CN108866082B

CN108866082B - 大豆STF-3转录因子编码基因GmSTF-3及其应用

Info

Publication number: CN108866082B
Application number: CN201810884967.9A
Authority: CN
Inventors: 程浩; 赵梦; 杨宇明; 王晴; 喻德跃
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-08-06
Filing date: 2018-08-06
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2038-08-06
Also published as: CN108866082A

Abstract

本发明公开了大豆STF‑3转录因子编码基因GmSTF‑3及其应用。大豆STF‑3转录因子编码基因GmSTF‑3，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。将构建的植物过量表达载体pMDC83‑GmSTF‑3在拟南芥的野生型中进行异源表达，发现过表达的植株在正常生长条件下长势增强，生物量增加，表明该基因可以作为目的基因导入植物，通过增强植物长势，增加转基因植物的生物量。可见，本发明所述的大豆STF‑3转录因子编码基因GmSTF‑3可在通过基因工程增强植物长势，进而提高转基因植物的生物量及产量方面应用。

Description

大豆STF-3转录因子编码基因GmSTF-3及其应用

技术领域

本发明涉及大豆STF-3转录因子编码基因GmSTF-3及其应用，属于基因工程领域，具体地讲涉及来源于大豆的STF-3转录因子编码基因在增强植物长势，增强植物长势，进而提高转基因植物的生物量及产量方面应用。

背景技术

转录因子与下游基因启动子中的顺式作用元件直接或间接地特异结合，调控下游基因的表达，进而影响生物的表型。按转录因子与DNA结合的结构分类，主要有：螺旋-转折-螺旋(helix-turn-helix)即MYC结构域、亮氨酸拉链(Leucine zipper)即bZIP结构域、锌指蛋白(Zinc finger)和B带(B ribbon)。其中锌指蛋白是目前发现种类最多、在真核细胞中具有重要调控作用的一类核酸结合蛋白，植物锌指蛋白与植物的生长发育、非生物胁迫有着密切关系。

最早的锌指蛋白是在非洲爪蟾的卵母细胞中发现。近年来，在拟南芥、矮牵牛、棉花、大豆以及水稻等植物中发现了许多锌指蛋白基因。根据其半胱氨酸(C)和组氨酸(H)残基的位置和数目可将锌指蛋白分为C₂H₂，C₂HC，C₂C₂等亚类，其中大部分属于C₂H₂型锌指蛋白。植物C₂H₂型锌指蛋白对植物的生长、发育、器官分化、生物及非生物胁迫起着重要作用，迄今为止，国内外对植物C₂H₂型锌指蛋白的研究主要集中在拟南芥，矮牵牛，水稻等植物中。

大豆是我国重要的粮油经济作物，是医药、食品、工业生产中的重要原材料，在国民经济中占有重要地位。迄今，大豆锌指蛋白功能研究的报道还不多，大豆中功能研究较为明确的是大豆耐冷锌指蛋白基因SCOF-1。在低温胁迫时，SCOF-1被诱导表达后，通过调节下游的耐冷基因的表达，来提高植物对低温胁迫的耐受能力。STF-3转录因子属于C₂H₂锌指蛋白转录因子家族，该转录因子家族主要参与植物各个时期的生长发育，以及胁迫应答的调控过程。

发明内容

本发明的目的在于公开一个大豆STF-3转录因子编码基因GmSTF-3基因工程应用，该基因可作为目的基因导入植物，增加植物的生物量，以进行植物品种改良。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

大豆STF-3转录因子编码基因GmSTF-3，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。

大豆STF-3转录因子蛋白，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。

含有本发明所述的大豆STF-3转录因子编码基因GmSTF-3的重组表达载体。

使用GmSTF-3构建植物表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如在植物中加入选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)。从转基因植物的安全性角度考虑，可不加任何选择性标记基因，而通过逆境筛选转化植株。

