CN116355948A - 大豆E2泛素结合酶GmUBC2编码基因的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了大豆E2泛素结合酶GmUBC2编码基因的应用。大豆E2泛素结合酶GmUBC2蛋白编码基因GmUBC2，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。将构建的植物过量表达载体pMDC83‑GmUBC2转化到大豆毛状根中，用0.005mMHoagland处理28d后发现，在GmUBC2‑OE转基因毛状根中，GmUBC2‑OE转基因毛状根中的根瘤数量和根瘤干重显著提高。GmUBC2‑OE转基因毛状根的根干重和磷含量在正常磷条件下显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及大豆E2泛素结合酶GmUBC2编码基因的应用，属于基因工程领域。
背景技术
磷(P)是植物生长发育中主要的营养元素(López-Arredondo et al.2014)，不仅是许多生物分子如核酸、磷脂和蛋白质的组成成分，同时它也以多种形式参与了植物体内包括光合作用、呼吸作用、能量释放和氧化还原过程等在内的生物合成和代谢过程(Raghothama,1999；Richardson,2009)。土壤80％-90％的磷被微生物吸附，或与金属离子形成难溶性螯合物(Holford 1997)，导致土壤中有效磷浓度远不能满足植物的需求。大豆是主要农作物之一，也是植物蛋白和植物油分的主要来源(Patil G,et al.2017)。大多数的豆科植物都可以与土壤中的固氮细菌形成共生体(Oldroyd et al.2011；Oldroyd2013)。大豆与根瘤菌的共生体系是效率最高的生物固氮形式，这种共生体系的固氮量可达到生物固氮总量的65％(张晓霞等，2010)。大豆的蛋白质和油脂含量都较高，蛋白和油脂合成且生物固氮需要大量的能量，这些生理过程均需要磷元素的参与(Sánchez-Calderón etal.2010)，因此大豆对缺磷极为敏感。
大豆GmUBC2是E2泛素结合酶。在大豆中没有参与磷调控根瘤生长的编码E2基因功能的相关报道。利用基因工程技术，构建了过表达载体，转化大豆毛状根后发现GmUBC2正调控大豆毛状根的根瘤数量和磷含量。这些结果将有助于了解磷对根瘤生长发育的影响。
发明内容
本发明的目的在于公开大豆GmUBC2是E2泛素结合酶的基因工程应用，该基因可作为目的基因导入大豆毛状根中，通过影响大豆毛状根的根瘤数量和磷含量来调控大豆根部的生长。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
大豆E2泛素结合酶基因GmUBC2在调控大豆毛状根干重、毛状根磷含量和/或根瘤生长中的应用，所述的大豆E2泛素结合酶基因GmUBC2，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。
作为本发明的一种优选，大豆E2泛素结合酶基因GmUBC2在低磷胁迫下调控大豆根瘤生长中的应用。
作为本发明的一种优选，大豆毛状根中过表达GmUBC2，在低磷条件下增加过表达毛状根的根瘤数量和根瘤干重。
作为本发明的一种优选，大豆E2泛素结合酶基因GmUBC2在正常供磷条件下增加大豆毛状根干重和毛状根磷含量中的应用。
作为本发明的一种优选，大豆毛状根中过表达GmUBC2，在正常供磷条件下增加大豆毛状根干重和毛状根磷含量。
过表达大豆E2泛素结合酶基因GmUBC2的重组表达载体在在调控大豆毛状根干重、毛状根磷含量和/或根瘤生长中的应用，所述的大豆E2泛素结合酶基因GmUBC2，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。
作为本发明的一种优选，过表达大豆E2泛素结合酶基因GmUBC2的重组表达载体在低磷条件下增加过表达毛状根的根瘤数量和根瘤干重。
作为本发明的一种优选，过表达大豆E2泛素结合酶基因GmUBC2的重组表达载体在正常供磷条件下增加大豆毛状根干重和毛状根磷含量中的应用。
使用GmUBC2构建植物过表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如在植物中加入选择性标记基因(GUS基因、荧光素酶基因等)。从转基因植物的安全性角度考虑，可不加任何选择性标记基因，而通过逆境筛选转化植株。
本发明所述的大豆GmUBC2蛋白编码基因GmUBC2在通过基因工程转化大豆毛状根后，过表达该基因，提高毛状根的根瘤数量和磷含量。
携带有本发明GmUBC2的植物过表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、DNA直接转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是高粱、水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是花生、大豆、油菜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。
有益效果
大豆GmUBC2是一个编码E2泛素结合酶的基因。在大豆中我们发现GmUBC2的表达量与大豆毛状根的根瘤数量和磷含量呈正相关。GmUBC2在低磷胁迫下结瘤高效和结瘤低效材料中表达量存在显著差异。同时通过对GmUBC2基因过表达发现GmUBC2影响大豆毛状根中的根瘤数量和磷含量来影响大豆根部的生长发育。因此，GmUBC2可以用于低磷胁迫下大豆结瘤高效品种选育。
附图说明
图1 GmUBC2基因的PCR扩增。Marker：DL2000
图2低磷胁迫下GmUBC2在六份极端材料根和根瘤中的相对表达量。
(a)GmUBC2在六份极端材料根中受低磷胁迫6小时和28天的相对表达量；(b)GmUBC2在六份极端材料根瘤中受低磷胁迫28天的相对表达量；49，67，78：三份根瘤受低磷胁迫影响大即低效的材料NJAU_C049，NJAU_C067，NJAU_C078；1，2，225：三份根瘤受低磷胁迫影响小即高效的材料NJAU_C001，NJAU_C002，NJAU_C225
图3 GmUBC2的亚细胞定位。
含GFP的质粒P2-GmUBC2转入烟草叶片中，并在激光共聚焦显微镜下观察。
Bars＝20μm.
