CN104178496A - 植物低磷应答调控单元及表达载体构建技术 - Google Patents

Abstract

本发明描述了一种植物低磷应答调控单元PSS(PHR1-35S-SIZ1)表达载体pX6-PHR1-35S-SIZ1的构建技术。该表达载体的构建方法是，从拟南芥中克隆得到SIZ1基因，将35S启动子插入到SIZ1基因的上游，构建35S-SIZ1表达单元，将该表达单元插入植物表达载体pX6，构建载体pX6-35S-SIZ1，再将PHR1基因插入该载体中，得到表达载体pX6-PHR1-35S-SIZ1。用表达载体pX6-PHR1-35S-SIZ1转化农杆菌GV3101，得到同时含有PHR1基因和SIZ1基因的工程农杆菌菌株NK-314。

Description

植物低磷应答调控单元及表达载体构建技术

技术领域

本发明涉及一种植物低磷应答调控单元及表达载体构建技术，属生物技术领域。

背景技术

磷元素是植物生长发育不可或缺的营养元素之一，它不仅是生物体内ATP、核酸、磷脂分子的组成成分，而且在能量转换和新陈代谢调节等方面发挥着十分关键的作用。但是，磷主要以H₂PO₄ ^-和HPO₄ ^2-可溶的形式被植物吸收，这部分磷元素被称为“有效磷”。在土壤中，虽然磷元素含量较高，但大部分磷元素被Ca²⁺、Fe²⁺、Al³⁺固定或以有机态磷形式存在，无法被植物直接吸收利用，从而造成土壤速效磷匮乏(Smith F W，Mudge S R，Rae A L，etal.Phosphate transport in plants.Plant and Soil，2003，248(1-2)：71-83)。

PHR1是一类保守的MYB类转录因子，可以结合到一些磷饥饿应答基因(如AtIPS1，AtRNS1)的启动子上促进这些基因的表达，在植物低磷适应调节中发挥中心作用。Franco-Zorrilla等研究发现，在拟南芥中，PHR1可以通过与磷转运蛋白Pht1家族基因启动子上的PIBS相互作用，调节其表达，进而调节植物对磷的吸收和转运能力。Schunmann等分析了大麦磷转运蛋白Pht1-1启动子序列，发现其中的PIBS序列发生突变后，低磷胁迫对Pht1-1的诱导作用明显减弱，这表明PHR1在Pht1-1的诱导表达中起着重要的作用。Bari等发现在拟南芥phr1突变体中，miRNA399的表达在低磷环境下受到明显的抑制，揭示了PHR1、miRNA399和PHO2/UBC之间存在着相互关系。综上所述，PHR1可以通过直接或间接的作用调控一些磷转运蛋白和磷饥饿应答基因的表达，以促进植物对磷的吸收利用(Schunmann PH D，Richardson A E，Vickers C E，et al.Promoter analysis of the barley Pht1；1phosphatetransporter gene identifies regions controlling root expression and responsiveness to phosphatedeprivation.Plant Physiology，2004，136(4)：4205-4214；Bari R，Pant B D，Stitt M，et al.PHO2，microRNA399，and PHR1define a phosphate-signaling pathway in plants.Plant Physiology，2006，141(3)：988-999)。

近年来的研究表明，SIZ1对植物的低磷适应也具有重要的调节作用。在磷饥饿的情况下，SIZ1可以使PHR1SUMO化来提高PHR1的活性，更进一步提高植物对磷的利用效率。研究发现，PHR1有两个类泛素化修饰位点，有研究者在体外将T7-PHR1与酵母的ScAos1(E1)、ScUb2(E1)、ScUbc9(E2)、ScSmt(SUMO)和拟南芥的SIZ1(E3)组成的混合物进行反应，然后利用抗T7的抗体检测到PHR1被SUMO化修饰，但类泛素化位点突变的PHR1被检测到无SUMO化修饰，表明PHR1可以直接被SIZI识别和修饰，在植物的磷调控网络中，SIZ1位于PHR1的上游，通过调节PHR1的活性来调节下游与磷饥饿应答有关的基因的表达。Duan等研究证明，在拟南芥siz1突变体中，PHR1的下游基因SPX1、SPX2的表达都明显下降(Duan K，Yi K K，Dang L，et al.Characterization of a sub-family of Arabidopsis geneswith the SPX domain reveals their diverse functions in plant tolerance to phosphorusstarvation.Plant Joumal，2008，54(6)：965-975)。

鉴于SIZ1和PHR1对植物低磷应答的调节作用以及它们之间的相互作用，本发明通过将PHR1基因和SIZ1基因串联构建成一个独立的调控单元插入表达载体中并转化植物，实现其在植物体内的表达，提高植物体内PHR1的含量并通过SIZ1提高PHR1的活性，从而提高植物对磷的利用效率。经文献检索，目前尚未发现将PHR1基因和SIZ1基因作为独立调控单元构建于同一载体转化植物以提高植物磷吸收利用效率的文献和专利报道。