大豆STF-3转录因子编码基因GmSTF-3在通过基因工程增强植物长势，进而增强转基因植物耐增加生物量方面的应用。

含有所述的大豆STF-3转录因子编码基因GmSTF-3的重组表达载体在通过基因工程增强植物长势，进而增强转基因植物耐增加生物量方面的应用。

携带有本发明GmSTF-3的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、DNA直接转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是高粱、水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是花生、大豆、油菜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。

有益效果

GmSTF-3基因功能是增强植物长势，是促进植物生长发育的重要转录因子，实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative RT-PCR)分析表明：GmSTF-3在低磷处理12小时的时候相对表达量达到高峰位置(图2)，表明该基因能响应低磷胁迫。构建了携带绿色荧光蛋白GFP的亚细胞定位载体pAN580-GmSTF-3，将其和空载体分别转入拟南芥原生质体，结果表明GmSTF-3转录因子定位于细胞核(图3)。构建了植物过量表达载体pMDC83-GmSTF-3,并将其在拟南芥的野生型中进行异源表达。对筛选出的T₃代阳性苗进行鉴定，发现过表达的植株长势增强，生物量增加，表现为地上部鲜重较野生型对照极显著增加(图4)，表明该基因可以作为目的基因导入植物，通过增强植株长势，增加转基因植物的生物量。

附图说明

图1 GmSTF-3基因的PCR扩增

1、2：银和蜂窝豆73；3、4：春豆112；M：DL2000marker

图2 GmSTF-3基因在持续低磷胁迫下的诱导表达

112+、112-：春豆112分别在磷正常及低磷条件下

73+、73-：银和蜂窝豆73分别在磷正常及低磷条件下

图3 GmSTF-3的亚细胞定位含GFP的质粒pAN580-GmSTF-3转入拟南芥原生质体，并在激光共聚焦显微镜下观察

图4 pMDC83-GmSTF-3植株长势、地上部鲜重与主根长

A:正常生长条件下的野生型拟南芥植株(左)和pMDC83-GmSTF-3植株(右)；B:主根长；C:地上部鲜重

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

1)大豆STF-3转录因子编码基因GmSTF-3的克隆

以大豆品种银和蜂窝豆73(大豆磷敏感种质)和春豆112(大豆耐低磷种质)为材料，根据GmSTF-3基因号Glyma.14g088300通过Phytozome v10.2大豆数据库找到GmSTF-3基因碱基序列，根据数据库提供的序列设计相应的引物，引物序列见SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4。

分别以低磷处理15天的大豆品种银和蜂窝豆73和春豆112为取材对象，取其根，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，Invitrogen，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，分光光度计测定RNA含量。以获得的总RNA为模板，按照美国Promega公司提供的反转录试剂盒的说明书进行反转录，得到cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下PCR程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后12℃恒温。随后进行PCR产物割胶纯化、连接及转化工作，挑取阳性单克隆测序。测序后获得具有完整编码区的长度为702bp的大豆GmSTF-3基因的CDS序列，其中编码区序列见SEQ ID NO.1，命名为GmSTF-3，由702bp组成(图1)。

2)GmSTF-3的亚细胞定位研究

以双酶切法构建GmSTF-3的亚细胞定位载体，首先设计包含GmSTF-3基因完整ORF及两个酶切位点的引物(不包含终止密码子)，引物序列见SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，具体的PCR过程与步骤1)相同。然后将PCR产物割胶纯化，纯化后的PCR产物及pAN580空载质粒一起以选定的两种限制性内切酶酶切，酶切后将两者以T4连接酶在25℃连接2小时，即得到亚细胞定位载体pAN580-GmSTF-3。将其和空载体分别转入拟南芥原生质体，结果表明STF-3转录因子定位于细胞核(图3)。

