图1为本发明的葡萄circSIZ1克隆验证结果。

图2为本发明的葡萄circSIZ1基因在不同组织的表达情况。

图3为本发明的葡萄circSIZ1基因在盐胁迫(150mM NaCl)后的表达情况。

图4为本发明的葡萄circSIZ1过表达载体的构建示意图。

图5为转葡萄circSIZ1基因烟草植株的RT-qPCR检测；图中，#1和#2分别表示超表达circSIZ1后的两个转基因烟草株系。

图6为转葡萄circSIZ1基因对烟草的抗盐表型情况；图中，#1和#2别表示超表达circSIZ1后的两个转基因烟草株系。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，胁迫反应是植物研究中的一个重要方向。植物circRNA在非生物、生物胁迫和不同的生长发育阶段均会发生差异表达现象。盐渍化土壤造成的葡萄生理障碍问题越来越明显，严重影响葡萄正常生长发育、果实产量和品质。但是，关于盐胁迫如何影响植物中circRNA的表达模式知之甚少，以及circRNA是否在植物盐胁迫响应中发挥作用仍然缺乏转基因证据支持。

circRNA作为非编码RNA研究领域的新热点，现有研究表明：circRNA存在与来源基因不同的独立功能。目前虽有报道其他作物中SUMO E3连接酶基因SIZ1的功能，但是，其并不能反应circSIZ1的功能，circSIZ1以一种和SIZ1基因完全不同的作用机制发挥功能；而且，circSIZ1物种间保守性比较低，其他物种如桃、猕猴桃、苹果中SIZ1基因并不能产生circSIZ1。

基于此，本发明针对一种来源于葡萄SUMO E3连接酶基因的circRNA展开克隆及功能研究，特别是在生长发育和抗盐中的功能。本发明首次提供了circRNA在植物体内发挥抗盐功能的转基因证据。

本发明从葡萄中克隆了一个全新的circRNA，即circSIZ1。本发明的葡萄circSIZ1相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明核苷酸序列中。

在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析葡萄circSIZ1的表达模式，即分析葡萄circSIZ1的RNA转录物在细胞组织中的存在与否以及数量。用于所述circSIZ1的荧光定量PCR分析的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

基于上述发现的circSIZ1基因，本发明的保护范围还包括与circSIZ1基因同源的DNA片段。

这些与circSIZ1基因同源的DNA片段包括本发明核苷酸序列(SEQ ID NO.1)对应的等位基因、同源基因、突变基因和衍生基因，都属于本发明保护的内容。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的circSIZ1基因的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明circSIZ1基因的核苷酸序列70％或者更高同一性的核苷酸，只要功能与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的功能等价，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。氨基酸或核苷酸序列的等同率可采用BLAST算法测定(Altschul et al.1990.Journal of Molecular Biology 215:403-410；Karlin andAltschul.1993.Proceedings of the National Academy of Sciences 90:5873-5877)。

上述70％或70％以上同一性，可为70％、75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：葡萄circSIZ1的克隆

1.植物材料的获得：

本实验所用的植物材料为欧亚种葡萄‘克瑞森无核’组培苗。实验材料培养于山东农业大学园艺学院人工气候室。培养基质为含30g/L蔗糖和琼脂6g/L的MS培养基。采集葡萄的叶片用于提取RNA。

2.RNA的提取及逆转录：

使用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(TaKaRa)试剂盒提取按照标准说明书操作步骤提取葡萄总RNA。用普通琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1.5％；0.5×TAE电泳缓冲液；100v，20min)检测完整性。电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示rRNA样品的降解。纯度较好的RNA，A₂₆₀/A₂₈₀以及A₂₆₀/A₂₃₀约为2.0左右。用紫外分光光度计测定OD值并计算RNA含量。使用逆转录试剂盒中随机引物逆转录成cDNA(PrimeScript^TMRT Master Mix，宝日医生物技术有限公司)。

3.circSIZ1的克隆验证：

使用Primer Express 3.0.1软件设计一组背靠背的引物：

F1：5′-GACTTAGCATCAAAGGGACAGG-3′(SEQ ID NO.2)；

R1：5′-AGTGGCTCCAGATACCTGCATT-3′(SEQ ID NO.3)。

使用PrimeSTAR Max Premix高保真酶进行PCR反应(40μL反应体系中，20μLPrimeSTAR Master Mix，上、下游引物各1μL，模板1μL，用ddH₂O补齐至40μL)。

反应程序如下：98℃10s，55℃5s，72℃10s，35个循环；72℃延伸10min。通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(CW2302，康为世纪生物科技有限公司)按照标准操作步骤进行纯化。并连接到