图4.GmUBC2的毛状根表型和相对表达量。
GmUBC2-OE转基因毛状根的表型及其空载对照CK在蛭石中培养28d，并提供1mmol/L Hoagland营养液(NP)和0.005mmol/L Hoagand营养液(LP)。(b)GmUBC2-OE转基因毛状根和空载毛状根中GmUBC2的相对表达量。(c)GmUBC2-OE和CK转基因毛状根的地上部干重。(d)GmUBC2-OE和CK转基因毛状根的根干重。(e)GmUBC2-OE和CK转基因毛状根的根瘤数。(f)GmUBC2-OE和CK转基因毛状根的根瘤干重。(g)GmUBC2-OE和CK转基因毛状根的地上部磷含量。(h)GmUBC2-OE和CK转基因毛状根的磷含量。OE：具有pMDC83-GmUBC2的大豆毛状根，CK：具有pMDC83空载的大豆毛状根。GmUBC2-OE毛状根及其对照在蛭石中生长28天。三个生物学平均值±标准差(SD)。*，**和***分别在0.05，0.01和0.001概率水平上显著。
图5.过表达毛状根(GmUBC2-OE)PCR检测。M：Marker DL2000，P：阳性质粒，C：阴性毛状根。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。
1)大豆E2泛素结合酶GmUBC2基因的克隆
以大豆栽培品种NJAU_C225为取材对象，取其根，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(Total RNA Kit(天根，北京，中国)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，分光光度计测定RNA含量。以获得的总RNA为模板，按照日本TaKaRa公司提供的反转录试剂盒(TaKaRa Primer ScriptTMRT reagent kit，日本)的说明书进行反转录，得到cDNA第一链后，利用引物F1：atgctgctgatttttggtcctgatg和R1：ttaatctgctgtccaactctgctcc进行PCR扩增，PCR程序如下：95℃预变性3min，95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃保温5min，随后4℃恒温。随后进行PCR产物割胶纯化、连接及转化工作，挑取阳性单克隆测序。测序后获得具有完整编码区的长度为351bp的大豆GmUBC2基因的CDS序列，其中编码区序列见SEQ ID NO.1，由351bp组成(图1)。
2)GmUBC2的亚细胞定位研究
设计包含GmUBC2基因完整ORF的引物(不包含终止密码子)，引物序列为F2：acaaatctat ctctctcgag atgctgctga tttttggtcc和R2：gctcaccatggatccatctgctgtccaactctgctc，具体的PCR过程与步骤1)相同。然后利用Xho I和KpnI双酶切将不包含终止密码子的GmUBC2基因完整的ORF同源重组到表达载体P2中，这样就把GmUBC2基因完整的ORF与表达载体P2上的报告基因GFP的3’端融合，形成一个35S-GmUBC2-GFP的嵌合基因，构建了亚细胞定位载体P2-GmUBC2。将其和空载体分别利用农杆菌转化方法将目的基因GmUBC2转入烟草叶片细胞，结果表明GmUBC2蛋白定位在细胞膜和细胞核上(图3)。
3)低磷胁迫下GmUBC2在六份极端材料根和根瘤中的相对表达量将三份根瘤受低磷胁迫影响大即低效的材料NJAU_C049，NJAU_C067，NJAU_C078及三份根瘤受低磷胁迫影响小即高效的材料NJAU_C001，NJAU_C002，NJAU_C225在蛭石中分别浇灌含有1mmol/LHoagland营养液(NP)和0.005mmol/L Hoagland营养液(LP)，一周一次，处理6h和28d取样，液氮速冻后于-80℃保存。总RNA的提取同步骤1)。以大豆组成型表达的Tubulin作为内部参照，引物序列F-Tubulin：ggagttcacagaggcagag和R-Tubulin：cacttacgcatcacatagca，以来自六份极端材料不同处理条件下的地下部总RNA为模板，反转为cDNA之后进行实时荧光定量PCR反应(Real-time RT-PCR)，引物序列为F3：ctgctgatttttggtcctgatga和R3：tcgtacagtcggtggtttatt，检测GmUBC2基因在不同品种中表达量变化。
当低磷胁迫处理6h和28d时，GmUBC2的相对表达量在两种磷条件下具有显著差异(图2)。在加磷条件下的根中GmUBC2的相对表达量显著高于低磷条件下，而根瘤中则受低磷胁迫诱导相对表达量提高。这表明GmUBC2的表达量与环境中的磷浓度相关。
实施例2基因GmUBC2的基因工程应用
1)大豆E2泛素结合酶GmUBC2的克隆