发明内容

本发明的目的是：

1)克隆拟南芥中的SUMO化E3连接酶SIZ1基因。

2)构建含有PHR1基因和SIZ1基因的低磷应答调控单元表达载体。

3)构建一种含有低磷应答调控单元的植物表达载体和携带该载体的农杆菌。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

首先，本发明从拟南芥中克隆得到SUMO化E3连接酶基因SIZ1。

本发明提供的SIZ1基因的编码序列总长2658bp，编码885个氨基酸，其编码的蛋白质结构由三个结构域组成，分别是N端的PINIT结构域，中部含有锌离子的SP-RING结构域和C端的SP-CTD结构域。

SIZ1基因的克隆过程：

根据AtSIZ1基因序列设计上下游引物，提取拟南芥总RNA，运用RT-PCR的方法克隆得到预期片段，插入克隆载体pMD19-T simple vector中构建载体pMD19-T-SIZ1，测序正确。

其次，本发明提供了一个低磷应答调控单元表达载体，该表达载体包含一个SUMO化E3连接酶基因SIZ1和一个保守的MYB类转录因子基因PHR1。

在本发明提供的低磷应答调控单元表达载体中，所述的PHR1基因编码的转录因子PHR1在低磷胁迫调节中发挥着中心调节的作用，可以通过多种途径增强植物对磷的转运和吸收；所述的SIZ1基因编码的蛋白SIZ1能够SUMO化PHR1，提高PHR1的活性。因此，该低磷应答调控单元可以更进一步的提高植物对磷的吸收利用效率。

低磷应答调控单元表达载体构建过程：

运用PCR的方法克隆得到35S启动子并插入克隆载体pMD19-T simple vector中，构建载体pMD19-T-35S，通过酶切将35S启动子插入pMD19-T-SIZ1载体中，构建克隆载体pMD19-T-35S-SIZ1。再将克隆载体pMD19-35S-SIZ1中的35S-SIZ1片段用Spe I单酶切回收后插入植物表达载体pX6中，构建植物表达载体pX6-35S-SIZ1，PCR和酶切鉴定其插入正反向；最后，将植物表达载体pX6-PHR1载体中的PHR1基因用Asc I单酶切回收后插入植物表达载体pX6-35S-SIZ1中，构建植物表达载体pX6-PHR1-35S-SIZ1，PCR和酶切鉴定其插入正反向，构建得到低磷应答调控单元表达载体pX6-PHR1-35S-SIZ1。

第三方面，本发明提供了一种农杆菌工程菌株NK-314，该菌株是用植物低磷应答调控单元表达载体pX6-PHR1-35S-SIZ1转化农杆菌GV3101后获得的工程菌株。

本发明的有益效果：

构建的植物低磷应答调控单元表达载体pX6-PHR1-35S-SIZ1能够在植物体内过表达SIZ1和PHR1，提高植物体内PHR1的含量并通过SIZ1提高PHR1的活性，从而提高植物对磷的利用效率，可以减少磷肥的使用，降低资源的浪费和环境污染，具有很大的应用价值。

附图说明

图1低磷应答调控单元植物表达载体pX6-PHR1-35S-SIZ1的构建流程。

图2SIZ1基因的PCR产物电泳结果。泳道M：1kb DNA ladder；泳道1、2：PCR产物；泳道3：阴性对照。

图335S启动子PCR扩增产物的电泳结果。泳道1、2：PCR扩增产物；泳道M：200bpDNA ladder。

图4载体pMD19-T-35S-SIZ1的鉴定结果。A35S启动子PCR产物电泳结果。泳道M：200bp DNA ladder；泳道1-5：PCR产物；泳道6：阳性对照；泳道7：阴性对照。BSpe I单酶切产物电泳结果。泳道M：1kb DNAladder；泳道1：酶切产物；泳道2：质粒对照。

图5载体pMD19-T-35S-SIZ1中35S启动子插入正反向的鉴定结果。A Nco I和SpeI双酶切电泳结果。泳道M：200bp DNA ladder；泳道1、3：酶切产物；泳道2、4：质粒对照。B35S插入正反向的PCR产物电泳结果(35S上游引物和SIZ1基因下游引物)。泳道M：1kbDNA ladder；泳道1：PCR产物。

图6pX6-35S-SIZ1重组子的鉴定结果。泳道M：200bp DNA ladder；泳道1-6：PCR产物；泳道7：阴性对照；泳道8：阳性对照。

图7pX6-35S-SIZ1中35S-SIZ1片段插入正反向的鉴定结果(Asc I和Nco I双酶切)。泳道M：200bp DNA ladder；泳道1、3、5、7：双酶切产物；泳道2、4、6、8：质粒对照。