Simple CloningVector(北京全式金生物技术有限公司)载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR筛选阳性克隆单菌落，送至生工生物工程股份有限公司进行测序，通过Sanger测序确认circSIZ1反向剪接位点，如图1中箭头所示。最后，克隆得到的葡萄circSIZ1的全长核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

实施例2：葡萄circSIZ1在不同组织及不同盐处理时间点中的表达

1.植物材料的获得：

2020年6月2日于山东农业大学葡萄实验基地采集葡萄根、茎、叶、花、果，将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，回实验室后提取RNA。

‘克瑞森无核’组培苗，培养基为MS基本培养基加吲哚丁酸(终质量浓度为0.2mg/L)，培养温度为(25±1)℃，光照强度为2000-2400lx，光暗周期14h/10h。将继代培养1个月、长势基本一致的葡萄组培苗随机分成处理组和对照组，每组各9株；处理组和对照组均设置3个重复，每个重复3株。处理组将组培苗根系浸泡在150Mm NaCl溶液中，而对照组将盐溶液换为灭菌水，然后分别于不同时间点取样，取样组织为叶片。所有的样品材料液氮速冻后，提取RNA。

2.RNA的提取：

使用植物RNA提取试剂盒(9769S，宝日医生物技术(北京)有限公司)按照标准说明书操作步骤提取葡萄总RNA。用普通琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1.5％；0.5×TAE电泳缓冲液；120v，25min)检测完整性。电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5-2.0倍，符合RNA提取质量要求。纯度较好的RNA，A₂₆₀/A₂₈₀以及A₂₆₀/A₂₃₀约为2.0左右。使用紫外分光光度计测定OD值并计算RNA含量。

3.cDNA的获得：

使用随机引物将1000ng的总RNA反转录为cDNA，相关步骤按照宝生物公司TaKaRaPrimeScript^TM RT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒的操作说明。

4.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析circSIZ1在不同组织和不同盐处理时间点中的表达量。

根据已经获得的葡萄circSIZ1序列，利用引物设计软件设计用于Real-time PCR中葡萄circSIZ1基因定量分析的特异性引物，具体如下：

circSIZ1-F：5′-CGCTAGTATTCCAACTGATGGTTT-3′(SEQ ID NO.4)；

circSIZ1-R：5′-AGTGGCTCCAGATACCTGCATT-3′(SEQ ID NO.5)。

内参基因为U6，其引物为：

U6-F：5′-CCGATAAAATTGGAACGATACAGAG-3′(SEQ ID NO.6)；

U6-R：5′-TCGATTTGTGCGTGTCATCCT-3′(SEQ ID NO.7)。

5.制作circSIZ1及内参基因U6的标准曲线。

用EASY Dilution(RR820Q，宝生物工程(大连)有限公司)将标准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以circSIZ1及内参基因U6的定量引物进行Real-time PCR扩增，分析溶解曲线和标准曲线。通过溶解曲线确定circSIZ1及内参基因U6的溶解曲线为单一峰，以判断使用该引物可以获得单一的扩增产物。通过标准曲线确定样本cDNA的合适稀释倍数。

6.待测样品中circSIZ1的实时荧光定量分析。

以反转录获得的cDNA第一条链为模板，分别用circSIZ1及内参基因U6的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-time PCR反应在实时荧光定量PCR仪(CFX connect RealTime PCR Detection System，Bio-Rad)进行，反应体系为采用20μL体系(10μL SYBRPremix Ex Taq，上下游引物各0.6μM，cDNA模板1μL，其余用水补齐)，设置程序如下：95℃30s；95℃5s，60℃10s，40个循环。

7.采用2^-△△Ct法进行circSIZ1的相对定量分析。

结果表明：circSIZ1在葡萄的根、茎、叶、花、果中都有表达，根系和花组织中的表达量高于叶片、茎和果实三种组织，说明circSIZ1的表达具有明显的空间差异性(图2)。对盐处理后不同时间点circSIZ1的表达情况进行检测，结果显示随着盐处理时间的延长，circSIZ1的表达水平逐渐增加(图3)。

实施例3：葡萄circSIZ1转烟草的功能验证

用转化载体为pHB，构建circSIZ1过表达载体(图4)。构建过程为从DNA中克隆circSIZ1成环区域外加其侧翼内含子上下游各500bp后连接到特定内含子和其反向互补内含子的中间；circSIZ1过表达载体的具体构建方法可参见专利“一种植物circRNA过表达载体及其构建方法”(申请号：CN201910199215.3)。采用叶盘法转化野生型烟草，获得circSIZ1过表达的转基因株系。