以大豆(Glycine max)根瘤受低磷胁迫影响小即高效品种NJAU_C225的根总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，引物为：F1：atgctgctgatttttggtcctgatg和R1：ttaatctgct gtccaactctgctcc，PCR程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后4℃恒温，将PCR产物克隆至PUC19-TVector，测序后获得具有完整编码区的长度为351bp的大豆GmUBC2基因的CDS序列，其中编码区序列见SEQ ID NO.1。
2)植物过表达载体的构建
设计包含GmUBC2基因完整ORF的引物，引物序列F4：caggtcgactctagaggatccgccaccatgctgctgatttttggtcctgatg和R5：gggaaattcgagctcggtaccttaatctgctgtccaactctgctcc，具体的PCR过程与步骤1)相同。然后利用Kpn I和BamH I双酶切将GmUBC2基因完整的ORF同源重组到表达载体pMDC83中，得到pMDC83-GmUBC2植物过表达载体，植物转化载体pMDC83含有2x 35S强启动子，可强烈诱导目的基因GmUBC2在受体中表达。然后通过冻融法将载体转入发根农杆菌菌株K599中，同时将空载pMDC83也转化到K599中去，作为空载对照。
3)转基因根毛的获得
利用Kereszt等人(2007)提出的大豆毛状根转化方法，将步骤2)获得的分别含pMDC83-GmUBC2以及相应空载对照的发根农杆菌菌株K599菌液注射到7天大豆幼苗的子叶节下方，置于恒温光照培养箱中，12h光照，12h黑暗培养，并保持高湿度，2-3周后毛状根会从注射部位长出，当有5-10cm时，减掉幼苗主根，并置于蛭石中培养28天，期间分别浇灌含有1mmol/L Hoagland营养液(NP)和0.005mmol/L Hoagland营养液(LP)，一周一次，获得大豆幼苗嵌合体，包括非转基因地上部和转基因毛状根。通过Luyor 3415RG激发光源观察绿色荧光蛋白(GFP)以筛选阳性毛状根。将具有过表达毛状根的嵌合体称之为GmUBC2-OE，其空载对照为CK。为进一步检测是否为阳性毛状根，取部分带有绿色荧光的毛状根利用特异性引物对提取的DNA片段进行PCR检测。过表达毛状根检测引物序列F5：gaggacctcgactctagaacta和R5：gggaaattcgagctcggtaccttaatctgctgtccaactctgctcc，PCR阳性毛状根检测胶图见图5。实时荧光定量qPCR发现在过表达毛状根(GmUBC2-OE)中GmUBC2基因表达量要显著高于CK(图4b)。
在大豆毛状根在蛭石中生长28d后测量GmUBC2-OE转基因毛状根中的地上部干重、根干重、根瘤数、根瘤干重、地上部磷含量和毛状根磷含量。结果表明，与对照相比，GmUBC2-OE转基因毛状根的地上部干重和地上部磷含量在两种磷条件下没有显著差异(图4c，g)；GmUBC2-OE毛状根干重和毛状根磷含量在正常磷条件显著增加，低磷条件下没有显著差异(图4d，h)；GmUBC2-OE毛状根的根瘤数量和根瘤干重在低磷条件下显著提高，正常磷条件下没有显著差异(图4e，f)。这些结果表明GmUBC2在低磷条件下正调控大豆转基因毛状根中的根瘤数量和根瘤干重。
Claims (8)
1.大豆E2泛素结合酶基因GmUBC2在调控大豆毛状根干重、毛状根磷含量和/或根瘤生长中的应用，所述的大豆E2泛素结合酶基因GmUBC2，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求2所述的应用，其特征在于大豆E2泛素结合酶基因GmUBC2在低磷胁迫下调控大豆根瘤生长中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，大豆毛状根中过表达GmUBC2，在低磷条件下增加过表达毛状根的根瘤数量和根瘤干重。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于大豆E2泛素结合酶基因GmUBC2在正常供磷条件下增加大豆毛状根干重和毛状根磷含量中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于大豆毛状根中过表达GmUBC2，在正常供磷条件下增加大豆毛状根干重和毛状根磷含量。
6.过表达大豆E2泛素结合酶基因GmUBC2的重组表达载体在在调控大豆毛状根干重、毛状根磷含量和/或根瘤生长中的应用，所述的大豆E2泛素结合酶基因GmUBC2，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，过表达大豆E2泛素结合酶基因GmUBC2的重组表达载体在低磷条件下增加过表达毛状根的根瘤数量和根瘤干重。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，过表达大豆E2泛素结合酶基因GmUBC2的重组表达载体在正常供磷条件下增加大豆毛状根干重和毛状根磷含量中的应用。
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