3)GmSTF-3在持续低磷胁迫诱导下的表达分析

将大豆磷敏感品种(银和蜂窝豆73)和耐低磷品种(春豆112)两种材料幼苗分别在缺磷和含有1mM KH₂PO₄的Hoagland营养液中处理，在胁迫0小时、0.5小时、1小时、3小时、6小时、9小时、12小时、24小时、3天、7天取样，液氮速冻后于-80℃保存。总RNA的提取同步骤1)。以大豆组成型表达的Tubulin作为内部参照，引物序列见SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，以来自大豆磷敏感品种(银和蜂窝豆73)和耐低磷品种(春豆112)两种材料不同处理条件下的根部或叶总RNA为模板，反转为cDNA之后进行实时荧光定量PCR反应(Real-time RT-PCR)，引物序列见SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，检测GmSTF-3基因受低磷胁迫的表达量变化。

GmSTF-3在两个极端品种中的低磷诱导表达模式没有明显的差异性，并且在叶与根中几乎同步达到峰值，在叶中有一个明显的快速上升随后下降的过程，比根中的诱导表达变化更灵敏，说明GmSTF-3能受到低磷诱导上调表达，但与经典的耐低磷转录因子先在根中发生诱导的现象不一致，有可能低磷胁迫诱导只是其能受胁迫诱导中的某一种，承担着耐包括低磷胁迫在内的各种胁迫的功能。

实施例2基因GmSTF-3的基因工程应用

1)大豆STF-3转录因子编码基因GmSTF-3的克隆

以大豆品种银和蜂窝豆73的根总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，引物序列见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，PCR程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后12℃恒温，将PCR产物克隆至pUC19-TVector载体，测序后获得具有完整编码区的长度为702bp的大豆GmSTF-3基因的CDS序列,其中编码区序列见SEQ ID NO.1；

2)植物表达载体的构建

将GmSTF-3基因序列与Invitrogen公司的

Technology with Clonase^TMII试剂盒中的pDONR221载体进行BP反应，并进行菌液PCR测序验证，引物序列见SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12，具体的PCR过程与步骤1)相同，获得入门克隆；将得到的入门克隆与Invitrogen公司开发的目的表达载体pMDC83进行重组交换，得到pMDC83-GmSTF-3植物过量表达表达载体，植物转化载体pMDC83含有2x 35S强启动子，可强烈诱导目的基因GmSTF-3在受体中的表达。然后通过冻融法将载体转入根癌农杆菌菌株EHA105中；

3)转基因植株的获得

将步骤2)获得的含pMDC83-GmSTF-3载体的根癌农杆菌菌株EHA105通过采用浸花侵染法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia-0型生态型，对获得的转基因植株进行PCR，利用目的基因特异性引物对提取的DNA片段进行PCR特异性扩增，引物序列见SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14，检测基因编码框是否插入拟南芥基因组DNA中，具体的PCR过程与步骤1)相同，GmSTF-3实时荧光定量qPCR引物序列见SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，Tubulin实时荧光定量qPCR引物序列见SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，验证后进行植物的表型性状分析：

将筛选得到的转基因株系移栽于装有蛭石的盆中，用1/2MS培养液进行适时浇灌，22℃长日照周期条件下生长。观察并记录T₂及T₃代转基因拟南芥的生长发育过程及其表型性状。T3代拟南芥在固体培养基上生长7天后，选择长势一致的转基因与野生型植株转移至1/2MS培养基上继续生长7天，随后对其长势及各个性状进行测量。结果表明过表达植株比野生型植株形态更大，长势更好(图4)，表现为地上部叶片更大与根系更发达，转基因植株地上部鲜重极显著大于野生型植株，主根长稍长于野生型植株，表明该基因可以作为目的基因导入植物，通过增强植株长势，增加转基因植株的生物量。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 大豆STF-3转录因子编码基因GmSTF-3及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 702