首先，吸取5μL含有circSIZ1过表达载体的农杆菌接菌于含有卡那霉素和利福平LB培养液中的三角瓶中，28℃，200rpm摇24h进行活化。之后，吸取100μL活化菌液转至含有卡那霉素和利福平的200ml LB培养液中，28℃，200rpm培养，测OD值，当菌液OD600达到1.0-1.5之间时，5000rpm离心2min收集菌体。用200ml转化液(50g/L蔗糖，2.2g/L MS，0.04％Silwet L-77，pH为5.8)重悬菌体。利用农杆菌介导法侵染烟草(N.benthamiana)将circSIZ1超表达载体转入烟草。通过喷洒Basta筛选转基因株系，并利用TransDirectPlant Tissue PCR Kit试剂盒(北京全式金)按照标准说明书的操作步骤进行验证，获得纯合体株系，用于表型分析。

对获得的株系采用Real-time PCR检测circSIZ1的表达量，用于Real-time PCR中葡萄circSIZ1基因定量分析的特异性引物为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。所用烟草内参基因为actin，引物如下：

Actin-F：5′-GGAAACATAGTGCTCAGTGGTG-3′；(SEQ ID NO.8)

Actin-R：5′-GCTGAGGGAAGCCAAGATAG-3′。(SEQ ID NO.9)

circSIZ1的表达量的检测结果见图5。

对烟草种子进行表面消毒，具体做法是70％酒精浸泡30s，无菌水冲洗2次，2％NaClO浸泡10min，再用无菌水冲洗3次，播散于1.5％蔗糖和0.6％琼脂的1/2MS培养基上，黑暗环境4℃放置3天，转移至组培室培养5天，然后移到分别含有0mM、150mM和200mM NaCl的MS培养基上中进行胁迫试验，12天后拍照，并对烟草进行称重及根系长度测量。结果显示：在正常条件和NaCl处理后，circSIZ1过表达株系根系的长度及整株质量均高于野生型(图6)。这说明在烟草中过量表达circSIZ1可以增强转基因植株的盐胁迫耐受性。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 葡萄circSIZ1在调控植物生长发育和盐胁迫抗性中的用途

<130> 2020

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 433

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttccaggat gtgggcaaag aagaatgctg ttgggaagga agaagtagca aaactagttg 60

aggatactta cagaaaaatg caggtatctg gagccactga cttagcatca aagggacagg 120

ttctctcaga tagcagtaat gtcaaattca aagaagaact tgaggattca tataatgata 180

tgaagattcg ttgtccatgt ggaagcgcac tgccaaatga gacaatgctt aagtgcgacg 240

atctaaaatg ccaggtgtgg cagcatatag gttgtgttat aattccagag aaaactatgg 300

agggtattcc accaactccc gacccattct actgtgaaat ttgtcgacta agtcgagctg 360

accctttttg ggttactgtg gcacatcctt tacttcctgt gaagttgaca acaactagta 420

ttccaactga tgg 433

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacttagcat caaagggaca gg 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agtggctcca gatacctgca tt 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgctagtatt ccaactgatg gttt 24

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agtggctcca gatacctgca tt 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccgataaaat tggaacgata cagag 25

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcgatttgtg cgtgtcatcc t 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggaaacatag tgctcagtgg tg 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gctgagggaa gccaagatag 20

Claims (8)

1.葡萄circSIZ1在如下(1)-(2)至少一项中的用途：

(1)调控植物抗盐性；

(2)培育抗盐性植物；

所述葡萄circSIZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述植物为烟草。

3.含有葡萄circSIZ1的表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在如下(1)-(2)至少一项中的用途：

(1)调控植物抗盐性；

(2)培育抗盐性植物；

葡萄circSIZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种提高盐胁迫抗性的方法，其特征在于，包括用葡萄circSIZ1转化植物并使所述葡萄circSIZ1在所述植物中表达的步骤；

葡萄circSIZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.一种培育抗盐植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取葡萄circSIZ1序列，构建葡萄circSIZ1过表达载体，将所述葡萄circSIZ1过表达载体导入到目标植株中，获得抗盐性提高的葡萄circSIZ1转基因植株；

葡萄circSIZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述获取葡萄circSIZ1基因的方法为PCR扩增法，用于验证葡萄circSIZ1全长基因的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，构建葡萄circSIZ1过表达载体所用的转化载体为pHB。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述目标植株为烟草。

Images