图8pX6-PHR1-35S-SIZ1重组子的鉴定结果。A PCR鉴定电泳检测结果。泳道M：1kbDNA ladder；泳道1：阳性对照；泳道2：阴性对照；泳道3-6：PCR产物。B AscI酶切鉴定电泳检测结果。泳道M：1kb DNA ladder；泳道1、3、5、8：酶切产物；泳道2、3、6、7：质粒对照。

图9载体pX6-PHR1-35S-SIZ1中PHR1基因插入正反向的鉴定结果。泳道M：1kb DNAladder；泳道1-4：PCR产物；泳道5：阴性对照。

图10pX6-PHR1-35S-SIZ1转化农杆菌GV3101的PCR鉴定结果。泳道M：1kb DNAladder；泳道1、2：PCR产物。

具体实施方式

实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆手册中所述的条件，或按照具体制造厂商所建议的条件。

实施例1

拟南芥SIZ1基因的克隆。包括如下步骤：

(1)用TRIZOL试剂法提取拟南芥总RNA，反转录得到其cDNA。

(2)以cDNA为模板PCR克隆得到SIZ1基因(图2)，将其克隆到pMD19-T simple vector，构建载体pMD19-T-SIZ1进行测序，测序正确。PCR所用引物是根据拟南芥AtSIZ1基因序列设计的：

P1：5′-GAATTCATGGATTTGGAAGCTAATTGTAAGGAAAAAC-3′

P2：5′-ACTAGTCAAATCTTGTTTAAACTCCGGTGTCT-3′

上游引物P1添加EcoR I酶切位点，下游引物P2添加Spe I酶切位点，均用下划线表示。

实施例2

一种低磷应答调控单元表达植物载体的构建。包括如下步骤：

(1)pMD19-T-35S载体的构建。

将35S启动子(图3)克隆到pMD19-T simple vector中，构建载体pMD19-T-35S。所用的PCR引物是根据35S启动子的DNA序列设计的：

P3：5′-GAATTCACTAGTCCCACAGATGGTTAG-3′

P4：5′-GAATTCCGTGTTCTCTCCAAATGAAAT-3′

上游引物P3添加EcoR I和Spe I酶切位点，下游引物P4添加EcoR I酶切位点，均用下划线表示。

(2)pMD19-T-35S-SIZ1载体的构建。

以pMD19-T-SIZ1为基本载体，将35S启动子从载体pMD19-T-35S中用EcoR I单酶切后回收，插入载体pMD19-T-SIZ1中，进行PCR和酶切鉴定(图4)及其插入正反向的鉴定(图5)，构建载体pMD19-T-35S-SIZ1。

(3)pX6-35S-SIZ1载体的构建。

用Spe I单酶切载体pMD19-T-35S-SIZ1得到35S-SIZ1片段，将35S-SIZ1片段插入植物表达载体pX6中，进行PCR鉴定(图6)及其插入正反向的鉴定(图7)，构建植物表达载体pX6-35S-SIZ1。

(4)pX6-PHR1-35S-SIZ1载体的构建。

用Asc I单酶切得到PHR1基因，将PHR1基因插入植物表达载体pX6-35S-SIZ1中，进行PCR和酶切鉴定(图8)及其插入正反向的鉴定(图9)，构建植物表达载体pX6-PHR1-35S-SIZ1。即为本发明所述的低磷应答调控单元表达载体。

将上述表达载体pX6-PHR1-35S-SIZ1转化农杆菌GV3101，构建同时含有SIZ1基因和PHR1基因的工程菌株NK-314。从工程农杆菌中提取质粒进行PCR鉴定(图10)。

Claims (6)

1.一种羽扇豆中编码转录因子的基因PHR1，其特征在于，能够编码调节植物磷饥饿应答的转录因子，该基因总长1230bp，编码409个氨基酸。

2.一种拟南芥中编码类泛素化(SUMO)E3连接酶的基因SIZ1，其特征在于，能够SUMO化PHR1，提高PHR1的活性，从而更进一步提高PHR1对磷饥饿应答因子的调节作用，该基因总长2658bp，编码885个氨基酸。

3.一种低磷应答调控单元表达载体，其特征在于该表达载体包含SIZ1基因和PHR1基因，具体是指抗生素选择标记删除型植物表达载体pX6-PHR1-35S-SIZ1。

4.一种工程农杆菌菌株，其特征在于，是将植物表达载体pX6-PHR1-35S-SIZ1转化农杆菌GV3101所获得的工程农杆菌菌株NK-314。

5.一种含有植物表达载体pX6-PHR1-35S-SIZ1的工程农杆菌的构建方法，其特征在于，通过PCR扩增和酶切连接的方法获得SIZ1基因和PHR1基因，将其依次克隆到pX6质粒中构建植物表达载体pX6-PHR1-35S-SIZ1，并转化农杆菌GV3101。

6.一种如权利要求4所述工程农杆菌菌株的用途，其特征在于，用其转化不同植物可获得能高效利用土壤中磷元素的转基因植物。