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 1

atggctttgg aaactctcaa ctcaccaaca acaaccgccc catctttccc cttcgacgac 60

ccaactattc catgggccaa aagaaaacgt tcaaagcgtt gttcacgcga ccacccttcg 120

gaggaagagt acctcgctct ctgcctcatc atgctcgctc gcggcggcac cacccgccgc 180

gtcagcactc caccgccgca accgactcca gatccttcca ccaagctcag ttacaaatgc 240

tccgtttgca acaaaagctt cccctcttac caagcgctcg gtggacacaa ggccagtcac 300

cggaaactcg ctgcctccgg cggcgaagac caacccacca ccacctcctc cgccgccagc 360

tccgccaaca ccgcctccgg aggtaggacc cacgagtgct ccatctgcca caagtccttc 420

cccaccggac aggccctcgg cggacacaaa cgttgtcact acgaaggtaa cagtaatgga 480

aataacaaca acagtaacag ctctgtcacc gccgcctcgg aaggcgtggg gtccacccac 540

accgtgagtc acggccacca ccgagacttc gatctcaaca tcccggcttt tccggatttt 600

tcgaccaagg tcggagaaga cgaggttgag agccctcacc ctgtcatgaa gaagcctcgc 660

cccttcgtca ttcccaagat cgaaatccct caatatcaat ga 702

<210> 2

<211> 233

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 2

Met Ala Leu Glu Thr Leu Asn Ser Pro Thr Thr Thr Ala Pro Ser Phe

1 5 10 15

Pro Phe Asp Asp Pro Thr Ile Pro Trp Ala Lys Arg Lys Arg Ser Lys

20 25 30

Arg Cys Ser Arg Asp His Pro Ser Glu Glu Glu Tyr Leu Ala Leu Cys

35 40 45

Leu Ile Met Leu Ala Arg Gly Gly Thr Thr Arg Arg Val Ser Thr Pro

50 55 60

Pro Pro Gln Pro Thr Pro Asp Pro Ser Thr Lys Leu Ser Tyr Lys Cys

65 70 75 80

Ser Val Cys Asn Lys Ser Phe Pro Ser Tyr Gln Ala Leu Gly Gly His

85 90 95

Lys Ala Ser His Arg Lys Leu Ala Ala Ser Gly Gly Glu Asp Gln Pro

100 105 110

Thr Thr Thr Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ala Asn Thr Ala Ser Gly Gly

115 120 125

Arg Thr His Glu Cys Ser Ile Cys His Lys Ser Phe Pro Thr Gly Gln

130 135 140

Ala Leu Gly Gly His Lys Arg Cys His Tyr Glu Gly Asn Ser Asn Gly

145 150 155 160

Asn Asn Asn Asn Ser Asn Ser Ser Val Thr Ala Ala Ser Glu Gly Val

165 170 175

Gly Ser Thr His Thr Val Ser His Gly His His Arg Asp Phe Asp Leu

180 185 190

Asn Ile Pro Ala Phe Pro Asp Phe Ser Thr Lys Val Gly Glu Asp Glu

195 200 205

Val Glu Ser Pro His Pro Val Met Lys Lys Pro Arg Pro Phe Val Ile

210 215 220

Pro Lys Ile Glu Ile Pro Gln Tyr Gln

225 230

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 3

cactccaaac tcaaatcaac cc 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 4

ccggtacgta cggttcaaca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 5

tgtcatgaag aagcctcgcc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 6

ccggtacgta cggttcaaca 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 7

ggagttcaca gaggcagag 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 8

cacttacgca tcacatagca 20

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 9

ctagtctaga atggctttgg aaactctcaa ctcac 35

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 10

acgcggatcc ttgatattga gggatttcg 29

<210> 11

<211> 53

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 11

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc catggctttg gaaactctca act 53

<210> 12

<211> 51

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 12

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cattgatatt gagggatttc g 51

<210> 13

<211> 53

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 13

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc catggctttg gaaactctca act 53

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 14

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cattgatatt gagggatttc g 51

Claims

1.大豆STF-3转录因子编码基因GmSTF-3在增强植物长势，进而增强转基因植物增加生物量方面的应用; 所述的大豆STF-3转录因子编码基因GmSTF-3，其核苷酸序列为：SEQ IDNO. 1。

2.含有大豆STF-3转录因子编码基因GmSTF-3的重组表达载体在增强植物长势，进而增强转基因植物增加生物量方面的应用；所述的大豆STF-3转录因子编码基因GmSTF-3，其核苷酸序列为：SEQ ID NO. 1。